You are on page 1of 23

Biblioteca de gene

Cuprinde colectiile de clone ADN recombinant


provenite din toate secventele (toti cromozomii) unei
surse de ADN genomic sau ADNc
Constructia bibliotecilor de ADN genomic presupune
parcurgerea urmatoarelor etape:
Extragerea ADN genomic dintr-o celula somatica
Digestia acestuia cu o enzima de restrictie in concentratii
inferioare celei necesare sectionarii tuturor situsurilor de
restrictie care conduce la fragmente de circa 20 kb de
dimensiuni diferite si partial superpozabile
Inserarea fragmentelor rezultate intr-un vector (bacteriofag
lambda) si amplificarea in bacterii
Izolarea sutelor de mii de fagi recombinanti si depozitarea
acestora intr-o banca
Banca de ADNc
Cuprinde toate copiile de ADNc corespunzatoare ARNm
dintr-o anumita celula, inserate intr-un vector
Realizarea unei biblioteci de ADNc implica:
Extragerea intregului ARN dintr-o celula si separarea ARNm
Producerea copiilor de ADNc corespunzatoare fiecarei molecule
de ARNm prin transcriptie inversa
Inserarea fiecarui segment de ADNc in vectori de tip bacteriofag
lambda
Bancile de ADNc sunt mai avantoajoase comparativ cu
bibliotecile de ADN genomic deoarece ADNc fiind
sintetizat pe baza secventelor ARNm corespunde
exclusiv exonilor din genele de structura si in acest mod
faciliteaza identificarea genei de interes
Biblioteca de gene
Identificarea clonei care contine gena dorita din
ansamblul clonelor dintr-o biblioteca de gene se
realizeaza prin tehnici de screening:
Criblajul cu oligonucleotide
Criblajul prin anticorpi
Criblajul cu oligonucleotide de
sinteza
Utilizeaza o secventa nucleotidica scurta
sintetizata pe baza secventei de aminoacizi a
unei parti din proteina de interes (15-20 de
aminoacizi) astfel incat secventa
oligonucleotidica corespunde unui segment din
gena investigata
Aceasta secventa oligonucleotidica (sonda) este
marcata radioactiv si hibridizata cu clone din
banca de ADN
Sonda se fixeaza specific pe secventa
complementara si permite identificarea clonei
care contine gena ce codifica proteina de interes
Criblajul cu anticorpi
Permite identificarea proteinei codificata
de o anumita gena
Complexul antigen-anticorp este evidentiat
prin utilizarea de proteine marcate cu 125I
METODA PCR
PCR = Polymerase Chain Reaction = reactia de
polimerizare in lant
Reprezinta o tehnica in vitro de clonare
specifica si selectiva a fragmentelor de ADN
Principiul metodei:
un fragment de ADN cu o secventa nucleotidica
cunoscuta este amplificat pe baza extensiei unor
amorse in prezenta ADN-polimerazei
Aceasta metoda permite:
amplificarea selectiva,
considerabila (de milioane de ori),
si rapida (in cateva ore)
a unei secvente tinta dintr-o molecula de acid
nucleic prezent intr-o matrice complexa
conducand la obtinerea unui fragment de acid
nucleic cu lungime si secventa bine definite in
cantitati suficiente pentru analize
PCR realizeaza o amplificare enzimatica in vitro a unor
secvente tinta de ADN dublu catenar, care necesita
sintetizarea a doua oligonucleotide primeri (amorse) cu
lungimea de aproximativ 20 de perechi de baze,
complementare secventelor de la extremitatea
fragmentului de ADN de amplificat.
Conditia esentiala aplicarii PCR consta in cunoasterea
secventelor nucleotidice situate la extremitatile 3 ale
catenelor fragmentului de amplificat cu care primerii sunt
complementari
Aceste secvente complementare primerilor se preiau din
banci de date iar majoritatea sunt disponibile comercial
Metoda PCR clasica
Presupune repetarea de 20 30 de ori a unui
ciclu termic alcatuit din 3 etape:
Denaturarea termica la 95oC a fragmentului de ADN
dublu catenar de interes
Pozitionarea si hibridizarea amorselor (primerilor) la
secventele complementare (situate in pozitia 3) de pe
fiecare catena de ADN rezultata din fragmentul tinta
la 50 70oC
Extensia primerilor sub actiunea ADN polimerazei
utilizand ca matrita ADN-ul monocatenar
Prima etapa
Are drept scop obtinerea ADN monocatenar prin denaturarea termica,
la o temperatura de 92 95oC, timp de aproximativ 1 minut, a
fragmentului de ADN tinta in catena sens si cea antisens
A doua etapa
Consta in fixarea specifica a celor 2 primeri la secventele
de baze complementare de la capatul 5 al fiecarei
catene din fragmentul de ADN tinta rezultate prin
denaturare
Amorsele sunt sintetizate astfel incat una este
complementara unei catene din molecula de ADN la un
capat iar cealalta este complementara la capatul opus al
catenei antiparalele
Oligonucleotidele primer delimiteaza fragmentul de
amplificat si fiecare are extremitatea 3 indreptata spre
interiorul acestuia.
Hibridizarea primerilor se realizeaza la temperatura
optima de 55oC timp de 1 minut
Designul oligonucleotidelor primer controleaza lungimea
fragmentului de ADN de amplificat fiind complementare
secventelor de la extremitatea acestuia si explica
specificitatea tehnicii PCR
Etapa finala
Realizeaza sinteza enzimatica a ADN ului prin
extensia primerilor sub actiunea ADN-polimerazei
utilizand ca matrita secventele monocatenare ale
fragmentului de interes la temperatura de aproximativ
72oC (70-75oC) timp de 1,5 minute
Amplificarea enzimatica decurge in prezenta ADN-
polimerazei izolate din bacteria termofila Termophilus
aquaticus care este extrem de rezistenta la temperatura
de denaturare si asigura sinteza unor fragmente de ADN
cu lungimea de 10 kilobaze
Pe matritele reprezentate de monocatenele segmentului
ADN-polimeraza va adauga la amorse dezoxiriboze
exclusiv in sensul 53
Acest mod de operare combinat cu orientarea
antiparalela a catenelor in duplexul ADN explica
copierea prin reactia de polimerizare in lant
numai a secventelor de nucleotide cuprinse intre
cele 2 amorse
Racirea in prezenta excesului de amorse
conduce la hibridizarea acestora cu secventele
nou-sintetizate in ciclul anterior, iar reincalzirea
mediului determina initierea unor noi reactii de
polimerizare
Prin tehnologia PCR fragmentul tinta de ADN (cu o lungime de 50
2000 perechi de baze) cuprins intre capetele 5 ale celor 2 amorse
este multiplicat exponential astfel incat dintr-o cantitate initiala de
ordinul nanogramelor de ADN rezulta 2n (n este numarul de cicluri)
molecule de ADN dublu catenar adica bilioane de copii cantitate
suficienta detectiei facile prin metode de laborator actuale
Prin parcurgerea a 20-30 de cicluri complet
automatizate cu controlul riguros al
temperaturii fiecarei etape si cu realizarea
reactiei de polimerizare simultan in 100 de
tuburi etanseizate in care s-au introdus
primerii,
cele 4 tipuri de dezoxiribonucleotide si
ADN polimeraza termostabila,
PCR permite obtinerea unor cantitati practic
nelimitate de ADN in 2-4 ore ceea ce
ilustreaza rapiditatea tehnicii.
Avantajele tehnicii PCR
Specificitatea si selectivitatea amplificarii,
explicata prin modul de actiune al ADN
polimerazei asupra amorselor si prin
orientarea antiparalela a catenelor in
duplexul ADN
Grad inalt de fidelitate a sintezei ADN
Sensibilitate deosebita datorita careia
detecteaza secventa specifica existenta
numai intr-o celula din 105 106 celule
Posibilitatea amplificarii secventelor de ADN genomic, mitocondrial,
exogen (in special viral) sau complementar
Varietatea surselor fragmentului de ADN de amplificat (celule
obtinute prin lavaj sau aspiratie, tesuturi fixate pe frotiuri, pete de
sange, sperma, mumii egiptene, frunze fosilizate ale unor plante de
aprox. 18 milioane ani vechime)
Amplificarea unei secvente genice specifice fara clonare
si fara a fi necesara o metoda de analiza genotipica
(Southern, Northen)
Necesitatea unor cantitati infinitezimale de ADN pentru
demararea reactiei dintr-un singur fragment rezultand
milioane de copii
Simplitate, automatizare integrala
Rapiditate (dupa 25 de cicluri de 3-5 minute pentru
fiecare copie, o gena poate fi amplificata de milioane de
ori in cateva ore) si costul redus
Versatilitate, putandu-se adapta unei diversitati de
scopuri apartinand unor domenii extrem de diferite
Utilitatea ca metoda preparativa, datorita puritatii copiilor
realizate
Instrument indispensabil de investigare a patologiei
genetice
Dezavantaje
Risc de contaminare cu secvente de ADN
provenite din amplificari anterioare
(ampliconi) prezente in laborator sub
forma de aerosoli
Se poate aplica doar pentru fragmente de
ADN a caror lungime nu depaseste 3 kb

You might also like