Mdulo 2:

Productos de origen biotecnolgico

 Biotecnologa aplicada a la Industria alimenticia

1. Produccin de alimentos fermentados

Produccin de bebidas alcohlicas (vino, cerveza, bebidas destiladas).

Elaboracin de pan.

Productos lcteos (yogur, leches fermentadas, quesos).

Fermentaciones crnicas.

Productos vegetales fermentados. Saccharomyces cerevisiae

pan, vino, cerveza

Caf, cacao.

Penicillium camemberti
queso Camembert
Penicillium roqueforti Bacterias lcticas
queso Roquefort Yogurt queso - embutidos
2. Produccin de aditivos y adyuvantes

Saborizantes Monoglutamato de sodio.

Extracto de levadura.
 Espesantes Goma xantana, dextrano

 cido ctrico (A. niger melaza) Conserv., antioxidante y para regular pH

en alimentos.
 cido lctico
cidos orgnicos Produccin de PLA (polilctido).
 cido actico
Vinagre.
 cido glutmico (L-glutamato) Potenciador del sabor como glutamato
monosdico
 lisina y metionina.
Aminocidos Complemento en alimentos (aa
 cido asprtico esenciales).
y fenilalanina
Componentes del edulcorante artificial
aspartame.
 Goma xantana.
 Dextranos Espesante, gelificantes
 Polihidroxialcanoatos (bacterias).
Biopolmeros
 Polilctido (PLA) (bacterias) Bioplsticos - Envases

 Riboflavina o Vitam. B2 vitaminas Aditivos

 Vitam. B12 o cobalamina
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3. Produccin de enzimas microbianas

 Amilasas, xilanasas, glucosa isomerasa: usos en panadera, fabricacin de jarabes de glucosa

y fructuosa de maz.

 Proteasas (Ej. quimosina), lipasas: usos en la elaboracin de quesos.

 Pectinasas: jugos, vino, etc

4. Produccin de clulas microbianas como productos (biomasa)

Produccin de levadura para panadera.

Produccin de clulas microbianas para ser usada en la alimentacin humana o animal (Single
cell protein protena de origen unicelular -SCP.

(ricos en vitaminas, protenas, aminocidos, minerales)

5. Procesos de transformacin de materias primas con enzimas

Ej. obtencin de jarabe de alta fructosa a partir de almidn con enzimas

inmovilizadas.
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Ctedras de Biotecnologa

ENZIMAS

Dra Mara Alicia Martos

 Ventajas:

Reemplazan a procesos fsicos o qumicos los cuales son ms

contaminantes, corrosivos, requieren ms energa.

Enzimas: elevada especificidad, condiciones suaves de T y pH, a

bajas concentraciones.

Bacillus sp
Limitaciones:
La mayor limitacin en la aplicacin de
un biocatalizador es su inestabilidad.
Otros son el coste y la disponibilidad.

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 Enzimas Microbianas y sus aplicaciones

Enzima Fuente Aplicacin industrial Industria

Invertasa Levadura Relleno de caramelos Confitera

Glucosa Oxidasa Hongos Eliminacin de glucosa y Alimentaria
oxgeno, Farmacutica
papeles para pruebas de la
diabetes
Glucosa Isomerasa Bacterias Jarabe de cereales rico en Bebidas refrescantes
glucosa
Pectinasa Hongos Prensado, clarificacin del Zumos de frutas
vino
Renina Hongos Coagulacin de la leche Quesera
Celulasa Bacterias Suavizante y abrillantador de Lavandera
tejidos; detergente
Lipasa Hongos Degradar la grasa Lechera, lavandera
Lactasa Hongos Degradar la lactosa a glucosa y Lechera,
Lechera, alimentos
galactosa
DNA polimerasa Bacterias; Replicacin del DNA por PCR Investigacin
Archea biolgica y forense.
Fuente de enzimas

Enzimas de
origen animal Tripsina Pepsina - Quimiosina o renina

Enzimas de origen Papana (mamn) bromelna (anan)

vegetal - Amilasas de cereales (malta)

Ventajas: no presentan toxicidad facilidad para su extraccin.

Pero limitantes y caras (animal) - dependen del clima, estacin (vegetal)

- oscilaciones en rendimiento.
Enzimas de origen microbiano

Principal fuente de enzimas

Ventajas

 Produccin a gran escala mediante un proceso fermentativo

(reproducible y barato) (Ej: fermentador de 1000lt se puede
producir hasta 20 kg de enzima de Bacillus coagulas en 2 h).

 Facilidad de extraccin (principalmente las exo enzimas).

 Ausencia de variaciones estacionales.

Caractersticas de la cepa:

 Producir altas cantidades de enzima en menor tiempo.

Enzimas pueden ser extracelulares.
La enzima debe satisfacer
 Microorganismo debe poseer el status GRAS. las estrictas exigencias
legislativas especialmente
 Crecer en un medio con nutrientes econmicos. en el caso de enzimas de
uso alimentario.

Levaduras Hongos
Bacterias

Aspergillus niger, A. oryzae

Bacillus subtilis, B.
Licheniformis) Saccharomyces A. Awamori
cerevisiae
Produccin de enzimas microbianos

Slido Lquido

pH
Temperatura
Factores que influyen Tiempo
en la produccin Composicin del medio de cultivo.
Fuente de carbono
Volmen del inculo.
Otros.
Localizacin celular

EXOENZIMAS
Se separan clulas

Se concentran y purifican lquidos

ENDOENZIMAS
Destruir paredes celulares

Seleccionar el mtodo menos destructivo. Para reducir la

contaminacin con otros componentes celulares, simplificando
la posterior purificacin (menores costos).

La extraccin se debe realizar lo ms rpido posible y a bajas temperaturas.

 Enzimas
intracelulares de
microorganismos

Lisis celular

Una gran cantidad de enzimas son intracelulares y para obtener se

precisa la desintegracin de la clula para liberar su contenido al
medio.

Mecnicos
Mtodos
No mecnicos
Mtodos mecnicos:

Agitacin o trituracin de la suspensin celular con

abrasivos, en un mortero (perlas de vidrio, arena,
etc.), a nivel laboratorio.

Trituracin en un molino de bolas, molino

helicoidal, etc.

A mayor escala se usa molino de bolas (DYNOMILL):

consiste en un cmara con un eje longitudinal que
contiene varios discos fijos y rotatorios , hay
pequeas bolas dentro del cilindro. Cmara esta
refrigerada.
Mtodos no mecnicos

Otros mtodos:

Detergentes (lauril sulfato sdico, tritn, tween).

Choque osmtico (Se suspenden las clulas en una solucin tampon
con sacarosa al 20 %, luego las clulas se recogen y resuspenden
rpidamente en agua a 4 C).
Disolucin lipdica (tolueno al 10 %).
Digestin enzimtica: con enzimas que atacan la pared celular ej.
lisozima (ataca la capa de peptidoglucano de la pared celular.
Purificacin:
1. Separacin de slidos

La eliminacin de restos celulares despus de la ruptura, se realiza

por:

 Centrifugacin .

 Filtracin (filtros de placas o tambor rotatorio operado

con vaco en el interior del tambor).

Sobrenadante

separacin de los restos celulares

2. Purificacin preliminar

 Las enzimas se encuentran en el interior de clulas que poseen

cientos de otras enzimas y otros compuestos como cidos nucleicos,
polisacridos o lpidos.

 Se hace indispensable entonces un proceso de purificacin.

Precipitacin

Precipitacin mediante sales: con sulfato amnico, sulfato sdico, etc.

Precipitacin con disolventes orgnicos poco polares:

Ej: metanol, etanol, isopropanol y acetona (ej. isopropanol para precipitar
la amiloglucosidasa).

Precipitacin por cambio en el pH del medio:

La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico (carga
neta es cero) y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica.
Enzima semipura, se separa por filtracin o centrifugacin

Purificacin final Cromatografa

Cromatografa de Cromatografa de
Exclusin molecular Cromatografa de
Intercambio inico
afinidad

Separa molculas de Utilizan resinas sintticas

protenas de acuerdo a (celulosa) al que se unen Separa las protenas en
sus pesos moleculares inicamente cationes o funcin de su
(polmeros porosos). aniones. especificidad de fijacin
de ligandos.
Concentracin

Evaporacin a presin reducida

Debido a que se opera al vaco, existe el peligro de la formacin

de espuma que puede producir la desnaturalizacin de la
protena.

Liofilizacin

La solucin de enzima se congela a -80C y liofiliza.

Obtenindose un rpido secado de los solutos, quedando un
polvo soluble.
El enzima deber purificarse lo mnimo necesario.

Aunque a veces es necesario realizar altos niveles de purificacin.

Enzima comercial:
Puede contener 10 % de protena y slo 1 o 2 % de enzima
activo. Formado por mezcla de enzimas.

Enzima de elevada pureza:

Enzimas a ser utilizada con fines analticos (glucosaoxidasa),

Endonucleasas usadas en manipulacin gentica,

Enzimas para diagnstico clnico.

Enzimas proteolticas que se inyectan en animales para ablandar la
carne, etc.

Se pueden usar clulas enteras para catalizar ciertas reacciones.

 USOS ENZIMAS

LIBRE INMOVILIZADA
BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
 BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS

Aumento de la estabilidad de la enzima o clula

inmovilizada.

Aumento de la productividad enzimtica.
VENTAJAS
Aumento de la facilidad de recuperacin y
purificacin de los productos.

Posibilidad de disear un reactor enzimtico en
continuo.

Prdida de la actividad enzimtica

DESVENTAJAS durante la inmobilizacin.

Aumentan los problemas difusionales.

Se aumenta el costo del proceso.
 Mtodos de inmovilizacin

Enlaces covalentes
RETENCION A. UNION A UN SOPORTE

Enlaces no covalentes
QUIMICA
B. RETICULADO O CROSS LINKING

En Enz
E
z
nz
E
En Enz nz
z E
nz
E
En Enz nz
z

Adsorcion /inica Covalente Cross linking

E E

RETENCION FISICA E E E

E
A. ATRAPAMIENTO EN MATRICES
Atrapamiento en gel
 RETENCION QUIMICA

Se basa en unir la enzima al soporte mediante enlaces covalentes,

fuerzas de Van der Waals, Interacciones inicas, enlaces de hidrgeno.
Se produce una fuerte unin enzima-soporte (covalentes).

Grupos funcionales de la protena susceptibles de ser empleados

 RETICULADO O CROSS LINKING

Consiste en la formacin de enlaces covalentes entre las molculas

de la enzima mediante reactivos bi o multifuncionales.

+NH N
3

E
O O
+NH +NH N N
3 3

H H

+NH
3
N
N
E
+NH
3
+NH
3 N

El agente entrecruzante ms comnmente utilizado es el glutaraldehdo

 ATRAPAMIENTO EN GELES

En este mtodo las enzimas o clulas quedan atrapadas en geles

polimricos, insolubles en agua.

Es el mtodo de inmovilizacin ms usado debido a su flexibilidad

y simplicidad y a las pocas agresivas condiciones de reaccin.

Los polmeros utilizados: agar, agarosa, alginato, carragenato.

E E

E E E

Atrapamiento en gel
 Geles de alginato de calcio

GELES DE La fuente principal del alginato comercial es el

ALGINATO
alga gigante Macrocystis pyrifera.

Algas pardas, fuente de alginato

Los alginatos son las sales del cido algnico, polisacrido lineal
constituido por dos unidades monomricas, el cido D-manurnico
(M) y el cido L-gulurnico (G).

cido L-gulurnico: G cido D-manurnico: M

Como se forman los geles de alginato de calcio?:

Modelo de la caja de huevo ("egg-box"-model)

Cuando dos cadenas de bloques G se alinean lado a

ALGINATO lado se forma un espacio hueco , en el cual se puede
acomodar un in calcio, formndose una estructura
dimrica.
Gelificacion ionotrpica:

En la figura se puede ver la formacin de la caja de huevo y la ubicacin de los

iones polivalentes que sirven de enlace de dos molculas de polmero
La enzima queda contenida fsicamente dentro de la membrana y las
molculas de sustrato y producto deben difundir a travs de ella.

Se forman microesferas porosas con la enzima

retenida en su interior.

Deben ser de tamao adecuado para ser

permeables al sustrato y productos.

Por ser un mtodo fsico no produce alteracin de la

estructura de la enzima o viabilidad de la clula.
Reactores de lecho empaquetado para enzimas inmovilizadas

Pequeo tamao Desventajas:

Ventajas Elevada productividad Formacin de canales o
Facilidad para la tamponamiento que alteran el flujo
automatizacin a travs del lecho.

El sustrato pasa a travs del lecho de enzima inmovilizado (desde la

cabeza o la base del lecho) y el producto se obtiene a la salida.

Lecho
compacto
El grado de conversin se controla regulando el tiempo de
permanencia en el reactor (regulando la velocidad de flujo del sustrato
y las dimensiones del reactor).
 TRABAJO PRACTICO

El objetivo de este trabajo prctico es

OBJETIVO
inmovilizar clulas de Saccharomyces
cereviseae con actividad invertasa en geles de
alginato de calcio, a los efectos de estudiar la
hidrlisis de sacarosa

Saccharomyces cereviseae
 Invertasa En S. cerevisiae la enzima es
periplasmtica.

Las preparaciones comerciales se obtienen de levaduras como S. cerevisiae

y S. carlsbergensis.

Sacarosa

Sacarosa D-glucosa + D- fructuosa Azcar invertido

invertasa
(-D-fructosidasa)
 Sn de alginato de
sodio con levaduras

PROCESO DE INMOVILIZACION
DE CELULAS EN ALGINATO Cl2Ca

Agitador

Glutaraldhedo
CELULAS + SN de ALGINATO DE SODIO

Incubar a T ambiente por 20 min.

Gotear en sn de CaCl2 (gelificacin
ionotrpica,, por intercambio de iones)

Filtracin y lavado
Obtencin de perlitas esfricas
con las clulas atrapadas

Buffer actico pH 5
 Llenado de columna REACTOR DE FLUJO PISTON
(reactor flujo pistn).
T= 37 C

Circulacin de la sn.
de sacarosa a travs
del bioreactor.
Bomba
peristltic
a
Obtencin del Sn de sacarosa
Productos:
glucosa+ fructosa
producto. al 1%

Determinacin de glucosa
por mtodo glicemia
enzimtica.
Influencia del caudal de alimentacin sobre el porcentaje de conversin
invertasa
SACAROSA D-glucosa + D- fructuosa

342 g 180 g glucosa 100 %

5g x = 2,6 g/l gluc. conv.

 F1 (bajo): 100 % conv. sac. en gluc y

fructosa.
 F2: 100 % conv.
 F3: idem
 F5 (alto): no puede convertir toda la sac.
en gluc. y se obtiene < 100 % conv.

Graficar % conversin de
Productividad (g/h): [glucosa] (g/l) * F (l/h) sacarosa en funcin de F
Aplicaciones Industriales

 Beta galactosidasa o lactasa, hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa.

 Beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae adsorbida y entrecruzada sobre

una resina en reactor en columna, o inmovilizada covalentemente sobre
slice porosa.

 Enzima de Kluyveromyces lactis atrapada en fibras de triacetato de

celulosa.

Glucosa isomerasa: Produce la isomerizacin de glucosa a fructosa.

Enzima intracelular. Producida industrialmente por B. coagulans (Ind.
Novo).
BIBLIOGRAFIA

Arroyo, M. Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications. Ars

Pharmaceutica, 39:2; 23-39, 1998.

Lewkowicz, E. Inmvilizacin de enzimas y clulas y su aplicacin a la biocatlisis. Curso de

postgrado. Universidad Nacional de Quilmas. Junio 2004

Blanco R. Biocatalizadores inmovilizados de inters en biotransformaciones en el mbito

de tecnologa de alimentos. Instituto de Catlisis CSIC. Biojournal.net. N1, Febrero 2005.

Wiseman, A. Manual de Biotecnologa de los enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza (Espaa),

1991.

Lee B.H. Fundamentos de Biotecnologa de los Alimentos. Editorial Acribia, Zaragoza

(Espaa), 2000.