ANTIOXIDANT ASSAY

JOON-KWAN MOON AND TAKAYUKI SHIBAMOTO. Antioxidant Assays for Plant and
Food Components. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 16551666

Terdapapt dua tipe pengujian antioksidan umum yang biasa digunakan untuk studi
antioksidan. Satu diantaranya adalah pengujian yang berhubungan dengan peroksidasi
lipid, yang meliputi thiobarbituric acid assay (TBA), malonaldehyde/high-performance
liquid chromatography (MA/HPLC) assay, malonaldehyde/gas chromatography
(MA/GC) assay, carotene bleaching assay, dan conjugated diene assay. Dan pengujian
lain berhubungan dengan electron atau penangkapan radikal, termasuk kedalamnya
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) assay, 2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline- 6-
sulfonic acid) (ABTS) assay, ferric reducing/antioxidant power (FRAP) assay, ferrous
oxidation-xylenol orange (FOX) assay, ferric thiocyanate (FTC) assay, and
aldehyde/carboxylic acid (ACA) assay.

1. Pengujian yang berhubungan dengan peroksidasi lipid

a. Thiobarbituric Acid (TBA) Assay

Diantarara semua pengujian yang berhubungan dengan peroksidasi lipid,
merode MA paling banyak digunakan. Metode ini sangat berguna dalam
menentukan tahap akhir dari peroksidasi lipid. Namun sangat sulit sekali untuk
dianalisis pada sampel lipid karena MA sangat larut dalam air. Kemudian mulai
dimodifikasi dengan penambahan TBA sehingga menjadi MA-TBA. Dan
kemudian ditemukan Metode TBA dapat digunakan untuk mengevaluasi
aktivitas antioksidan dari beberapa ekstrak tanaman.TBA bereaksi dengan
banyak senyawa karbonil berbeda yang terbentuk dari peroksidasi lipid, dan
menyerap panjang gelombang UV yang sama dengan MA-TBA. Namun TBA
assay tidak spesifik seperti pengujian dengan menggunakan metode MA.
O

HN

HN

O
Thiobarbituric Acid
b. Malonaldehyde/High-Performance Liquid Chromatography (MA/HPLC)
Assay.
Untuk menganalisis MA yang terbentuk dari peroksidasi lipid, HPLC telah
diterapkan sebagai metode yang lebih spesifik untuk menganalisis MA-TBA
c. Malonaldehyde/Gas Chromatography (MA/GC) Assay.
 Walaupun LC/MS akan lebih disukai sebagai metode utama untuk analisis MA-
TBA, namun system ini masih terlalu mahal dan tidak mudah diperoleh untuk
seseorang di laboratorium
d. Carotene Bleaching Assay.
Telah lama diketahui bahwa carotene bereaksi dengan radikal peroxyl
menghasilkan -carotene epoxide.oleh sebab itu carotene dikatakan sebagai
penangkap radial atau antioksidan. Kemudian metode pengujian antioksidan
menggunakan -carotene dikombinasikan dengan lipid, seperti asam linoletat.
Lipid seperti asam linoleat membentuk peroxyl radikal (LOO). Peroksil radikal
ini bereaksi dengan carotene membentuk radikal carotene yang stabil. Efek
dari adanya antioksidan sangat mudah di monitor karena adanya pemucatan
warna dari larutan yang diuji yang dapat di ukur absorbanya denga
spektrofotometer pada panjang gelombang 470 nm, yang merupakan panjang
gelombang spesifik dari carotene.
e. Conjugated diene assay
Diena terkonjugasi siap terbentuk dari moiety dengan ikatan rangkat yang
dipisahkan oleh grup metilen tunggal, yang biasa terjadi pada asam lemak
poliunsaturated karena adanya aksi dari ROS dan oksigen. Sekali diena
terkonjugasi terbentuk, hal ini dapat di monitor dengan menggunakan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 234 nm. Efek antmemonitor
pembentukan diena terkonjugasi.

2. Pengujian yang berhubungan dengan electron dan penangkapan radikal

a. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
Baru baru ini, metode DPPH menjadi sangat popular pada pengujian antioksidan
bahan alam. Salah satu alas an penggunaan metode ini adalah sederhana dan
sangat sensitive. Metode ini berdasarkan teori bahwa antioksidan adalah
pendonor hydrogen
RH
(Antioxidant)
NO2 NO2

O2N N N O2N NH N

NO2 NO2
R

Pemantauan DPPH dengan menggunakan spektrofotometri Uv

merupakan yang paling luas dan umum digunakan karena kesederhanaan dan
akurasinya. DPPH menunjukan absorpsi yang kuat maksimum pada panjang
gelombang 517 ( ungu). Warnanya berubah dari ungu menjadi kuning diikiuti
formasi DPPH pada saat mengabsorpsi hidrogen dari antioksidan. Reaksi ini
 stoikiomteri dengan jumlah atom hidrogen yang diabsorpsi, sehingga efek
antioksidan dapat dengan udah di evaluasi dengan mengikuti penurunan
panjang gelombang absorpsi UV pada 517 nm.

b. 2,2-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6 sulfonic acid) (ABTS) Assay.

O N N

S N
S O
HO
S
O S
OH
O
2,2'-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6 sulfonic acid)
Metode ABTS, atau yang biasa disebut metode radikal ABTS, telah banyak
diguanakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan pada komponen makanan
dan minuman sehubungan dengan kegunaanya pada fase aqueous dan fase
lemak. Dasarnya, metode ABTS berdasarkan aktivasi dari metmyoglobin oleh
hydrogen peroksida karena adanya ABTS. Namun, pada versi yang sudah
tingkatkan, metode ABTS ini berdasarkan karena terbentuknya radikal katin
ABTS yang stabil, yang memiliki absorpsi kromofor biru-hijau, yang diproduksi
karena oksidasi dari ABTS dengan potassium persulfate yang mengacu pada
penambahan antioksidan. Aktivitas antioksidan dari bahan alam, termasuk
karotenoid, senyawa fenolat, dan beberapa antioksidan plasma, dideterminasi
dengan adanya decolorization dari ABTS, dengan mengukur reduksi dari radikal
kation sebagai persentase hambatan dari absorban pada panjang gelombang
734 nm.
c. Ferric Reducing/Antioxidant Power (FRAP) Assay
Metode ini pertama kali dikembangkan untuk mengukur jumlah asam
ascorbat pada serum . Aktivitas antioksidan, (kemampuan untuk mereduksi)
dapat dievaluasi dengan memantau formasi dari kompleks Fe2+-TPTZ dengan
spectrophotometer. Namun, sumber antioksidan harus larut dalam air seperti
asam askorbat, asam urat, dan trolox.
d. Ferrous Oxidation-Xylenol Orange (FOX) Assay
Metode ini sebenarnya merupakan pengembangan dari determinasi lever
hidroperoxiside lipid pada system biologi seperti jaringan tanaman. Ion Ferrous
dioksidasi oleh oksidan, seperti hidroperoksida menjadi bentuk ion ferrat, yang
sesudah itu diperlakukan dengan pemberian reagen xylenol orange (XO) supaya
terbentuk kompleks ferrat-XO (biru-ungu). Kompleks ini mempunyai serapan
yang kuat pada UV yitu pada panjang gelombang 550 nm. Metode ini masih
banyak digunakan untuk mendeterminasi hidroperoksida pada berbagai sampel
biologi seperti kuning telur, aktivitas lipoxygenase pada ekstrak tumbuhan, dan
jaringan tumbuhan.
e. Ferric Thiocyanate (FTC) Assay.
Mekanisme dari metode ini hamper sama dengan metode FOX. Perbedaannya
adalah ion ferrat dibentuk oleh oxidant dari ion ferrous yang dipantau dengan
kompleks tiosianat dengan menggunakan spektrotometer pada panjang
gelombang 500nm.
 f. Aldehyde/Carboxylic Acid (ACA) Assay.
Metode ini sedikit digunakan pada penelitian. Bagaimanapun,metode ini
merupakan metode yang tepat untu mengevaluasi efek dari antioksidan dalam
menurunkan fenomena oksidasi yang terjadi selama perpanjangan waktu
simpan, seperti waktu simpan makanan.

Michael Antolovich, Paul D. Prenzler, Emilios Patsalides, Suzanne McDonald and

Kevin Robards*.Methods for testing antioxidant activity. Analyst, 2002, 127, 183
198

A. Mekanisme antioksidan
For convenience, antioxidants have been traditionally divided into two classes, primary
or chainbreaking antioxidants and secondary or preventative antioxidants. 36
Secondary or preventative antioxidants are compounds that retard the rate of oxidation.
This may be achieved in a number of ways including removal of substrate or singlet
oxygen quenching.18 Primary antioxidants, AH, when present in trace amounts, may
either delay or inhibit the initiation step
by reacting with a lipid radical or inhibit the propagation step by reacting with peroxyl
or alkoxyl radicals:36
L + AH LH + A
LOO + AH LOOH + A
LO + AH LOH + A
The antioxidant free radical may further interfere with chainpropagation
reactions by forming peroxy antioxidant compounds:
A + LOO LOOA
A + LO LOA

Metode pengujian
1. DPPH
Results were reported as the EC50, that is, the amount of antioxidant necessary to
decrease by 50% the initial DPPH concentration. The time taken to reach the steady
state to EC50 concentration (TEC50) was also calculated.