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Pecuria e Abastecimento
Transformao de Plantas
ISSN 1517-5111
Dezembro, 2003
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Cerrados
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
Documentos 102
Transformao de Plantas
Planaltina, DF
2003
Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:
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Comit de Publicaes
Presidente: Dimas Vital Siqueira Resck
Editor Tcnico: Carlos Roberto Spehar
Secretria-Executiva: Nilda Maria da Cunha Sette
1a edio
1a impresso (2003): tiragem 100 exemplares
631.5233 - CDD 21
Embrapa 2003
Autora
Introduo .................................................................................... 9
Abstract .................................................................................... 28
Transformao de Plantas
Solange Rocha Monteiro de Andrade
Introduo
Durante sculos o homem, por meio de cruzamentos intra-especficos, vem
manipulando geneticamente plantas para obter cultivares com caractersticas
superiores aos genitores. No entanto, os mtodos convencionais de
melhoramento apresentam limitaes como a ligao gnica, a incompatibilidade
sexual, alm de longos perodos de seleo para a obteno da expresso da
caracterstica desejada. O desenvolvimento de mtodos de transformao gerou
possibilidades de grandes avanos no melhoramento vegetal, pois, oferece a
oportunidade de introduzir genes de origem vegetal, animal ou microrganismo
em cultivares elites, quebrando barreiras interespecficas impossveis no mtodo
convencional, diminuindo o efeito das ligaes gnicas e o tempo de obteno
de novas cultivares.
2) biolstica;
3) eletroporao.
Etapas da Transformao
Identificao, clonagem e isolamento do gene
A identificao e a localizao de genes de interesse na agricultura so um dos
entraves para a obteno de transgnicos. Programas de seqenciamento de
genomas de diversas espcies vegetais, animais e microrganismos tm sido
realizados em todo o mundo com o intuito de identific-los. No entanto, ainda
pequeno o conhecimento dos genes relacionados ao aumento de produtividade,
resistncia a estresses biticos e abiticos, qualidade nutricional e outras
caractersticas de interesse.
Transformao de Plantas 11
Identificao
do gene
de interesse
Isolamento
Enzimas de Insero do
Clonagem restrio gene
Multiplicao
do gene
Gene de interresse
A B
Agrobacterium Bombardeamento
Replicao do
Bactria incubada
insero do gene gene
com clulas vegetais
no plasmdio Ti
DNA adsorvido em
Micropartculas
Transformao
Transferncia do Clulas bombardeadas
gene para o e insero do gene
genoma da planta no genoma da planta
C
Seleo das clulas
contendo o
transgene Clulas transformadas Planta transgnica
Clulas selecionadas selecionadas por regenerada de uma
para o transgene um marcador clula transformada
1 2 3 5 6 7 8
Anlises
moleculares
Testes finais
Anlise
da prognie
Testes em casa de
vegetao e no campo
Transformao da
bactria
Multiplicao do
plasmdio
Multiplicao da
bactria Figura 2. Isolamento e
clonagem do gene.
Transformao de Plantas 13
Mtodos de Transformao
Transformao indireta
A transformao indireta consiste no uso de um vetor, como a Agrobacterium,
para intermediar a transferncia de DNA.
Transformao direta
Com o intuito de obter mtodos de transformao independentes do gentipo,
vrias tcnicas de transferncia direta de DNA foram desenvolvidas. A
transformao direta consiste no uso de mtodos qumicos ou fsicos e,
atualmente, as duas principais so a biolstica e a eletroporao.
Biolstica
A biolstica tambm conhecida como gene gun (arma de genes), acelerao de
partculas ou bombardeamento com micropartculas (CHRISTOU, 1992; DE
BLOCK, 1993; BIRCH, 1997). O mtodo descrito pelo grupo do Dr. Sanford da
Universidade de Cornell (KLEIN et al., 1987; SANFORD et al., 1987), consiste
em bombardear clulas ou tecidos com micropartculas de tungstnio ou ouro
carregando o DNA exgeno, lanadas a partir de um acelerador e por meio de
uma cmara especial em condio de vcuo (Figura 5). O mecanismo visa
penetrar na parede celular e na membrana plasmtica as duas principais barreiras
transferncia direta de DNA (SANFORD, 1990).
Transformao de Plantas 17
Tubo de acelerao de gs
A
d
Disco de ruptura
Membrana carreadora
Tela de reteno
Tecido-alvo
Suporte da placa
Explantes
Bombardeamento Co-cultivo em
com micropartculas meio slido
com DNA adsorvido
Fonte de explante
O processo consiste numa fonte que produz uma onda de choque para acelerar
as partculas. Essa onda pode ser gerada por exploso qumica (plvora seca),
descarga de hlio a alta presso ou pela vaporizao de uma gota de gua
(SANFORD et al., 1987; SANFORD et al., 1991; CHRISTOU, 1995).
Diferentes sistemas foram desenvolvidos com intuito de acelerar as partculas; no
entanto, os sistemas que utilizam gs hlio sob alta presso e descarga eltrica
tm demonstrado maior eficincia na obteno dos transformantes (RECH;
ARAGO, 1998; LACORTE et al., 1999).
Eletroporao
A eletroporao um mtodo desenvolvido como alternativa transformao via
Agrobacterium, foi inicialmente proposto para transformao de cereais e,
posteriormente, a metodologia foi extendida a outras espcies vegetais. Esse
mtodo consiste no emprego de pulsos eltricos curtos de alta voltagem que
modificam, temporariamente, a estrutura da membrana plasmtica, induzindo a
formao de poros ao longo de sua superfcie. Dessa maneira, possvel
aumentar a permeabilidade da membrana, possibilitando a entrada do gene
exgeno (Figura 6) (LINDSEY; JONES, 1990; POTRYKUS, 1990;
SONGSTADT et al., 1995; JONES, 1995).
Outras metodologias
Microinjeo
A microinjeo um processo preciso e especfico para a introduo de
macromolculas dentro de uma clula ou compartimentos especficos dela, de
maneira no letal. As clulas podem estar intactas ou desprovidas parcial ou
totalmente de suas paredes celulares. Para introduo do material exgeno,
utilizam-se microscpio, micromanipuladores (micropipetas de vidro e
microseringas), cmara assptica que no sofra vibraes, com temperatura e
umidade relativa controlada (NEUHAUS; SPANGENBERG, 1990; POTRYKUS,
1990; NEUHAUS, 1995).
Transformao de Plen
Por esse mtodo, o plen maduro embebido em soluo com DNA e efetua-se
a polinizao das flores femininas da planta. Detectam-se os transformantes logo
na fase inicial da plntula mediante o emprego de um gene marcador. Porm,
um mtodo de baixa eficincia, difcil de reproduzir e necessita mais estudos para
aumentar a eficincia (POTRYKUS, 1990; BRASILEIRO; DUSI, 1999).
Lipossomos
Esse mtodo baseia-se na utilizao de vesculas lipdicas artificiais como
veculos para introduo de partculas ou material exgeno dentro de
protoplastos. A vescula visa proteger o DNA que se encarrega do ataque de
endonucleases. O mtodo requer a digesto da parede celular e incubao desses
protoplastos com lipossomos na presena de agentes fusognicos como o PEG
ou o PVA com lavagem subseqente em elevado pH saturado em ons de clcio
(CABOCHE, 1990; BRASILEIRO; DUSI, 1999).
Histrico da Comercializao de
Transgnicos no Mundo
Em 1986, nos EUA e na Frana, foi liberado o primeiro teste em campo de um
vegetal transgnico. Era uma variedade de tabaco contendo um gene de
resistncia a herbicida (JAMES; KRATTIGER, 1996). A partir desse evento,
vrios pases iniciaram seus testes, em campo, com vegetais transgnicos e, no
perodo de 1986 a 1995, foram conduzidos 3500 testes, em 34 pases, com
56 culturas. A maioria dos estudos foi conduzida nos EUA, Canad, Frana,
Inglaterra, Holanda, Blgica, Argentina, Itlia, China, Alemanha, Austrlia, Chile e
22 Transformao de Plantas
80
70 Total
USA
60 Argentina
Hectares (milhes)
Canad
50 China
40
30
20
10
0
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003
Ano
Figura 8. Crescimento do plantio de transgnicos nos principais pases produtores.
Fonte: Adaptado de James (2003).
Aspectos Futuros
Os mtodos de transformao abrem novas fronteiras para o melhoramento de
plantas, uma vez que, permitem a reduo no tempo de obteno de variedades
com novas caractersticas, bem como a transferncia de caractersticas de
interesse entre espcies que, em geral, so sexualmente incompatveis. Em
outras palavras, as barreiras naturais entre as espcies podem ser derrubadas, o
que oferece a possibilidade de obter novas variedades na forma de plantas
transgnicas. Alm disso, possvel, com os mtodos da biologia molecular
moderna, isolar e manipular genes especficos, o que no acontece no
melhoramento clssico, em que o melhorista obrigado a trabalhar com genomas
inteiros.
Referncias Bibliogrficas
BIRCH, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical
application. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,
Palo Alto, v. 48, p. 297-326, 1997.
DRAPER, J.; SCOTT, R.; KUMAR, A.; DURY, G. Transformation of plants cells
by DNA-mediated gene transfer. In: DRAPER, J. et al. (Ed). Plant genetic
transformation and gene expression: a laboratory manual. Oxford: Blackwell
Scientific, 1988. p. 161-198.
WALDEN, R.; KONCZ, C.; SCHELL, J. The use of gene vectors in plant
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p. 175-194, 1990.
WHITE, F. F. Vectors for gene transfer in higher plants. In: KUNG, S.; WU, R.
(Ed.). Transgenic plants: engineering and utilization. San Diego: Academic Press,
1993. p. 15-48, v. 1.
Plant Transformation