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1,2
Uria Alcolombri, Shifra Ben-Dor, 3 Ester Feldmesser, 4 Yishai Levin, 4 Dan S. Tawfik, 1 *
Assaf Vardi2 *
Las bsquedas de secuencias homologas sugieren que Alma1 representa una familia de
genes presente en mayora, globalmente distribuido taxones de fitoplancton y otros
organismos marinos.
Casi toda la actividad observada en bruto de Clulas Lysate HL373 se asoci con la
fraccin de membrana del cloroplasto y se mantuvo mediante un filtro de 100-kD,
indicando una enzima o complejo relativamente grande (ver los materiales
complementarios (SM)]. Debido a que estudios previos sugeran papeles antioxidantes
para DMSP y DMS (1) e informaron la sensibilidad redox de las liasas DMSP (18-20)
(tabla S1), probamos el efecto de la oxidacin y alquilacin de tiol tanto en el lisado bruto
como en la fraccin reconstituida con detergente. En los extractos, el H2O2 y los
modificadores de cistena yodoacetamida (IAA) y el reactivo de Ellman inhibieron la
actividad de DMSPlyase de una manera dependiente del pH. La inhibicin se podra
invertir aadiendo el agente reductor ditiotreitol (DTT) (figura 2A y figura S1). Se
identificaron propiedades bioqumicas de liasa de DMSP similares en los lisados brutos de
diferentes especies de algas (17 - 22) (tabla S1).
Las bandas de regiones del gel que no mostraron actividad se usaron de manera similar
como controles negativos (figura S4). Hemos rastreado las secuencias peptdicas contra
un conjunto de datos de protenas construido a partir de un transcriptoma de
secuenciacin de ARN (RNA-seq) de clulas HL373 y LL374 estacionarias y
exponencialmente desarrolladas (vase el SM). De 46.400 putativo transcripciones, se
obtuvo y filtrado por anotacin un conjunto de 111 protenas cuyos pptidos fueron
identificados en el MS anlisis (tabla S3). Estos 111 candidatos se puntuaron usando
varios criterios, principalmente cobertura (qu fraccin de la protena est cubierta por
pptidos identificados por MS) y abundancia de transcripcin diferencial entre las cepas
HL373 y LL374. Otros criterios incluyeron un segmento transmembrana predicho,
abundancia de transcripcin y peso molecular predicho (tabla S3).
Los genes sintticos que codifican los cinco primeros hits se sobreexpresaron en
Escherichia coli y se ensay la actividad de DMSPlyase. Uno de estos genes examinados,
XP_005784450 (ver tabla S3, contig comp92788_c0), denominado aqu Alma1, produjo
una alta actividad de liasa DMSP. Por consiguiente, la actividad altamente especfica de la
DMSP-liasa se asoci con la protena purificada
(450 mmol min - 1 mg - 1 de protena pura). Otro gen, NW_005194698.1, locus 145357-
146862 (ver tabla S3, contig comp81698_c2), exhibi una actividad muy baja e
incoherente con clulas de E. coli intactas, pero no se observ actividad en los lisados
celulares y en la protena purificada. Alma1 se anota en el genoma de E. huxleyi (16)
como un gen hipottico codificado en el gen nuclear que contiene dos intrones,
descartando as la posibilidad de un gen bacteriano procedente de un cultivo no axnico
de E. huxleyi (11). Adems, el gen Alma1 no comparte homologa con ninguna de las
DMSP bacterianas conocidas
Fig 2. Alma1 media la actividad de la liasa DMSP en HL373 Emiliania huxleyi. (A) Perfil bioqumico
de la actividad de la DMSP-liasa observada en lisados de clulas HL373 en bruto (barras negras) y
en Alma1 (barras grises) expresadas en E. coli recombinante. Las velocidades enzimticas
iniciales de liberacin de DMS se normalizaron a la velocidad en muestras sin tratamiento (n.t.).
Los datos son T media SD; N 2. Las reacciones con H2O2 o IAA se realizaron a pH = 8,5 a
menos que se indique lo contrario. Las reacciones realizadas a pH = 6,0 con H2O2 100 mM o
yodoacetamida 20 mM se normalizaron sin tratamiento a pH = 6,0. La DTT se relaciona con una
muestra tratada primero con 100 mM de H _ {2} O _ {2}, seguido por 1 mM de TTD durante 15 min.
(B) La fraccin purificada se analiz mediante ensayo de actividad en gel. La actividad de la liasa
DMSP provoca la liberacin de protones y se visualiz mediante un indicador de pH que cambiaba
su color a amarillo. El gel de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida se enjuag
subsiguientemente y se ti con plata para detectar las bandas proteicas correspondientes
(derecha).
Fig. 3. Correlacin entre la actividad de la liasa de DMSP y el nivel de expresin de
mRNA de Alma1 en diferentes cepas de E. huxleyi. (A) Los niveles de liberacin de DMS
medidos en los lisados celulares crudos de diferentes cepas de E. huxleyi mediante la
adicin de DMSP 10 mM. Los datos son T media SD; N = 2. (B) Expresin relativa de los
diferentes genes Alma en la fase de crecimiento exponencial o estacionario de las cepas
HL373 (alta DMSP liasa) y LL374 (baja DMSP liasa). Datos derivados de ARN-seq
transcriptome (vase el SM). La expresin se presenta en RPKM (lee por kilobase por
milln). Los datos son T media SD; N = 2.
Fig. 4 Un rbol filogentico de la familia Alma. (A) Vista esquemtica del rbol filogentico
de mxima probabilidad de las protenas de tipo Alma1 identificadas en NCBI y en el
Proyecto de Transcripcin de Eucariontes Microbianos Marinos
http://data.imicrobe.us/project/view/104).Los siete paralogos de E. huxleyi Se marcan con
estrellas rojas. Los genes con actividad de liasa de DMSP confirmada se marcan en
negrita (los orthologs de Isochrysis sp son 99% idnticos a alma1 o alma2 y por lo tanto
se confirman por dentity) .Las clases A a D estn sombreadas en azul claro. El outgroup
se compone de genes representativos de maleato isomerasas. (B) Alineacin
representativa de los residuos del sitio activo de Alma. MI, maleato isomerasa fuera de
grupo. (C) Actividad DMSP liasa especfica de Alma1 recombinante y sus mutantes
C108A y C265A a DMSP 10 mM. Los datos son T media SD; N = 2.
Los niveles de actividad de la liasa DMSP en varios aislados de E. huxleyi se
correlacionaron con la abundancia de protenas, como se indica mediante Western blot
usando anticuerpo contra Alma1 recombinante (figura S7). Alma1 los niveles de
transcripcin tambin fueron hasta 300 veces ms alto en HL373 en comparacin con
LL374, coherente con 10.000 veces la diferencia de actividad (Fig. 3] (17]. Por
consiguiente, los pptidos Alma1 slo fueron abundantes en muestras protemicas de
HL373 pero no pudieron detectarse en muestras LL374 (tabla S3). De forma similar, se
observaron niveles de ARNm 12 veces mayores de Alma1 en la cepa haplide de E.
huxleyi RCC1217 en comparacin con su cepa diploide relacionada E. huxleyi RCC1216
(27, 28), mientras que las actividades de DMSP-liasa en estas dos cepas diferan por un
factor de aproximadamente 2,5 (figura 3A). Alma1 no mostr cambios sustanciales en la
velocidad enzimtica a concentraciones de sal hasta 2M y a pH 6 a 8 (Figura 2A y Figura
S8). La enzima recombinante mostr un valor de actividad de especificidad (kcat / KM) de
0,8 x 105 M -1 s -1 (figura S8), ms de 1000 veces superior que la DMSP liasa D2PD (13,
25, 29).
El genoma de E. huxleyi tiene 7 parlogos de Alma (ver el SM) (Fig. 4A) (16). Sin
embargo, el anlisis de transcriptome indica que Alma1 es, con mucho, el gen Alma ms
expresado en HL373 ( 40 veces asmuchas todos los dems paralogos) (Fig. 3). Parece
que hay cuatro clados de parlogos de Alma, siendo Alma3 / 6 y Alma7 (Clade A) los ms
estrechamente relacionados con los genes Alma de Phaeocystis antarctica, otra especie
de algas formadoras de flor que posee alta actividad de DMSP liasa y grandes emisiones
de DMS (20, 22).
El Clado A (Figura 4A) tambin incluye especies de algas claves que se sabe que poseen
una alta actividad de DMSP-liasa, dinoflagelados (por ejemplo Symbiodinium sp., Un
simbionte de coral), otros haptofitos (por ejemplo Prymnesium parvum) (20, 30) Ortolos de
coral (Acropora millepora). Aunque la DMSP tambin puede ser producida por los corales
(31), se piensa que la actividad de la DMSP-liasa est asociada con algas simbiticas y /
o bacterias asociadas y no con el propio coral (32). En el clado B (Fig. Se encontraron que
tenan dos dominios de tipo Alma1 fusionados en tndem, incluyendo E. huxleyi Alma4 / 5
y el gen de Chrysochromulina polylepis. El Clado C (Figura 4A) incluye E. huxleyi Alma1 y
Alma2 que tambin aparecen en la Isochrysis estrechamente relacionada. El clado ms
distante D comprende genes bacterianos con una identidad del ~ 30% con Alma1, pero su
relevancia est an por determinar.
Hemos sintetizado cinco genes de todo el rbol filogentico y expres en E. coli (vase el
SM). Dos genes, E. huxleyi Alma2 (clado C) y Symbiodinium-A1 (cladeA) se expresaron a
niveles bajos, sin embargo, exhibieron actividad liasa al alimentar DMSP al cultivo de E.
coli (figura S10). Sin embargo, estas dos enzimas no eran suficientemente estables para
ser purificadas.