provenite din toate secventele (toti cromozomii) unei surse de ADN genomic sau ADNc Constructia bibliotecilor de ADN genomic presupune parcurgerea urmatoarelor etape: Extragerea ADN genomic dintr-o celula somatica Digestia acestuia cu o enzima de restrictie in concentratii inferioare celei necesare sectionarii tuturor situsurilor de restrictie care conduce la fragmente de circa 20 kb de dimensiuni diferite si partial superpozabile Inserarea fragmentelor rezultate intr-un vector (bacteriofag lambda) si amplificarea in bacterii Izolarea sutelor de mii de fagi recombinanti si depozitarea acestora intr-o banca Banca de ADNc Cuprinde toate copiile de ADNc corespunzatoare ARNm dintr-o anumita celula, inserate intr-un vector Realizarea unei biblioteci de ADNc implica: Extragerea intregului ARN dintr-o celula si separarea ARNm Producerea copiilor de ADNc corespunzatoare fiecarei molecule de ARNm prin transcriptie inversa Inserarea fiecarui segment de ADNc in vectori de tip bacteriofag lambda Bancile de ADNc sunt mai avantoajoase comparativ cu bibliotecile de ADN genomic deoarece ADNc fiind sintetizat pe baza secventelor ARNm corespunde exclusiv exonilor din genele de structura si in acest mod faciliteaza identificarea genei de interes Biblioteca de gene Identificarea clonei care contine gena dorita din ansamblul clonelor dintr-o biblioteca de gene se realizeaza prin tehnici de screening: Criblajul cu oligonucleotide Criblajul prin anticorpi Criblajul cu oligonucleotide de sinteza Utilizeaza o secventa nucleotidica scurta sintetizata pe baza secventei de aminoacizi a unei parti din proteina de interes (15-20 de aminoacizi) astfel incat secventa oligonucleotidica corespunde unui segment din gena investigata Aceasta secventa oligonucleotidica (sonda) este marcata radioactiv si hibridizata cu clone din banca de ADN Sonda se fixeaza specific pe secventa complementara si permite identificarea clonei care contine gena ce codifica proteina de interes Criblajul cu anticorpi Permite identificarea proteinei codificata de o anumita gena Complexul antigen-anticorp este evidentiat prin utilizarea de proteine marcate cu 125I METODA PCR PCR = Polymerase Chain Reaction = reactia de polimerizare in lant Reprezinta o tehnica in vitro de clonare specifica si selectiva a fragmentelor de ADN Principiul metodei: un fragment de ADN cu o secventa nucleotidica cunoscuta este amplificat pe baza extensiei unor amorse in prezenta ADN-polimerazei Aceasta metoda permite: amplificarea selectiva, considerabila (de milioane de ori), si rapida (in cateva ore) a unei secvente tinta dintr-o molecula de acid nucleic prezent intr-o matrice complexa conducand la obtinerea unui fragment de acid nucleic cu lungime si secventa bine definite in cantitati suficiente pentru analize PCR realizeaza o amplificare enzimatica in vitro a unor secvente tinta de ADN dublu catenar, care necesita sintetizarea a doua oligonucleotide primeri (amorse) cu lungimea de aproximativ 20 de perechi de baze, complementare secventelor de la extremitatea fragmentului de ADN de amplificat. Conditia esentiala aplicarii PCR consta in cunoasterea secventelor nucleotidice situate la extremitatile 3 ale catenelor fragmentului de amplificat cu care primerii sunt complementari Aceste secvente complementare primerilor se preiau din banci de date iar majoritatea sunt disponibile comercial Metoda PCR clasica Presupune repetarea de 20 30 de ori a unui ciclu termic alcatuit din 3 etape: Denaturarea termica la 95oC a fragmentului de ADN dublu catenar de interes Pozitionarea si hibridizarea amorselor (primerilor) la secventele complementare (situate in pozitia 3) de pe fiecare catena de ADN rezultata din fragmentul tinta la 50 70oC Extensia primerilor sub actiunea ADN polimerazei utilizand ca matrita ADN-ul monocatenar Prima etapa Are drept scop obtinerea ADN monocatenar prin denaturarea termica, la o temperatura de 92 95oC, timp de aproximativ 1 minut, a fragmentului de ADN tinta in catena sens si cea antisens A doua etapa Consta in fixarea specifica a celor 2 primeri la secventele de baze complementare de la capatul 5 al fiecarei catene din fragmentul de ADN tinta rezultate prin denaturare Amorsele sunt sintetizate astfel incat una este complementara unei catene din molecula de ADN la un capat iar cealalta este complementara la capatul opus al catenei antiparalele Oligonucleotidele primer delimiteaza fragmentul de amplificat si fiecare are extremitatea 3 indreptata spre interiorul acestuia. Hibridizarea primerilor se realizeaza la temperatura optima de 55oC timp de 1 minut Designul oligonucleotidelor primer controleaza lungimea fragmentului de ADN de amplificat fiind complementare secventelor de la extremitatea acestuia si explica specificitatea tehnicii PCR Etapa finala Realizeaza sinteza enzimatica a ADN ului prin extensia primerilor sub actiunea ADN-polimerazei utilizand ca matrita secventele monocatenare ale fragmentului de interes la temperatura de aproximativ 72oC (70-75oC) timp de 1,5 minute Amplificarea enzimatica decurge in prezenta ADN- polimerazei izolate din bacteria termofila Termophilus aquaticus care este extrem de rezistenta la temperatura de denaturare si asigura sinteza unor fragmente de ADN cu lungimea de 10 kilobaze Pe matritele reprezentate de monocatenele segmentului ADN-polimeraza va adauga la amorse dezoxiriboze exclusiv in sensul 53 Acest mod de operare combinat cu orientarea antiparalela a catenelor in duplexul ADN explica copierea prin reactia de polimerizare in lant numai a secventelor de nucleotide cuprinse intre cele 2 amorse Racirea in prezenta excesului de amorse conduce la hibridizarea acestora cu secventele nou-sintetizate in ciclul anterior, iar reincalzirea mediului determina initierea unor noi reactii de polimerizare Prin tehnologia PCR fragmentul tinta de ADN (cu o lungime de 50 2000 perechi de baze) cuprins intre capetele 5 ale celor 2 amorse este multiplicat exponential astfel incat dintr-o cantitate initiala de ordinul nanogramelor de ADN rezulta 2n (n este numarul de cicluri) molecule de ADN dublu catenar adica bilioane de copii cantitate suficienta detectiei facile prin metode de laborator actuale Prin parcurgerea a 20-30 de cicluri complet automatizate cu controlul riguros al temperaturii fiecarei etape si cu realizarea reactiei de polimerizare simultan in 100 de tuburi etanseizate in care s-au introdus primerii, cele 4 tipuri de dezoxiribonucleotide si ADN polimeraza termostabila, PCR permite obtinerea unor cantitati practic nelimitate de ADN in 2-4 ore ceea ce ilustreaza rapiditatea tehnicii. Avantajele tehnicii PCR Specificitatea si selectivitatea amplificarii, explicata prin modul de actiune al ADN polimerazei asupra amorselor si prin orientarea antiparalela a catenelor in duplexul ADN Grad inalt de fidelitate a sintezei ADN Sensibilitate deosebita datorita careia detecteaza secventa specifica existenta numai intr-o celula din 105 106 celule Posibilitatea amplificarii secventelor de ADN genomic, mitocondrial, exogen (in special viral) sau complementar Varietatea surselor fragmentului de ADN de amplificat (celule obtinute prin lavaj sau aspiratie, tesuturi fixate pe frotiuri, pete de sange, sperma, mumii egiptene, frunze fosilizate ale unor plante de aprox. 18 milioane ani vechime) Amplificarea unei secvente genice specifice fara clonare si fara a fi necesara o metoda de analiza genotipica (Southern, Northen) Necesitatea unor cantitati infinitezimale de ADN pentru demararea reactiei dintr-un singur fragment rezultand milioane de copii Simplitate, automatizare integrala Rapiditate (dupa 25 de cicluri de 3-5 minute pentru fiecare copie, o gena poate fi amplificata de milioane de ori in cateva ore) si costul redus Versatilitate, putandu-se adapta unei diversitati de scopuri apartinand unor domenii extrem de diferite Utilitatea ca metoda preparativa, datorita puritatii copiilor realizate Instrument indispensabil de investigare a patologiei genetice Dezavantaje Risc de contaminare cu secvente de ADN provenite din amplificari anterioare (ampliconi) prezente in laborator sub forma de aerosoli Se poate aplica doar pentru fragmente de ADN a caror lungime nu depaseste 3 kb