LOURDES MERTZ BRAVO

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TRADUCCIN CERTIFICADA

014-2014

Ref.: Mtodo Oficial AOAC 2003.08

Recuento de Staphylococcus aureus

Mtodo de Recuento de Placas 3M Petrifilm Staph Express
 LOURDES MERTZ BRAVO
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17.5.09

Mtodo Oficial AOAC 2003.08

Recuento de Staphylococcus aureus en
Alimentos Lcteos Seleccionados
Mtodo de Recuento de Placas 3M Petrifilm Staph Express
Accin Primera 2003

(Aplicable para el recuento de S. aureus en helado, leche cruda, yogurt, suero en polvo

y queso).

Advertencia: Colocar los materiales en autoclave despus del uso.

Para obtener los resultados del estudio de laboratorio que soporta la aceptacin del

mtodo ver la Tabla 2003.08.

A. Principio

Las Placas Petrifilm Staph Express para recuento es un sistema de medio de cultivo

listo para ser empleado, que contiene un agente gelificante soluble en agua fra. El

medio modificado cromognico Baird-Parker en la placa es selectivo y diferencial para el

Staphylococcus aureus. Las porciones de prueba diluidas se agregan al volumen de 1.0

mL por placa. EL agente gelificante permite solidificar despus de la inoculacin, y

luego la placa se incuba por 24 + 2h a 35 + 1C 37 + 1C. Las colonias rojo-violeta

en la placa son S. aureus. Cuando solamente se aprecien colonias rojo-violeta, cuente

las colonias y la prueba se habr completado. Si encuentra flora de

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acompaamiento en la prueba, el Disco Petrifilm Staph Express se debe utilizar para

diferenciar el S. aureus del resto de las colonias sospechosas. El Disco Petrifilm Staph

Express se debe utilizar cuando la placa presente colonias que no sean color rojo-

violeta; por ejemplo, colonias negras o azul-verdosas. El Disco Petrifilm Staph Express

contiene un indicador y cido desoxirrebonucleico (DNA). El S. aureus produce

desoxirribonucleasa (DNasa) y la DNasa reacciona con el indicador para formar zonas

rosadas. Cuando el Disco se inserta en la placa, y la placa y el disco se incuban por un

mnimo de 1 h y un mximo de 3 h a 35 + 1C 37 + 1C. S. aureus (y

ocasionalmente el S. hyicus y el S. intermedius que pueden producir enterotoxinas)

producen una zona rosada. Contar las zonas rosadas como S. aureus,

independientemente del tamao de la zona.

B. Aparato y Reactivo

(a) Placas 3M Petrifilm Staph Express para Recuento.- Las placas estn disponibles

en en los Productos de Microbiologa 3M (3M Center Bldg, 275-5W-05, St. Paul, MN

55144, EEUU), contienen un medio modificado cromognico Baird-Parker y un agente

gelificante soluble en agua fra.

(b) Discos 3M Petrifilm Staph Express.- Los discos estn disponibles en los Productos

de Microbiologa 3M, contienen azul de toluidina-O y DNA.

(c) Difusor de plstico Difusor con asa, disponible en los Productos de

Microbiologa 3M, tiene un lado plano suave y diseado para esparcir la suspensin

uniformemente sobre el rea de crecimiento de la placa.

(d) Pipetas.- Pipetas serolgicas de 1.0 y 10.0 mL con graduaciones de 0.1 mL. El

pipeteador electrnico y sus conos, o equivalente, podra ser utilizadas para depositar

1.0 mL. No utilice pipetas que depositen <10% de su volumen total. Por ejemplo,

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para depositar 1 mL no use una pipeta >10mL; para depositar 0.1mL, no use una pipeta

>1mL.

(e) Contador de colonias.- Aparato estndar, del cual se prefiere el modelo

Qubec, o uno que proporcione el aumento y la visibilidad equivalentes.

(f) Solucin de hidrxido de sodio.- 1M esterilizado. Disolver 40 g de NaOH en

500 mL de agua en un contenedor de 500 mL para autoclave Nalgene. Coloque en

autoclave 15 minutos a 121 C.

(g) Agua de dilucin de fosfato.- (1) Solucin de reserva.- disuelva 34 g de

KH2PO4 en 500 mL de H2O, ajuste el pH a 7.2 con ca 175 L 1M NaOH y diluir a

1L. Almacenar en el refrigerador. (2) Diluyente.- diluir 1.25 mL de solucin de

reserva en 1 L con H2O. Preparar diluciones blanco con esta solucin, guardando

lo suficiente en caso de suplir las prdidas durante la autoclave. Coloque en

autoclave 15 minutos a 121 C.

(h) Licuadora.- Licuadora de alta velocidad (16,000-18,000 rpm) con jarra

esterilizada.

(i) Incubadora.- Mantener en 35 + 1C 37+ 1C

(j) Balanza.- 2000 + 0.1 g de capacidad.

(k) Tiras indicadoras de pH.- Para la medicin del rango de 6.0 - 8.0

C. Preparacin y suspensin de prueba

Utilizar la balanza, B(j), para pesar aspticamente 50 g de la porcin de prueba

dentro de la jarra de la licuadora, B(h). Agregar 450 mL del diluyente, B(g)(2), y

mezclar a 16000-18000 rpm por 2 minutos para homogenizar. Si toda la muestra

de prueba es <50 g, pesar la porcin de muestra de prueba y agregue el agua de

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dilucin para hacer una dilucin 1:10. Segn se requiera, ajustar el pH de la

porcin de prueba diluida a 6.0-8.0 con 1M NaOH B(f), (ca 0.1 mL/g de porcin de

prueba). No utilizar diluyentes que contengan citrato, bisulfito, o tiosulfato ya que

pueden inhibir el crecimiento. Preparar todas las diluciones decimales con 90 mL

de diluyente ms 10 mL de la dilucin anterior. Las pipetas B(d), deben depositar

con precisin el volumen requerido. Mezclar todas las diluciones agitando 25

veces a travs de un arco de 30 cm en 7 segundos.

D. Anlisis

Coloque la placa Petrifilm Staph Express para recuento, B(a),en una superficie

plana. Levante la pelcula superior, e inocule 1 mL de suspensin de prueba en el

centro de la base de la pelcula. Baje cuidadosamente la pelcula superior sobre

el inculo. Distribuya la suspensin de prueba sobre 30 cm2 del rea de

crecimiento presionando hacia abajo el asa del difusor de plstico, B(c). No tocar

la placa para permitir que solidifique el agente gelificante. Incubar las placas a 35

+ 1C 37+ 1C por 24 + 2 h. En la incubadora, B(i), colocar la placa en forma

horizontal en pilas que no excedan 20 unidades. Cuente las placas con el contador

de colonias, B(e). Observar el color de las colonias. Si no hay colonias presentes

o solo hay colonias rojo-violeta despus de 24 + 2 h, contar las colonias rojo-violeta

en la placa como S. aureus; la prueba est terminada. Si adems de colonias rojo-

violeta aparecen colonias de otro color, utilice el Disco Petrifilm Staph Express,

B(b).

Insertar el Disco Petrifilm Staph Express en la cavidad de la placa. Aplicar presin

deslizando un dedo con guantes firmemente a lo largo del rea del Disco

(incluyendo los bordes) para asegurar el contacto uniforme del disco con el gel y

eliminar cualquier burbuja de aire. Incubar las placas y los discos, en pilas no ms

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de 20 unidades, por lo menos 60 minutos y no ms de 3 h a 35 + 1C 37+ 1C.

Hacer el recuento de las zonas rosadas como S. aureus aunque no se encuentre

presente una colonia. Las zonas rosadas estn ntimamente relacionadas a S.

aureus pero podran indicar S. hycus o S. intermedius. Las colonias no asociadas

con una zona rosada no son S. aureus y no deben ser consideradas en el conteo.

Observacin de seguridad: El kit de prueba no contiene ningn componente

patognico pero la suspensin de prueba enriquecida podra contener S. aureus.

Por lo tanto, descartar todas las muestras de prueba conforme a los procedimientos

estndar de manejo de residuos peligrosos de laboratorio.

Referencia: J. AOAC Int. 86, 954 (2003).

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Tabla 2003.08 Resultados del estudio de laboratorio del Mtodo de Recuento de Placas 3M Petrifilm Staph Express y el
mtodo Baird-Parker agar para la deteccin de S. aureus en alimentos.

Recuento de placas y disco Petrifilm Staph Express Baird-Parker agar

a b c b c
Alimento Nivel N Prom s RSD , % r s RSD , % R N Prom s RSD , % r s RSD , % R
r r R R r r R R
Helado Bajo 11 1.57 0.32 20.24 0.89 0.32 20.56 0.90 11 1.61 0.33 20.30 0.91 0.34 20.81 0.94
Med 10 2.58 0.06 2.49 0.18 0.09 3.46 0.25 11 2.54 0.08 3.20 0.23 0.18 7.11 0.51
d
Med+ 9 2.59 0.10 3.88 0.28 0.10 3.88 0.28 10 2.66 0.09 3.26 0.24 0.12 4.41 0.33
Leche cruda Bajo 9 2.57 0.12 4.54 0.33 0.18 6.97 0.50 7 2.63 0.12 4.69 0.34 0.18 6.92 0.51
Med 9 3.54 0.11 3.00 0.30 0.13 3.54 0.35 8 3.50 0.12 3.44 0.34 0.21 6.03 0.59
e
Med+ 10 3.50 0.30 8.62 0.85 0.30 8.72 0.86 10 3.42 0.12 3.53 0.34 0.38 10.97 1.05
e
Queso Bajo 8 2.77 0.06 2.10 0.16 0.07 2.51 0.19 10 2.53 0.16 6.48 0.46 0.30 12.09 0.86
Med 7 3.74 0.09 2.32 0.24 0.12 3.09 0.32 7 3.58 0.15 4.23 0.42 0.23 6.34 0.64
e
Med+ 8 3.75 0.05 1.23 0.13 0.08 2.12 0.22 8 3.66 0.11 3.05 0.31 0.20 3.05 0.55
e
Suero en polvo Bajo 9 2.58 0.07 2.63 0.19 0.18 6.91 0.50 7 3.55 0.03 0.74 0.07 0.33 9.37 0.93
Med 10 3.44 0.08 2.40 0.23 0.29 8.55 0.82 9 3.48 0.14 3.86 0.38 0.31 8.84 0.88
Med+ 9 3.53 0.16 4.50 0.44 0.20 5.71 0.57 10 3.53 0.19 5.49 0.54 0.33 9.22 0.91
e
Yogurt Bajo 10 3.11 0.05 1.49 0.13 0.22 7.02 0.61 9 2.99 0.11 3.80 0.32 0.44 14.65 1.23
Med 10 4.02 0.09 2.11 0.24 0.39 9.74 1.10 10 3.86 0.16 4.03 0.44 0.51 13.18 1.42
Med+ 11 4.03 0.17 4.22 0.48 0.48 11.78 1.33 10 3.94 0.30 7.75 0.86 0.49 12.36 1.36
a Los niveles de inoculacin incluyen un nivel bajo, nivel medio y medio con un organismo en el sustrato.

b Nmero de laboratorios utilizados en el anlisis despus de las pruebas atpicas.

c Log10 Conteo S. aureus /g.

d Considerablemente diferente (p<0.05)

e Considerablemente mejor en forma repetida (p < 0.05).

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