UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE MXICO

LICENCIATURA EN INGENIERA QUMICA

CURSO DE BIOQUMICA
Clase 5. Tcnicas de
anlisis de protenas

Laura Carmona Salazar

Cuatrimestre: 16-3

Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

Mtodos de Purificacin
y Anlisis de Protenas
Objetivos.
Revisar los fundamentos en los que se basan los
distintos mtodos de purificacin de protenas y
cmo la combinacin de stos permite el
enriquecimiento sustancial de una protena a partir
de una fuente natural o un organismo que la sobre
expresa.
Revisar los fundamentos de los distintos mtodos
de anlisis de protenas que permiten la
caracterizacin fisicoqumica y biolgica de
protenas.
PURIFICACIN DE PROTENAS

Lisis celular y extraccin de protenas

Precipitacin diferencial de protenas por

salado, pH y temperatura
PARA LA DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN,
ESTRUCTURA Y FUNCIN YA SEA DE UN TIPO
CELULAR, ORGANELO, BIOMOLCULA

SE REQUIERE PURIFICARSE
PARA SU ESTUDIO
REQUERIMIENTO BSICO PARA EL ESTUDIO
ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE UNA PROTENA

PURIFICACIN
CONSIDERACIONES BSICAS PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA

1. Conocer las caractersticas propias de la protena:

carga, tamao, solubilidad, localizacin celular,
funcin
2. La cantidad, es decir la abundancia celular
3. Costos
CARACTERSTICAS ESTRUCTURALES COMUNES DE LOS AMINOCIDOS

Grupo carboxilo

Grupo
amino

Carbono a
CONSIDERACIONES GENERALES PARA LA PURIFICACIN
DE UNA PROTENA

1. Definir los objetivos de la purificacin: grado de pureza, cantidad y nivel de

actividad requeridos
2. Seleccionar el material biolgico de inicio: Depender de la localizacin de la
protena tanto en tejidos como en compartimentos subcelulares
3. Desarrollar una tcnica de anlisis: Para la determinacin de la pureza, actividad o
contenido total de protena.
4. Minimizar la manipulacin de la muestra
5. Remover desde el inicio posibles contaminantes: por ejemplo proteasas
6. Reducir el uso de aditivos
7. Apoyarse en el uso de tcnicas diferentes en cada paso: Para ello se debe
considerar las propiedades fisicoqumicas de la protena.
8. Minimizar el nmero de pasos.
PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA
I. Ruptura o lisis celular
II. Centrifugacin diferencial
III. Centrifugacin en gradientes de densidad
IV. Precipitacin selectiva de protenas por
adicin de sales o solventes
V. Separacin proteica por carga, tamao
y afinidad
CRITERIOS PARA LA SELECCIN DE LA FUENTE PROTEICA

Varias pueden ser las fuentes biolgicas

Facilidad para la obtencin de la biomasa

La cantidad de la protena en el tejido o clula

Estabilidad
QU ES EL MATERIAL BIOLGICO?

QU ES EL SISTEMA BIOLGICO?
ASPECTOS BSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O
RUPTURA CELULAR

Medio homogenizacin
Ruptura celular

Medio de resuspensin
Mantenimiento de integridad
de organelos
PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA
I. Ruptura o lisis celular
II. Centrifugacin diferencial
III.Centrifugacin en gradientes de densidad
IV.Precipitacin selectiva de protenas por
adicin de sales o solventes
V. Separacin proteica por carga, tamao
y afinidad
MEDIOS DE DENSIDAD DISPONIBLES PARA LA SEPARACIN DE LOS SISTEMAS
BIOLGICOS
ALCOHOLES POLIHIDRATADOS: Son gradientes no inicos, inertes, estables y de bajo costo
Sacarosa, Sorbitol, Glicerol, Polietilenglicol PEG

POLISACRIDOS: Tienen una fuerza osmtica elevada

Ficoll (Sacarosa polimerizada con epiclorohidrina), Dextrn

MEDIOS DE SILICA COLOIDAL: No son soluciones, son suspensiones de partculas de silica

cubierta de polivinilpirrolidona PVP (15 a 30 nm de dimetro). Presentan una
fuerza osmtica baja y cambia poco con cambios en la densidad.
Percoll

GRADIENTES DE DENSIDAD MEDIA QUE CONTIENEN YODO Y SON NO-INICOS

Basados en el cido triyodobenzoico, tiene un grupo hidroflico que favorece
la solubilizacin.
Nycodenz, Optiprep

SALES INORGNICAS: Son gradientes inicos de sales de metales pesados usados para
separaciones de cidos nucleicos en gradientes isopcnicos
PUREZA

Marcadores: Actividades, caractersticas

morfolgicas o reactividad especfica
a un tipo membranal

Para qu?
Distribucin
Recuperacin
Enriquecimiento
Contaminacin
VISUALIZACIN DE LA PURIFICACIN A TRAVS DE LA TABLA DE
RECUPERACIN
DETERMINACIN DE LA CANTIDAD RECUPERADA.
CUANTIFICACIN DE LA PROTENA
Existen diversos mtodos para la cuantificacin de las protenas donde cada uno se basa en
alguna propiedad especfica de las protenas, lo cual puede tener ventajas y desventajas.

Cuantificacin por medicin de absorbencia a 280 nm: depende de la presencia de residuos aromticos
tirosina y triptfano. Tiene la desventaja de que otros componentes no proteicos pueden absorber en el
UV.

Ensayo de Biuret: Las protenas reducen los iones cprico (Cu3+) en iones cuproso (Cu1+) el cual
reacciona con los enlaces peptdicos y da una coloracin azul. Ventajas no interfiere el PEG y desventaja
a pH alcalinos hay interferencia

Ensayo de Lowry: Es una extensin del ensayo de Biuret, donde los iones cuprosos reaccionan con el
reactivo Folin-Ciocalteu formando un complejo de fosfato-tungnsteno-molibdato que da un color azul
intenso. Ventaja es ms sensible y requiere una menor cantidad de protena, pero es ms sensible a la
interferencia
Ensayo de Bradford: Es el ms ampliamente utilizado, es sensible, sencillo, rpido
y resistente a la interferencia, se basa en el colorante azul de Coomassie G-250 en
una solucin cida, conforme reacciona con las protenas se torna caf-rojizo.
Desventaja es que reacciona con las celdas de lectura para el espectroscopio.

CURVA PATRN
ENZIMTICOS: Actividad especfica asociada a un organelo
particular

RE: NADPH-citocromo c reductasa

MIT:,Cit c oxidasa,
ATPasa sensible a NaN3

GOLGI: GSI

TONOPLASTO: ATPasa sensible

a NO3-

MEMBRANA PLASMTICA: GSII,

ATPasa sensible VO43-
 FUNCIONALIDAD E INTEGRIDAD

Capacidad crear y mantener gradientes pH

Transporte de electrones

Transporte de solutos

Permeabilidad al agua (Coef.permeabilidad osmtica)

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA
I. Ruptura o lisis celular
II. Centrifugacin diferencial
III.Centrifugacin en gradientes de densidad
IV.Precipitacin selectiva de protenas por
adicin de sales o solventes
V. Separacin proteica por carga, tamao
y afinidad
MTODOS DE PRECIPITACIN SELECTIVA DE PROTENAS
Fundamento.- Para precipitar una protena se debe modificar el ambiente que le rodea,
debido a que los grupos cargados en la superficie de una protena pueden interaccionar
con las molculas de agua como con los iones que se encuentran en solucin.

TODA MOLCULA SE ENCUENTRA SOLVATADA

PRINCIPIOS DE PRECIPITACIN DE PROTENAS POR SALES

SALTING IN
Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la
concentracin de sales.

SALTING OUT
Disminuye la solubilidad cuando se aumenta en exceso la
concentracin de sales y entonces precipitan. Es decir, se basa en la
exclusin del cosolvente, en este caso la sal.

La precipitacin con Sulfato de amonio (NH4)2SO4

es el mtodo ms ampliamente utilizado
 POR QU EL SULFATO DE AMONIO?

Se pueden utilizar aniones y cationes polivalentes y monovalentes, la preferencia es

un anin polivalente y un catin monovalente.

Preferencia de la serie Hofmeister de aniones en concentraciones molares equivalentes:

citrato > sulfato> fosfato > cloruro > nitrato > tiocianato

Tendencia de la estabilidad de las protenas

Considerando que es muy utilizado, se han diseado tablas

y frmulas para determinar las concentraciones de (NH4)2SO4
que se pueden emplear para adicionar a las protenas
y obtener una concentracin especfica.
TCNICAS PARA EL DESALADO
Una vez que se ha precipitado la protena por sales, el siguiente paso consiste en
Remover la sal de la muestra:

DILISIS: Celulosa o celofn con un poro determinado

ULTRACENTRIFUGACIN
PRINCIPIOS DE PRECIPITACIN DE PROTENAS
POR SOLVENTES
Las protenas se mantienen en solucin por la interaccin de los grupos hidroflicos
de su superficie con el solvente

Si la polaridad del solvente se reduce por la adicin de un

solvente orgnico menos polar que el agua, MENOR
la protena se vuelve menos soluble ESTABILIDAD

LA PRECIPITACIN POR SOLVENTES SE REALIZA CON TEMPERATURAS BAJAS

PRECIPITACIN DE PROTENAS POR SOLVENTES
Los dos solventes ampliamente utilizados son el Etanol y la Acetona

Ambos logran precipitar adecuadamente a la s protenas, pero la Acetona preserva

mejor las propiedades de las protenas

Los rangos de temperatura usualmente utilizados son:

Temperaturas cercanas a 0 oC hasta -20 oC

Para la recuperacin de la protena se debe centrifugar y puede resuspenderse en un

amortiguador apropiado

Desventaja: Bajos rendimientos y puede haber desnaturalizacin

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA

I. Ruptura o lisis celular

II. Centrifugacin diferencial
III.Centrifugacin en gradientes de densidad
IV.Precipitacin selectiva de protenas por
adicin de sales o solventes
V. Separacin proteica por carga, tamao
y afinidad
TCNICAS DE ELECTROFORESIS
Y CROMATOGRAFA
ESQUEMA GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA