ESPECTROMETRA POR RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

HISTORIA

En el ao 1938 Isidor Isaac Rabi (Premio Nobel, 1944) sugiere que la informacin acerca de los ncleos
atmicos podra ser obtenida estudiando su magnetismo. Los fsicos E. Purcell (Harvard) y F. Bloch
(Stanford) en 1946, descubren la resonancia nuclear magntica. Este descubrimiento les valio el Premio
Nobel en 1952.

Durante la dcada del ' 70, P. Lauterbur y otros aplican el principio de resonancia nuclear magntica
para la creacin de imgenes de estructuras internas del cuerpo.

La dcada siguiente las imgenes por resonancia nuclear magntica evolucionan rpidamente,
hacindose conocidas como MRI (Magnetic Resonance Imaging) o tambien conocido como Resonancia
Magntica Nuclear (RMN). Los electroimanes superconductores, las rpidas computadoras, y los nuevos
detectores, todos desarrollados independientemente, son utilizados en RMN, obtenindose imgenes de
mayor calidad en menor tiempo. Se desarrolla la RMN funcional, capaz de mostrar al cerebro en accin,
identificndose los centros de actividad cerebral y las anomalas (como la epilepsia).

CONCEPTO

La Resonancia Magntica Nuclear es una espectroscopia de absorcin orientada en el seno de un

campo magntico cuyo fundamento es la absorcin de energa (radiofrecuencias) por un ncleo
magnticamente activo y que por efecto de esa energa cambia su orientacin basndose en las
diferencias de contraste que producen los espacios vecinos a los ncleos atmicos ante campos
magnticos muy intensos.

FUNDAMENTO

Suponiendo que se puedan obtener disoluciones altamente concentradas (- 1mM, o 15 mg ml -1 para una
protena de 15 kD). Esta tcnica se basa en el hecho de que algunos ncleos atmicos son
intrnsecamente magnticos. Slo un nmero limitado de istopos muestra esta propiedad, llamada espn el
giro de un protn genera un momento magntico. Este momento puede adoptar una de dos orientaciones,
o girar estados (llamadas alfa y beta), cuando se aplica un campo magntico externo. La diferencia de
energa entre estos estados es proporcional a la fuerza del campo magntico impuesto.

El estado tiene una energa ligeramente inferior y por lo tanto es un poco ms pobladas ya que se
alinea con el campo. Un protn en rotacin en estado puede ser elevado a un estado excitado ( estado)
mediante la aplicacin de un pulso de radiacin electromagntica siempre que la frecuencia corresponda a
la diferencia de energa entre la y la . En estas circunstancias, el spin cambiar de a y la
resonancia se obtendr.

Un espectro de resonancia para una molcula se puede obtener mediante la variacin del campo
magntico a una frecuencia constante de radiacin electromagntica o manteniendo constante el campo
magntico y variando la radiacin electromagntica.

Estas propiedades se pueden usar para examinar los entornos qumicos del ncleo de hidrgeno. El
flujo de electrones alrededor de un ncleo magntico genera un pequeo campo magntico local que se
opone al campo aplicado. El grado de tal blindaje depende de la densidad de electrones de los
alrededores. En consecuencia, los ncleos en diferentes entornos cambiarn estados, o resonaran, en
intensidades de campo o frecuencias de radiacin ligeramente diferentes. Los ncleos de la muestra
perturbada absorben la radiacin electromagntica a una frecuencia que se puede medir. Las diferentes
frecuencias, denominadas desplazamientos qumicos, se expresan en unidades fraccionales (partes por
milln, o ppm) con relacin a los cambios de un compuesto estndar, tal como un derivado soluble en agua
de tetrametilsilano, que se aade con la muestra. Por ejemplo, un grupo -CH 3 protones tpicamente exhibe
un desplazamiento qumico () de 1 ppm, en comparacin con un desplazamiento qumico de 7 ppm para
un protn aromtico. Los desplazamientos qumicos de la mayora de los protones en las molculas de
protena se sitan entre 0 y 9 ppm ( Figura 4.44 ). Es posible resolver la mayora de los protones en
muchas protenas mediante el uso de esta tcnica de RMN unidimensional. Con esta informacin, entonces
podemos deducir cambios a un grupo qumico particular en diferentes condiciones, tales como el cambio
conformacional de una protena a partir de una estructura desordenada a una hlice en respuesta a un
cambio en el pH.

Podemos acumular ms informacin examinando cmo las rutas de los diferentes protones afectan a
sus vecinos. Induciendo una magnetizacin transitoria en una muestra por aplicacin de un pulso de
radiofrecuencia, es posible alterar la rotacin de un ncleo y examinar el efecto producido en la rotacin de
otro ncleo vecino. La base de esta tcnica es el efecto nuclear overhauser

La Resonancia Magntica Nuclear (RMN) se basa en la aplicacin de un poderoso campo magntico

esttico y la aplicacin de ondas de radiofrecuencia combinadas con pequeas y rpidas variaciones al
poderoso campo magntico. Esta energa es absorbida por los nucleos de los tomos de Hidrgeno del
cuerpo y liberada a distintas intensidades y diferentes velocidades, siendo detectada esta energa por
antenas o bobinas que a travs de circuitos electrnicos la transmiten en forma digital a una computadora
central, que procesa toda la informacin, dando por resultado imgenes digitales de altsima calidad e
informacin

Grosso modo, las interacciones que pueden detectarse por RMN se pueden clasisficar en dos tipos:

Las interacciones a travs de enlaces se basan en el acoplamiento escalar

Las interacciones a travs del espacio se basan en el acoplamiento dipolar. En el caso de muestras en
disolucin, el acoplamiento dipolar se manifiesta como efecto Overhauser nuclear que permite determinar
la distancia entre los tomos.

PARTES DEL EQUIPO

Las partes fundamentales de un espectrmetro de RMN son un imn, actualmente una bobina
superconductora, que suministra el campo magntico principal, un oscilador de radiofrecuencias que
suministra la energa necesaria para cambiar la orientacin de los ncleos, una bobina detectora que recibe
las seales y un sistema informatizado que gobierna todo el aparato y que incluye un sistema de
amplificacin y registro.

Un espectrmetro de RMN consta de las siguientes partes fundamentales:

Un imn que genere un campo magntico estable, el cual puede ser de una intensidad variable,
definiendo la frecuencia de resonancia de cada ncleo. Generalmente se identifica cada espectrmetro por
la frecuencia de resonancia del protn, as en un imn de 7.046 Tesla, los ncleos de 1H resuenan a 300
MHz, y por tanto sera un espectrmetro de 300 MHz. Por el momento el imn de mayor campo magntico
del mundo lo ha instalado Bruker en la Unviersiad de ciencia y tecnologa Rey Abdullah en Arabia Saudita,
de 950 MHz (22.3 Tesla).2

Una sonda, que se sita dentro del imn, en la que se introduce la muestra y que consta de las
bobinas responsables de emitir y recibir las radiofrecuencias (RF). El nmero de bobinas y su disposicin
determinan el tipo y las aplicaciones de cada sonda.

Una consola en la que se generan los pulsos de RF y se controla el resto de la parte electrnica del
espectrmetro.

Un ordenador que sirve de interfaz con el espectrmetro y con el que se analiza toda la informacin
obtenida.
 TIPOS DE RMN

Espectroscopia de RMN con Onda Continua (CW: Continuous Wave)

Desde sus comienzos hasta finales de los 60, la espectroscopia de RMN utiliz una tcnica conocida
como espectroscopia de onda continua (CW). La manera de registrar un espectro de RMN en el modo de
CW era, bien mantener constante el campo magntico e ir haciendo un barrido de frecuencias con un
campo oscilante, o bien, lo que era usado ms a menudo, se mantena constante la frecuencia del campo
oscilante, y se iba variando la intensidad del campo magntico para encontrar las transiciones (picos del
espectro). En la RMN de CW las seales del espectro se registran como seales en resonancia.

La espectroscopia CW est limitada por su baja sensibilidad, ya que cada seal se registra una sola vez
por cada barrido y la tcnica de resonancia magntica nuclear ya es de por s no demasiado sensible; esto
quiere decir que la tcnica sufre de una baja relacin seal-ruido. Afortunadamente, en RMN es posible
mejorar la relacin seal-ruido mediante el promediado de seal. El promediado de seal consiste en
repetir la adquisicin del experimento e ir sumando los espectros que se obtienen. De esta manera, las
zonas del espectro en que existen seales se suman de manera constructiva, mientras que, por su parte,
las zonas en que hay ruido, por su carcter aleatorio, se acumula ms lentamente que la seal. Mediante el
promediado de seal se incrementa la relacin seal-ruido en un valor que es la raz cuadrada del nmero
de espectros que se han acumulado. Esta relacin se cumple con espectros de RMN en los que intervienen
un slo tipo de ncleos, por ejemplo, slo 1H, 13C, etc., tambin llamados espectros homonucleares.

Espectroscopia de RMN de pulsos y Transformada de Fourier

FT-NMR permite disminuir drsticamente el tiempo que requiere adquirir una acumulacin (scan) del
espectro completo de RMN. En vez de realizar un barrido lento de la frecuencia, una en cada instante, esta
tcnica explora simultnea e instantneamente todo un rango de frecuencias. Dos desarrollos tcnicos
fueron fundamentales para poder hacer realidad la tcnica FT-NMR: ordenadores capaces de llevar a cabo
las operaciones matemticas necesarias para pasar desde el dominio de tiempo al de la frecuencia, es
decir, para obtener el espectro; y el conocimiento sobre cmo poder excitar simultneamente todo un rango
de frecuencias.

La FT-NMR funciona con la muestra (espines nucleares) sometida a un campo magntico externo
constante. Se irradia la muestra con un pulso electromagntico de muy corta duracin en la regin de las
radiofrecuencias. La forma que suele usarse para este pulso es rectangular, es decir, la intensidad de la
radiofrecuencia oscila entre un mximo y un mnimo que es constante mientras dura el pulso. Un pulso de
corta duracin tiene una cierta incertidumbre en la frecuencia (principio de indeterminacin de Heisenberg).
La descomposicin de fourier de una onda rectangular contiene contribuciones de una de todas las
frecuencias. El pulso que se genera es por tanto policromtico y cuanto ms corto sea, es capaz de excitar
un mayor rango de frecuencias.

A medida que los ncleos van regresando poco a poco a la situacin inicial de equilibrio alineados con
en el campo magntico principal, la seal detectada va disminuyendo de intensidad hasta hacerse cero.
Esta cada de la seal se conoce como cada libre de la induccin (Free Induction Decay) (FID) y da lugar
al espectro de RMN. La FID es una onda que contiene todas las seales del espectro en una forma que es
dependiente del tiempo. Esta onda puede convertirse en un espectro de seales en funcin de su
frecuencia. Para ello se utiliza una funcin matemtica conocida como Transformada de Fourier. El
resultado es lo que se conoce como un espectro de RMN (espectro de frecuencias).

RMN Multidimensional

La posibilidad de excitar la muestra con uno o ms pulsos de radiofrecuencia (RF), cada uno de ellos
aplicado con una potencia, duracin, frecuencia, forma y fase particulares, e introducirlos en momentos
especficos de tiempo durante el experimento de RMN, generalmente antes de que el sistema haya
regresado al equilibrio por relajacin, permite disear toda una gama de secuencias de pulsos de las que
se puede extraer informacin molecular muy variada.
 Una secuencia de pulsos es una distribucin en el tiempo de alguno o varios de los siguientes
elementos:

i) Un cierto nmero de pulsos de RF que afecten a uno o ms tipos de ncleos

ii) Tiempos de espera a que el sistema evolucione de una determinada forma. Estos tiempos de espera
pueden ser fijos o bien incrementables si su duracin se va aumentando a medida que se repite el
experimento.

iii) Gradientes de campo magntico

iv) Una etapa final en la que se adquiere la FID.

En un experimento de RMN multidimensional la secuencia de pulsos debe constar de al menos dos

pulsos y stos deben separados por un periodo de espera incrementable. La secuencia de pulsos se repite
un nmero de veces adquirindose una FID en cada ocasin. La fase de alguno de los pulsos puede
alterarse en cada repeticin as como incrementarse la duracin de uno o ms tiempos de espera variables.
Si la secuencia de pulsos tiene un tiempo de espera incrementable el experimento tendr dos dimensiones,
si tiene dos ser de tres dimensiones, si tiene tres el experimento ser de cuatro dimensiones. Aunque en
teora no existe lmite en el nmero de dimensiones de un experimento, experimentalmente hay
limitaciones impuestas por la consiguiente prdida de seal por relajacin que conlleva la deteccin de las
distintas dimensiones. Los tiempos de registro de los experimentos de RMN multidimensional se pueden
acortar drsticamente con las tcnicas rpidas de RMN desarrolladas en la presente dcada.

Los experimentos multidimensionales se pueden clasificar en dos tipos principales:

Experimentos de correlacin homonuclear: Son aquellos en los que todas las dimensiones corresponden
al mismo ncleo. Ejemplos: COSY (COrrelation SpectroscopY), TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY),
NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY).

Experimentos de correlacin heteronuclear: En este experimentos se obtienen espectros cuyas

dimensiones pertenecen a diferentes ncleos. Ejemplos: HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum
Correlation), HSQC (Heteronuclear Simple Quantum Correlation), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond
Correlation), HOESY (Heteronuclear Overhauser Effect SpectroscopY).

LA MUESTRA

Las muestras, generalmente, son disoluciones en disolventes que no tengan tomos de protio ( 1H).
Frecuentemente se usan el deuterocloroformo, hexadeuterodimetilsulfxido, xido de deuterio,
deuterobenceno, deuteropiridina y otros.

Adems, el equipamiento del servicio permite el estudio de muestras en estado slido. La RMN en
estado slido es una tcnica adecuada y cada vez ms utilizada para el estudio de las propiedades
estructurales de una amplia variedad de materiales amorfos o poco cristalinos. A diferencia de las muestras
en disolucin, las muestras en estado slido dan lugar a espectros con seales anchas, resultado de la
suma de diversos factores. Estos espectros, sin embargo, contienen informacin nica acerca de la
estructura y la dinmica de los materiales estudiados.

La preparacin de una muestra para Resonancia Magntica Nuclear (RMN) de lquidos normalmente
opera en la siguiente manera: Una muestra se dispone en un tubo para RMN. La muestra, tpicamente se
compone de un soluto y un solvente. El solvente es usualmente deuterado, es decir tiene deuterio ( 2 D) en
lugar de protio ( 1 H). En el tubo para RMN, con una pipeta Pasteur, se dispone una cantidad apropiada de
solucin (0,6 0,7 mL), o, de otro modo, se coloca el soluto en el tubo, luego se agrega el solvente y se
agita bien para homogenizar. En todo caso la solucin no debe presentar partculas en suspensin. Si es
necesario, la muestra puede filtrarse a travs de un algodn, previamente desengrasado con eter de
petrleo y seco. No use tubos para EPR o cualquier otro tubo diferente como un tubo para RMN. No son la
misma cosa.

La RMN en disolucin es complementaria de la cristalografa de rayos X ya que la primera permite

estudiar la estructura tridimensional de las molculas en fase lquida o disuelta en un cristal lquido,
mientras que la cristalografa de rayos-X, como su nombre indica, estudia las molculas en fase slida. La
RMN puede utilizarse tambin para el estudio de muestras en estado slido. Si bien en su estado actual
queda lejos de poder proporcionar con buen detalle la estructura tridimensional de una biomolcula.

En el estado slido las molculas estn estticas y no existe, como ocurre con las molculas en
disolucin, un promediado de la seal de RMN por el efecto de la rotacin trmica de la molcula respecto
a la direccin del campo magntico. Las molculas de un slido estn prcticamente inmviles, y cada una
de ellas experimenta un entorno electrnico ligeramente diferente, dando lugar a una seal diferente. Esta
variacin del entorno electrnico disminuye la resolucin de las seales y dificulta su interpretacin.
Raymond Andrew fue uno de los pioneros en el desarrollo de mtodos de alta resolucin para resonancia
magntica nuclear en estado slido. l fue quien introdujo la tcnica de la rotacin en el ngulo mgico
Magic Angle Spinning (MAS) que permiti incrementar la resolucin de los espectros de slidos varios
rdenes de magnitud. En MAS, las interacciones se promedian rotando la muestra a una velocidad de
varios kilohertzios.

TECNICAS

Alex Pines en colaboracin con John Waugh revolucionaron tambin la RMN de slidos introduciendo la
tcnica de la polarizacin cruzada (CP) que consigue incrementar la sensibilidad de ncleos poco
abundantes gracias a la transferencia de polarizacin de los protones a los ncleos ms insensibles
cercanos, generalmente 13C, 15N o 29Si.

A caballo entre la RMN en disolucin y en fase slida, se encuentra la tcnica de HR-MAS (High
Resolution with Magic Angle Sinning), cuya aplicacin fundamental es el anlisis de geles y materiales
semislidos. El fundamento del HR-MAS es hacer girar la muestra, al ngulo mgico, a una velocidad muy
superior que en slidos habituales. El efecto conseguido son espectros mono y bidimensionales de gran
calidad, prxima a la RMN en disolucin. La principal aplicacin de esta tcnica es el anlisis de matrices
biolgicas y polimricas, como resinas para sntesis en fase slida solvatadas.

En el estado slido las molculas estn estticas y no existe, como ocurre con las molculas en
disolucin, un promediado de la seal de RMN por el efecto de la rotacin trmica de la molcula respecto
a la direccin del campo magntico. Las molculas de un slido estn prcticamente inmviles, y cada una
de ellas experimenta un entorno electrnico ligeramente diferente, dando lugar a una seal diferente. Esta
variacin del entorno electrnico disminuye la resolucin de las seales y dificulta su interpretacin.
Raymond Andrew fue uno de los pioneros en el desarrollo de mtodos de alta resolucin para resonancia
magntica nuclear en estado slido. l fue quien introdujo la tcnica de la rotacin en el ngulo mgico
Magic Angle Spinning (MAS) que permiti incrementar la resolucin de los espectros de slidos varios
rdenes de magnitud. En MAS, las interacciones se promedian rotando la muestra a una velocidad de
varios kilohertzios.

EL ESPECTRO

Los espectros ms comunes son representaciones de la intensidad de absorcin frente a la frecuencia

de resonancia (generalmente a travs del parmetro ) y presentan seales cuya posicin, forma y tamao
estn ntimamente relacionadas con la estructura molecular. El anlisis detallado de estos espectros
proporciona valiosa informacin estructural y estereoqumica. Espectros bidimensionales permiten
relaciones entre distintos ncleos o distintas magnitudes del mismo ncleo.

1. A partir de la frmula molecular:

 a. Calcular el nmero de insaturaciones que posee el compuesto cuya estructura se quiere elucidar.
Este nmero de instauraciones puede indicar la presencia de anillos, dobles o triples enlaces. El nmero de
instauraciones se calcula segn la siguiente expresin: g = N tomos de C +1- 2 n tomos H + n tomos
halgeno - n tomos N.

b. Relacionar las reas de integracin de los picos con el nmero de totales de protones de la estructura
para obtener el nmero de protones que representa cada pico individual.

2. La presencia de un singulete ancho en el espectro podra deberse a protones de NH o OH. Si el

singulete ancho se encuentra ms all de 10 ppm es probable que se trate de un OH de cido

3. Las seales entre 10 y 9 son indicativas de la presencia de un aldehdo.

4. Las seales que aparecen entre 8 y 7 indican la presencia de un anillo aromtico.

5. Las seales entre 6 y 5 indican la presencia de protones olefnicos. Mediante el valor de la

constante de acoplamiento se puede deducir si la olefina es cis o trans.

6. Las seales entre 4 y 3 indican que hay protones en un carbono unido a un grupo electronegativo
como es el oxgeno o un halgeno.

7. La presencia de una seal alrededor de 2.5 se debe al protn de un alquino terminal.

8. Las seales que aparecen entre 2.5 y 2.1 pueden indicar la presencia de protones adyacentes a un
grupo carbonilo.

EFECTO OVERHAUSER

El efecto nuclear Overhauser (NOE en ingls) consiste en la transferencia de la polarizacin de espn

nuclear de una poblacin de espines a otra, va relajacin nuclear cruzada. Este efecto es aprovechado por
distintas tcnicas de RMN multidimensional para la elucidacin de estructuras tridimensionales de
compuestos orgnicos.

El NOE es til para la espectroscopa de RMN para la asignacin de estructuras. En dicha aplicacin, el
NOE difiere del acoplamiento espn-espn en que el NOE ocurre a travs del espacio, no a travs de
enlaces qumicos. De este modo, tomos prximos en el espacio pueden dar un NOE, mientras que el
acoplamiento de espn solo es observado cuando los tomos estn conectados por 2-3 enlaces qumicos.
Las distancias interatmicas derivadas del NOE a menudo ayudan a confirmar la estructura tridimensional
de una molcula. En 2002, Kurt Wtrich recibi el Premio Nobel de Qumica por demostrar que el NOE
poda ser aprovechado usando espectroscopia de RMN bidimensional para determinar la estructura
tridimensional de macromolculas biolgicas en disolucin.

Algunos ejemplos de tcnicas experimentales de RMN bidimensional que aprovechan el NOE incluyen
espectroscopa de efecto nuclear Overhauser (NOESY), espectroscopa de efecto nuclear Overhauser
heteronuclear (HOESY), espectroscopa rotatoria de efecto nuclear Overhauser (ROESY), efecto nuclear
Overhauser transferido (TRNOE) y eco de gradiente de espn NOE en campo de doble pulso (DPFGSE-
NOE).

El NOESY consiste en la determinacin de las orientaciones relativas de los tomos en una molcula,
produciendo una estructura tridimensional.

HOESY es NOESY de correlacin cruzada entre tomos de diferentes elementos.

ROESY implica el bloque de la magnetizacin del espn para evitar que valga 0, lo cual se usa para
molculas en las que el NOESY normal no es aplicable.
 TRNOE mide el NOE entre dos molculas diferentes que interactan en la misma disolucin, como por
ejemplo una protena y su ligando.

NOESY

El primer pulso crea magnetizacin transversal que evoluciona segn su desplazamiento qumico
durante el periodo de marcaje de frecuencias.

El segundo pulso generar magnetizacin longitudinal.

El tiempo de mezcla concluye con un tercer pulso que convierte la magnetizacin longitudinal en
transversal que es observable

VENTAJAS

En la actualidad, la espectroscopa de RMN puede determinar las estructuras de protenas slo

relativamente pequeos (<de 40 kD), pero su poder de resolucin es cierto a aumentar. El poder de RMN
ha sido muy mejorada por la capacidad para producir protenas marcadas de manera uniforme o en sitios
especficos con 13 C, 15 N, y 2 H con el uso de recombinante de ADN tecnologa.

La Resonancia Magntica Nuclear (RMN) es la herramienta analtica que proporciona mayor informacin
estructural y estereoqumica en un tiempo asequible.

La tcnica no es destructiva y tiene aplicaciones en todas las reas de la Qumica y en algunas de la

Biologa. Disponiendo de accesorios adecuados permite la observacin de tejidos (accesorio de
microimagen).Con otros tipos de instrumentos es una tcnica de diagnstico en Medicina.

Las interacciones responsables del ensanchamiento de las seales son la anisotropa del
desplazamiento qumico, los acoplamientos dipolares (homo y heteronucleares) y el acoplamiento
cuadrupolar. Se han desarrollado tcnicas que permitan obtener espectros de alta resolucin conservando
en lo posible la informacin que aportan estas interacciones: giro con ngulo mgico (MAS, Magic Angle
Spinning), polarizacin cruzada (CP, Cross Polarization) o secuencias multipulso especficas para slidos
(CRAMPS, Combined Rotation and Multiple Pulse Spectroscopy).

El desarrollo de los mtodos indicados anteriormente ha permitido el uso de la RMN en estado slido
para el estudio estructural de sustancias poco solubles, como polmeros, vidrios, cermicas, resinas, etc.,
siendo una alternativa muy interesante para materiales de baja cristalinidad que no pueden ser estudiados
por tcnicas de difraccin. Tambin permite el estudio de factores dinmicos difcilmente observables por
otras vas. Existe, as mismo, gran nmero de estudios realizados sobre materiales biolgicos: virus,
molculas fibrilares (seda, colgeno, celulosa), protenas, carbohidratos...o compuestos con fines
farmacuticos (estudio de polimorfos).

La tcnica aporta una informacin complementaria a otras ms convencionales en la caracterizacin de

fases condensadas. Por una parte, permite el estudio a corto alcance de materiales estructuralmente
desordenados y, por otra, diferencia tomos con nmeros atmicos similares.