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ISSN: 1021-7444
pccmca@cariari.ucr.ac.cr
Universidad de Costa Rica
Costa Rica
Azofeifa-Delgado, lvaro
Uso de marcadores moleculares en plantas; aplicaciones en frutales del trpico
Agronoma Mesoamericana, vol. 17, nm. 2, julio-diciembre, 2006, pp. 221-241
Universidad de Costa Rica
Alajuela, Costa Rica
REVISIN BIBLIOGRFICA
lvaro Azofeifa-Delgado2
RESUMEN ABSTRACT
Uso de marcadores moleculares en plantas; aplica- Use of molecular markers in plants; application on
ciones en frutales del trpico. En el presente trabajo se rea- tropical fruit trees. In the present work, a literature review
liz una revisin bibliogrfica sobre el uso de marcadores was conducted on the use of molecular markers in plants,
moleculares en plantas, con nfasis en el uso de los mismos with emphasis on their use in tropical fruit species. Aspects
related to the use and importance, as well as to the
en especies frutales del trpico. Comprende aspectos relati-
advantages, disadvantages and characteristics of different
vos al uso e importancia, ventajas, desventajas y caractersti-
markers are included. Moreover, the historical development
cas, evolucin de las principales metodologas de marcaje a
of the main methodologies along time and an explanation of
travs del tiempo y una explicacin de las tcnicas de uso ms the techniques most frequently used are also considered.
frecuente. Por ltimo, se presenta una lista de las publicacio- Finally, a list of the most relevant publications until year
nes ms relevantes hasta el ao 2005. En sta se indican los 2005 is included. This comprises information about authors,
autores, la especie estudiada, el objetivo del trabajo, la tcni- genotypes, the objective of the work, the techniques used,
ca empleada as como los principales resultados obtenidos. and the main results obtained.
Palabras clave: Marcadores moleculares, frutales tro- Key words: Molecular markers, tropical fruits, DNA,
picales, ADN, anlisis genticos, variacin gentica. genetic analysis, genetic variation.
Estos marcadores moleculares son fenotpicamen- simples repetidas (SSR), Amplificacin aleatoria del
te neutros, presentan mayor segregacin o polimorfis- polimorfismo de microsatlites (RAMPO) etc. (Rallo
mo que los morfolgicos, pueden ser evaluados desde et al. 2002).
los primeros estados de desarrollo de las plntulas, son
aplicables a cualquier tipo de material vegetal, son in-
dependientes de la poca del ao en que se realiza el TIPOS DE MARCADORES
anlisis, permiten la identificacin correcta de la varie-
dad sin necesidad de muchos caracteres y estn libres Isoenzimas
de los efectos epistticos (Tanksley 1983; Powell
1992; Phillips et al. 1995; Rallo et al. 2002). Las isoenzimas, o aloenzimas, son las protenas
ms ampliamente usadas como marcadores molecula-
Dentro de los marcadores moleculares se mencio- res y stas fueron los primeros marcadores molecula-
na la existencia de dos tipos: las protenas (principal- res usados en gentica de plantas (Tanksley et al.
mente las isoenzimas) y los marcadores de ADN. 1981). Las isoenzimas son variantes de una misma en-
zima (son formas funcionalmente similares de enzi-
mas), que comparten un sustrato en comn pero difie-
DEFINICIN ren en su movilidad electrofortica. Incluyen todos los
polmeros de subunidades producidos por diferentes
Los marcadores moleculares han sido definidos loci o por alelos diferentes en el mismo locus. Diferen-
como cualquier diferencia notpica controlada genti- tes individuos en una misma poblacin pueden tener
camente. Se puede considerar que cualquier molcula, diferentes formas moleculares de la misma protena.
orgnica o inorgnica, que sea caracterstica de un or- Esa variabilidad en cuanto a la estructura de las prote-
ganismo o proceso sea un marcador. Los marcadores nas es producida por factores genticos o epigenticos.
idneos son los de ADN, siendo vlido cualquier frag-
mento que se encuentre muy cerca del gen o de la se- Su anlisis se realiza extrayendo la enzima de los
cuencia de inters y que lgicamente no afecte al ca- tejidos de la planta, tras lo cual, las variantes son se-
rcter en estudio (SIDTA 1999). Para Valadez y Kahl paradas con electroforesis y visualizadas mediante la
(2000) un marcador se refiere a cualquier molcula de tincin del gel con colorantes especficos (Powell
protena, ARN o ADN de tamao o peso molecular co- 1992; Haines 1994). Entre las variantes enzimticas
nocido que sirve para monitorear o calibrar la separa- frecuentemente empleadas se mencionan; malato des-
cin de las mismas utilizando electroforesis o croma- hidrogenasa, fosfoglucomatasa, glutamato oxaloaceta-
tografa, y un marcador gentico como cualquier gen to transmitasa, shikimato deshidrogenasa y peroxida-
cuya expresin permite un efecto fenotpico que pue- sas (Jarret y Litz 1986). No obstante, Tanksley (1993)
de ser detectado fcilmente (por ejemplo, un gen que menciona que el uso de las isoenzimas ha estado muy
ocasiona resistencia para algn antibitico). limitado por el escaso nmero de colorantes enzimti-
cos disponibles y por la imposibilidad de contar con
Los marcadores del ADN se basan fundamental- suficientes marcadores para cubrir todo un genoma.
mente en el anlisis de las diferencias en pequeas se-
cuencias del ADN entre individuos. Las tcnicas em- Forrest (1994) menciona que las isoenzimas han
pleadas para ello son muy diversas y dan el nombre a los probado ser de gran valor en estudios de mejoramien-
distintos tipos de marcadores, los cuales pueden ser de to tanto en poblaciones naturales como en plantacio-
carcter dominante o codominante (Karp y Edwards nes de rboles y mantienen cierto valor de utilidad, es-
1998). pecialmente en estudios a gran escala de estructura
poblacional y en relacin con la resistencia a plagas y
Algunos ejemplos de ellos son: Polimorfismo de enfermedades. Por ejemplo, Gonzlez-Prez et al.
la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP), (2004) realizaron un estudio sobre la estructura pobla-
Amplificacin aleatoria del ADN polimrfico cional de las palmeras Phoenix canariensis y P. dacty-
(RAPD), Polimorfismo en la longitud de los fragmen- lifera en Islas Canarias, Espaa. Tambin, Jarret y Litz
tos amplificados (AFLP), Microsatlites o Secuencias (1986) utilizaron los sistemas isoenzimticos como
marcadores para discriminar entre varios clones de ba- ejemplo, nmero variable de repeticiones en serie). El
nanos y pltanos. concepto principal fue que la mutacin en el sitio de
restriccin, o la mutacin que altera la distancia entre
los sitios adyacentes de restriccin podra ser visuali-
Marcadores de ADN zada como Marcadores de ADN.
Otro grupo de marcadores son los marcadores de Para realizar el anlisis se necesitan las enzimas
ADN. Segn Karp et al. (1997) dentro de este grupo de restriccin. Paterson (1996) menciona que stas
se incluyen tres categoras bsicas. Categora 1: mto- actan como tijeras moleculares altamente especfi-
dos que no se basan en la reaccin en cadena de la po- cas. Estas enzimas reconocen y cortan el ADN en
limerasa (PCR). Por ejemplo, RFLP y nmero variable sitios especficos. La alta especificidad para reconocer
de repeticiones en tandem (VNTRs). Categora 2: tc- secuencias es la base para la mayora de estrategias de
nicas que utilizan iniciadores (primer) arbitrarios o clonaje del ADN. La gran mayora de las enzimas de
semiarbitrarios. Por ejemplo, iniciadores PCR mlti- restriccin utilizadas en el clonaje molecular recono-
ples arbitrarios (MAAP), RAPD, RAMPO. Categora cen secuencias de cuatro, cinco seis nucletidos de
3: PCR con sitio objetivo especfico. Por ejemplo, longitud.
SSR, Inter secuencias simples repetidas (ISSR). Las
categoras 2 y 3 son marcadores basados en la PCR. Despus de la publicacin de Botstein et al. en
1980 los RFLPs han sido ampliamente usados en plan-
Segn se observ en la revisin bibliogrfica, los tas con diferentes objetivos: caracterizacin de germo-
investigadores han utilizado mayoritariamente unos plasma, estudios filogenticos, pureza de semillas h-
pocos tipos de marcadores para los estudios desarro- bridas, seleccin y/o localizacin de genes especficos
llados en especies frutales del trpico. A continuacin (mediante anlisis de ligamiento) de caractersticas
se presentan una breve referencia de cada uno, as co- agronmicas importantes, etc. (Phillips et al. 1995;
mo ejemplos de los mismos. Valadez y Kahl 2000).
sonda, de pequeos grupos de nucletidos (aproxima- uno o dos oligonucletidos sintticos (iniciadores),
damente 10) con una exonucleasa. Mediante la accin generalmente de entre 10 a 30 pares de bases de lon-
de la enzima ADN polimerasa I, la cadena se resinte- gitud y complementarios a la secuencia nucleotdica
tiza a travs de la reincorporacin de nucletidos mar- de los extremos del ADN blanco y diseados para hi-
cados radioactivamente o por medio de otras tcnicas. bridar en direccin contraria. El mtodo implica la eje-
8. La deteccin de las bandas de hibridacin se realiza cucin de una serie repetitiva de ciclos (conocidos co-
por luminiscencia (Phillips et al. 1995). mo ciclos trmicos), cada uno de los cuales involucra
la desnaturalizacin del ADN, la unin del iniciador a
Uno de los pasos del anlisis RFLP incluye un la cadena desnaturalizada y la sntesis, a partir del ini-
procedimiento de electroforesis. En general, la elec- ciador, de una doble cadena mediante la accin de la
troforesis es una tcnica comnmente empleada para polimerasa. Lo anterior resulta en una acumulacin
la separacin, identificacin y purificacin de molcu- exponencial de un fragmento especfico de ADN (Er-
las de cidos nuclicos. Se basa en el hecho de que las lich 1989; Valadez y Kahl 2000).
molculas de los cidos nucleicos estn cargadas ne-
gativamente y migran hacia el nodo en un campo Mayores detalles sobre esta tcnica se pueden en-
elctrico. La electroforesis del ADN usualmente se contrar en Valadez y Kahl (2000).
realiza en una matriz de agarosa o poliacrilamida, in-
mersa en un buffer salino que permita el estableci- El anlisis PCR, desde su invencin, por Saiki et
miento de un campo elctrico (Paterson 1996). al. (1985), ha sufrido modificaciones y en algunos ca-
sos ha generado incluso nuevas tcnicas (Phillips et al.
Segn Paterson (1996) el costo, la complejidad tc- 1995). Rallo et al. (2002) mencionan que la gran ma-
nica y la gran cantidad de ADN que se requiere pueden yora de los marcadores moleculares del ADN, de uso
ser limitantes para el empleo de los RFLP como tcni- actual, se basan en la tcnica del PCR.
ca de diagnstico. Bernatzky (1988) menciona como
otra limitante, que en algunos casos, aunque la varia- La tcnica PCR ha suministrado un conjunto de
cin interespecfica es alta, los individuos de una pobla- marcadores como por ejemplo; los RAPDs, SSR,
cin o los cultivares de una especie muestran una varia- AFLPs, regiones amplificadas de secuencias caracteri-
cin baja, lo cual reduce las posibilidades de encontrar zadas (SCARs), amplificacin selectiva de loci poli-
polimorfismos tiles. Aunque esto puede ser soluciona- mrficos (SAMPLs), amplificacin azarosa de las hue-
do usando enzimas que corten el ADN ms frecuente- llas del ADN ADN Fingerprinting (RAF) y
mente, o simplemente, evaluando una mayor variedad amplificacin directa con ADN microsatlites (DAMD)
de enzimas. (SIDTA 1999; Ramage et al. 2004; Saxena et al. 2005).
Para Paterson (1996), las limitaciones de los mar- La ADN polimerasa ADN dependiente es una en-
cadores RFLP mencionadas condujeron a la imple- zima que, en unas condiciones determinadas y en pre-
mentacin de nuevas tcnicas moleculares. Este mis- sencia de una pequea cadena de ADN, que acta co-
mo autor menciona, que en el caso de las plantas, para mo cebador, es capaz de producir millones de copias
cierto tipo de anlisis, los RFLP continan teniendo de determinados fragmentos del ADN. Estos fragmen-
relativa importancia como tcnica molecular. tos se separan posteriormente por peso molecular y
conformacin mediante tcnicas electroforticas, ob-
tenindose un patrn de bandas especfico que nos
II- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) permite diferenciar individuos (Rallo et al. 2002).
Williams et al. (1990) y Welsh y McClelland (1990). determinado, fijado en este caso, por el iniciador (Phi-
Phillips et al. (1995) mencionan que en esencia es la llips et al. 1995).
misma metodologa PCR, por lo que a veces se le re-
fiere con este nombre. Durante el anlisis RAPD se dan una serie de reac-
ciones qumicas en forma cclica de manera similar a lo
La modificacin que les dio origen consisti en que ocurre en una reaccin PCR pero contemplando la
sustituir en la tecnologa PCR, el uso de un par de ini- modificacin mencionada anteriormente.
ciadores cuidadosamente diseados y un poco largos,
por un solo iniciador corto, de alrededor de 10 nucle- La eficiencia de los marcadores RAPDs puede es-
tidos de longitud y de secuencia arbitraria, con la ca- tar influenciada por varios factores, entre ellos: El n-
pacidad de unirse a regiones especficas en el genoma mero de ciclos de amplificacin, la cantidad de ADN
(Waugh y Powell 1992; Valadez y Kahl 2000). En el inicial, la longitud del ADN, el iniciador y la tempera-
anlisis PCR los dos iniciadores son usados para am- tura (Phillips et al. 1995).
plificar una secuencia especfica del genoma, y en el
anlisis RAPD, el iniciador se usa para amplificar
secuencias al azar de un patrn complejo de ADN IV- Polimorfismo en la longitud de los fragmentos
(Phillips et al. 1995). amplificados (AFLP)
Los polimorfismos producidos con la tcnica Los AFLPs son considerados marcadores de alta
RAPD se denominan marcadores RAPD, y pueden re- eficacia, permiten el anlisis de un elevado nmero de
sultar de cualquier cambio en la secuencia o sitio de loci por experimento sin requerir informacin previa
unin del iniciador (mutacin puntual), lo cual impide sobre su secuencia, son en su mayora dominantes y
que el iniciador se una a la cadena, o tambin pueden ser altamente reproducibles. Sin embargo, la tcnica es
el producto de cambios que alteren el tamao o impidan ms complicada de ejecutar que la de los RAPD y el
la exitosa amplificacin del ADN molde. Como regla SSR, adems requieren una mayor cantidad de ADN
general, el tamao de las variantes se detecta muy esca- (Karp et al. 1997; SIDTA 1999). Se pueden emplear,
samente y los productos de amplificacin individuales por ejemplo, en la construccin del armazn de los
representan un alelo por locus. En los estudios de heren- mapas genticos en el que se localizan los marcadores
cia, los productos de amplificacin se comportan como codominantes, para discriminar entre individuos cer-
marcadores dominantes (Waugh y Powell 1992). canamente relacionados y para localizar genes espec-
ficos en genomas complejos (Valadez y Kahl 2000).
Los RAPDs generan un nmero inmenso de mar-
cadores y, al contrario de los RFLPs, no requieren de El anlisis AFLP combina la digestin con enzi-
sondas especficas para cada especie y la cantidad de mas de restriccin con el PCR. El primer paso involu-
ADN necesaria para el anlisis es mucho menor (Phi- cra la digestin del ADN con dos enzimas especficas
llips et al. 1995). de restriccin, una de las cuales corta secuencias pre-
cisas y la otra corta ms frecuentemente. Es necesario
El anlisis RAPD requiere de cinco elementos b- agregar adaptadores para que stos se peguen en los
sicos: 1). ADN molde: ADN proveniente de la muestra bordes de los fragmentos recin formados y de esta
a analizar. 2). El iniciador: que es un oligonucletido, manera proveer una secuencia conocida para poder
con la propiedad de localizar y unirse a sitios comple- amplificar mediante PCR. En este paso, tambin se re-
mentarios del ADN desnaturalizado. Debe tener un con- quiere el uso de ligasas para facilitar la unin entre los
tenido de al menos un 50% de guanina-citocina para bordes de los fragmentos y las secuencias cortas cono-
funcionar correctamente. 3). Desoxirribonucletidos: se cidas. El uso de adaptadores es necesario porque las
requiere de concentraciones adecuadas de dATP, dGTP, secuencias que quedan en los bordes de los fragmen-
dCTP y de dTTP para la sntesis de la cadena. 4). Solu- tos, luego de ser cortados, no son adecuadas para ac-
cin buffer. 5). Taq-polimerasa: es una enzima ADN- tuar como iniciadores (Karp et al. 1997).
polimerasa ADN dependiente termoestable. Tiene la
propiedad de restituir la doble cadena de ADN usando Si el primer paso se realiz adecuadamente, todos
una cadena simple como molde a partir de un punto los fragmentos de restriccin se amplificaran mediante
PCR. Para poder discriminar entre todos los fragmentos todo el ADN. Son secuencias de ADN altamente varia-
de restriccin que se forman, se disean los iniciadores bles dispersas a travs de los genomas de hongos,
de tal manera que incorporen el adaptador de secuencia plantas y animales, los cuales pueden o no estar aso-
conocida ms uno, dos o tres pares de bases (dejando ciadas con genes, son loci altamente mutables que
por fuera alguna de las cuatro posibles: A, G, C o T). La pueden estar presentes en muchos sitios del genoma.
amplificacin mediante PCR solo ocurrir en aquellos Dado que, la repeticin por s misma no codifica para
fragmentos en donde los iniciadores encuentren las se- formar ninguna protena, y debido a que las secuencias
cuencias complementarias tanto para el adaptador como de ADN repetitivo pueden recombinarse y expandirse
para los pares de base adicionales. En este caso, los pa- ms frecuentemente que otros tipos de secuencias, es-
res de bases adicionados actan como nucletidos se- tas regiones son a menudo altamente variables y con-
lectivos. Si solamente se utiliza uno de estos nucleti- secuentemente tiles para medir el polimorfismo entre
dos se amplificarn ms fragmentos de los que se especies o variedades muy relacionadas (Phillips et al.
podran amplificar si se utilizaran dos nucletidos. Del 1995; Valadez y Kahl 2000).
mismo modo, si se utilizan tres nucletidos se obten-
dran menos fragmentos amplificados. Por alguna razn Los tipos de repeticiones que ocurren en los SSR
tcnica, la adicin de ms de tres nucletidos selectivos varan entre las especies. Las repeticiones ms
al iniciador resulta en una amplificacin PCR no espe- frecuentes en las plantas son (AA)n y (AT)n (Lager-
cfica (Karp et al. 1997). crantz et al. 1993). Estas repeticiones estn concentra-
das en secciones grandes del ADN que no codifican
Durante el PCR normalmente se realizan dos ci- para genes conocidos y que se han llamado macrosa-
clos trmicos selectivos. En el primero se utiliza un tlites, por lo que probablemente no son tiles como
nico nucletido selectivo, en el segundo ciclo trmi- aquellos marcadores que estn distribuidos al azar
co, se utiliza el anterior nucletido ms uno o dos nu- (Phillips et al. 1995). Por el contrario, Wu y Tanksley
cletidos selectivos adicionales. Los fragmentos am- (1993) encontraron que las secuencias (GA)n y (GT)n
plificados de esta forma pueden ser luego separados y sus complementos (CT)n y (CA)n se presentan con
en un gel de poliacrilamida mediante electroforesis y ms frecuencia y estn aleatoriamente espaciadas en
los productos de la amplificacin pueden ser visuali- el genoma de maz. Tambin observaron que estos lo-
zados mediante fluorescencia (Karp et al. 1997). ci son altamente polimrficos entre variedades de
arroz, por lo que son tiles como herramientas de ma-
Mayores detalles sobre la tcnica se pueden en- peo y para estudios de polimorfismos intraespecficos.
contrar en Valadez y Kahl (2000). Los SSRs representan un nivel adicional de informa-
cin genmica que se puede usar para los estudios de
Valadez y Kahl (2000) mencionan que los AFLPs mapeo y para la determinacin de polimorfismos
surgen a partir de: A) Polimorfismos en los sitios de (Phillips et al. 1995).
restriccin, en donde una secuencia especfica para el
reconocimiento de una endonucleasa de restriccin, El desarrollo de marcadores SSR es muy laborioso
est presente o ausente. B) Polimorfismos en la longi- debido a que deben identificarse y secuenciarse regiones
tud de la secuencia, donde el nmero de las secuencias genmicas concretas (bordes del microsatlite), aunque
repetidas arregladas en serie (tandem) tienen sitios una vez conseguido presenta un sistema muy informati-
variables. C) Cambios en los pares de bases de ADN vo. Al respecto, Cervera et al. (2002) mencionan que
no asociados con sitios de restriccin. aunque los microsatlites permiten analizar slo un lo-
cus por experimento son bastante informativos ya que
dejan diferenciar las variantes allicas de los loci anali-
V- Microsatlites o secuencias simples repetidas zados y por lo tanto identificar grupos de ligamiento en-
(SSR; MP-PCR) tre diferentes mapas genticos. Sin embargo, para su de-
sarrollo se precisa conocer la secuencia y, por lo tanto,
Los microsatlites o secuencias simples repetidas son menos numerosos que otros marcadores dominantes.
(SSR) son regiones de secuencias pequeas (dos a 10
pares de bases) repetidas, arregladas en serie, las cua- Estos marcadores son ideales para el estudio de li-
les se asume que estn distribuidas azarosamente por gamiento gentico en plantas y el mapeo fsico, los
estudios poblacionales y la identificacin de varieda- especies vegetales. Posteriormente se ofrece una revi-
des (SIDTA 1999). sin sobre el uso de los mismos en especies frutales
del trpico.
La tecnologa para el anlisis de microsatlites es
similar a la utilizada para el anlisis RAPD, con la adi- Los marcadores moleculares han sido usados con
cin de una evaluacin y secuenciacin previa para de- varios fines. En el Cuadro 2 se presentan ejemplos re-
terminar los iniciadores. La deteccin del polimorfismo portados en la literatura sobre el uso de los mismos en
SSR se realiza mediante un PCR y la separacin de los especies frutales del trpico. Como se aprecia, los
productos mediante electroforesis en geles de agarosa, usos ms frecuentes corresponden a la estimacin de
poliacrilamida o geles de secuenciacin. Las variacio- la diversidad gentica intra e inter poblacional, sea en
nes detectadas por los SSR son el resultado de cambios especies cultivadas o silvestres, en el desarrollo de
en el nmero de unidades repetidas (Lowe et al. 2004). mapas de ligamiento, para estudio de las relaciones fi-
logenticas entre especies, tambin como herramienta
Una tcnica derivada de la anterior se conoce co- para determinar la mejor estrategia de conservacin de
mo PCR iniciada con microsatlites anclados (AMP- recursos genticos por ejemplo en la formacin de co-
PCR) la cual emplea iniciadores con anclas en sus lecciones nucleares, en la identificacin de duplica-
extremos 3 o 5. Esta clase de iniciadores consiste de dos, entre otros. En relacin, Snchez (2002) mencio-
una, dos o tres bases adicionales al microsatlite, por na que los marcadores moleculares son la principal
ejemplo; C(CT)8, CA(CT)8, CAC(CT)8 o (CT)8C, herramienta utilizada hoy en da en microorganismos,
(CT)8CA y (CT)8CAC, y sirven para seleccionar plantas y animales para: caracterizacin de germo-
aquellas islas de microsatlites en el genoma que estn plasma, identificacin de genotipos, determinacin de
flanqueandos con el complemento de bases especfi- pureza, anlisis de diversidad gentica, mejoramiento
cas, por ejemplo; T(TA)8, GT(GA)8, GTG(GA)8 o gentico asistido por marcadores, aislamiento y carac-
(GA)8G, (GA)8GT y (GA)8GTG, por lo que se incre- terizacin de genes especficos para usar en transfor-
menta su especificidad (Valadez y Kahl 2000). Gene- macin gentica, construccin de mapas de ligamien-
ralmente esta tcnica es ms eficiente que las tcnicas to, en la identificacin de transformantes individuales
SSR o RAPDs, ya que ha demostrado detectar ms va- o su progenie, entre otros.
riabilidad gentica (Salimath et al. 1996).
Cuadro 1. Resumen de las principales caractersticas de los marcadores: Isoenzimas, RFLP, RAPD, AFLP y SSR.
Cuadro 2. Especies frutales del trpico mostrando ejemplos de la utilidad y aplicaciones de los marcadores moleculares.
Contina...
Contina...
ISSN: 1021-7444 AGRONOMA MESOAMERICANA 17(2): 221-242. 2006
232 AZOFEIFA: USO DE MARCADORES MOLECULARES EN FRUTALES TROPICALES
Contina...
Tenkouano et Musa spp. Comparar mediante marcadores del Polimorfismo Permiti determinar la relacin genealgica entre
al. (1999) ADN el comportamiento de la en la Longitud los individuos estudiados. As como, una baja
descendencia triploide originada de de las Secuen- heredabilidad y una herencia no aditiva para varios
varios cruces entre di y tetraploides. cias Simples caracteres en estudio.
Repetidas
(SSRLP)
Ude et al. Musa Anlisis de la diversidad gentica. AFLP, RAPD Los AFLP permitieron mayor discriminacin de
(2003) (Pltanos) los materiales que los RAPD. Los AFLP son una
herramienta poderosa para detectar polimorfis-
mos en los materiales.
Uma et al. Musa balbisiana Determinar centro de origen y RAPD Determinan las relaciones filogenticas. Distin-
(2005) diversidad de la especie. guen dos grupos: las accesiones con origen en In-
dia y con origen en las Islas Andaman y Nicobar.
Proponen que M. balbisiana se origina en las tie-
rras del NE de India.
Urasaki et al. Carica papaya Determinacin del sexo en plntulas. RAPD Determinaron un fragmento de 450 bp que existe
(2002) tanto en plantas masculinas como hermafroditas.
A partir de este fragmento desarrollaron un
marcador SCAR que sirve para determinar el
sexo en las plntulas.
Van Carica papaya, Anlisis de las relaciones genticas AFLP El poder de resolucin de la tcnica permiti se-
Droogenbroeck Vasconcella spp., entre materiales. parar claramente las especies en los tres gneros.
et al. (2002) Jacaratia spp. Las relaciones filogenticas determinadas con los
marcadores AFLPs corresponden fielmente a la
clasificacin taxonmica y son consistentes con
otros estudios basados en RAPDs, isoenzimas y
cpDNA. Tambin, los marcadores AFLPs em-
pleados confirman la reciente separacin de Vas-
concella como un grupo de Carica para formar
un nuevo gnero.
Van Gnero Anlisis de las relaciones genticas RFLP Detectaron un alto nivel de variacin
Droogenbroeck Caricaceae entre materiales. interespecfica mediante la comparacin de las
et al. (2004) regiones mtDNA y cpDNA estudiadas. Anlisis
de las relaciones filogenticas y desarrollo de un
dendrograma.
Viruel y Litchi chinensis Identificacin de secuencias marca- SSR Se determinaron 12 secuencias marcadoras
Hormaza Sonn. doras. enriquecidas en repeticiones CT. Los micro-
(2004) satlites desarrollados permitieron discriminar
adecuadamente los materiales en estudio.
Viruel et al. Mangifera indica Identificacin de genotipos de SSR Los resultados demuestran la utilidad de los SSR
(2005) L. mango. en estudios de identificacin, variabilidad,
conservacin y manejo de germoplasma y
domesticacin.
Zerega et al. Artocarpus altilis Determinar relacin con las especies AFLP Identificaron marcadores especficos para las
(2004) (Fruta de pan) emparentadas; A. camansi y A. ma- especies. Determinaron el posible origen del fruta
riannensis. de pan cultivado actualmente.
fenotipos multienzima y de esta manera fue posible las palmeras. El anlisis molecular corresponde co-
identificar dos subespecies de L. leucocephala, ade- rrectamente con el origen y el pedigree esperado. Es-
ms de diferenciar las poblaciones. tos autores resaltan el potencial de los marcadores en
programas de mejoramiento, a travs del examen de
Hawkins et al. (2001) utilizaron el anlisis de la estructura gentica de un grupo de plantas para es-
isoenzimas, RAPD y SSR para construir un mapa de timar los cruces que se pueden realizar con mayor o
ligamiento para poblaciones F2 y F3 de sanda (Citru- menor xito. Tambin mencionan, que permite cono-
llus lanatus) derivadas a partir del cultivar New cer el pool gentico de los padres que son cruzados y
Hampshire Midget, que es susceptible a Fusarium estimar el de la descendencia. As como, evaluar la fi-
oxysporum, y el cultivar resistente PI 296341-FR. delidad gentica de la descendencia.
A. cherimola y A. muricata, el cual es confirmado por y por encima de 25 ng/l resultaron ser inhibitorias pa-
la tcnica molecular RAPD. Con este protocolo se pue- ra la amplificacin mediante PCR. Los iniciadores que
den regenerar y propagar rboles selectos de A. cheri- produjeron mayor cantidad de fragmentos polimrfi-
mola y A. muricata y conservando la estabilidad gen- cos fueron OPA-04, OPA-15, OPB-06, OPB-07 y
tica de los mismos, por lo que se puede garantizar que OPM-05. Para lograr una mejor resolucin y defini-
el material propagado es fiel al tipo (Bridg 2001). cin de las bandas se us un gel de agarosa al 1,4% con
el bromuro de etidio incluido en concentraciones de
Se utiliz la tecnologa RAPD para estudiar la va- 0,1-0,5 g/ml. Cada uno de los genotipos estudiados
riabilidad existente en un banco de germoplasma de present un conjunto de patrones de bandas RAPD que
guisante, con objeto de establecer una coleccin nu- le son caractersticos y permite su identificacin. A pe-
clear, adems para la identificacin de genes de inte- sar de la gran uniformidad morfolgica que se observ
rs agronmico, los cuales sern utilizados en los pro- en la poblacin de rboles, con solo el uso de los ini-
gramas de mejora (SIDTA 1999). ciadores mencionados se logr separar genotpica los
materiales de la coleccin, lo que demuestra el poder
Con el uso de los marcadores RAPD fue posible de resolucin de la tcnica para discriminar, a nivel de
caracterizar los genotipos de cacao pertenecientes a la variedad, en esta especie (Salazar y Efran 2002).
coleccin 95 de la Estacin Experimental de Ocuma-
re de la Costa, Aragua, Venezuela. Los resultados per- Galderisi et al. (1999) utilizaron RAPD para dis-
mitieron la clasificacin de los rboles de cacao en dos tinguir entre varios clones de seis cultivares de Ficus
grandes grupos; cacaos criollos antiguos y cacaos carica. La utilizacin de los marcadores moleculares
criollos actuales. Adems, se evidenci que los mate- permiti la identificacin exacta, luego se estim la re-
riales que provienen de la misma localidad presentan lacin gentica entre los cultivares y sus clones.
patrones de banda similares y conforman grupo loca-
les, posiblemente por presentar un origen comn (Sa-
lazar y Efran 2002).
Ejemplos de AFLP
Para extraer el ADN y poder caracterizar la pobla-
cin de rboles de cacao, utilizaron diferentes tipos de Eiadthong et al. (2000) analizaron la relacin fi-
tejido foliar; tierno y fresco, sazn y fresco, tierno y logentica entre 14 especies de Mangifera, incluyendo
almacenado en congelacin y sazn y almacenado en tres de importancia econmica (mango comn; M. in-
congelacin. Determinaron que el tejido idneo para dica, mango caballo; M. foetida y mango kwini; M.
realizar la extraccin es el tejido joven y fresco, ya que odorata) la relacin la efectuaron comparando 217
present menos problemas de oxidacin y contenido de marcadores AFLP. Para el anlisis utilizaron los
muclago en las muestras procesadas, lo que favorece el mtodos UPGMA (unweighted pair grouping method
proceso de extraccin de los cidos nucleicos. Tambin using arithmetic averages) y NJ (neighbour-joining).
encontraron que concentraciones de ADN por encima de Adems se incluyeron el maran (Anacardium occi-
25 ng/l resultan inhibitorias para el proceso de amplifi- dentale) y la gandaria (Bouea macrophylla) como
cacin al azar del ADN y que los geles de agarosa al 2% grupos externos. Encontraron: que el mango comn
permiten la mejor separacin de los productos de ampli- est cercanamente relacionado con M. sylvatica, M.
ficacin as como una mayor resolucin de los mismos. laurina y M. oblongifolia. La variacin intraespecfi-
De los iniciadores evaluados, tres fueron los que produ- ca entre siete cultivares de mango comn fue ms pe-
jeron la mayor cantidad de fragmentos amplificados, po- quea que la variacin interespecfica y estos cultiva-
limrficos y reproducibles (Salazar y Efran 2002). res fueron incluidos en un mismo grupo de M. indica
en ambos mtodos usados. M. macrocarpa, M. foetida
La tcnica de RAPD es efectiva para caracterizar y M. odorata tambin estn bastante relacionadas con
genotpicamente variedades de mango. Para la extrac- M. indica segn UPGMA y NJ. No obstante, estas tres
cin del ADN, en mango, fue preferible usar el tejido especies son clasificadas en un subgnero diferente
foliar proveniente de hojas verdes con textura suave y (subgnero Limus) y M. indica pertenece al subgnero
tierna, evitando las de color bronce o rojizas. Las con- Mangifera. La tcnica AFLP fue confirmada como de
centraciones de ADN genmico por debajo de 20 ng/l mucha utilidad en los anlisis filogenticos.
Garcia-Mas et al. (2000) evaluaron tres tipos de mayor diversidad dentro de una poblacin ocurre en
marcadores moleculares; AFLP, RAPD y RFLP para los materiales silvestres de Taiwn. Adems desarro-
medir la diversidad gentica entre seis variedades de llaron un dendrograma, en ste se aprecia que el t na-
melones (Piel de sapo, Ogen, PI161375, PI414723, tivo de Taiwn se une cercanamente con los materia-
Agrestis y C105). El anlisis de los grupos (cluster) les de Assam, luego con los materiales de China y por
realizado usando los tres tipos de marcadores, separan ltimo con los hbridos de Taiwn.
los genotipos en dos grupos principales: (1) los de ti-
po dulce, que son los melones cultivados (Piel de sapo
y Ogen) y (2) los exticos, tipos no cultivados (resto
de genotipos). Con los datos obtenidos se sugiere que AGRADECIMIENTO
los tres tipos de marcadores utilizados son informati-
vos. El marcador AFLP da la mayor eficiencia en la Se agradece a Vctor Jimnez por la revisin rea-
deteccin del polimorfismo. lizada y comentarios aportados al presente trabajo.
Ejemplos de SSR
LITERATURA CITADA
Crouch et al. (2000b) construyeron iniciadores a
partir de las regiones genmicas que bordean varios mi- ALBANY, N.; VILCHEZ, J.; NAVA, A.; GONZLEZ, M.;
crosatlites de Musa con la idea de detectar polimorfis- CASTRO DE RINCON, C. 1998. El anlisis de con-
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Lavi et al. (1994) generaron un SSR til como
marcador del ADN. Para la construccin se utiliz una ARCHAK, S.; GAIKMAD, A.B.; GAUTAM,D.; RAO,
librera genmica de ADN para aguacate (Persea ame- E.V.; SWAMY, K.R.; KARIHALOO, J.L. 2003.
ricana). Para la creacin de la librera se realizaron Comparative assessment of DNA fingerprinting tech-
niques (RAPD, ISSR and AFLP) for genetic analysis
cuatro pruebas con los dinucletidos (AG), (AT), (GC)
of cashew (Anacardium occidentale L.) accessions of
y (CA). Luego, los clones positivos fueron secuencia- India. Genome 46(3):362-369.
dos para validar la presencia de los SSRs y para gene-
rar los iniciadores PCR basados en las secuencias sim- ASHWORTH,V.E.T.; CLEGG, M.T. 2003. Microsatellite
ples repetidas de los flancos. Se sintetizaron 26 pares markers in avocado (Persea americana Mill.): Genea-
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