Komposisi kimia senyawa volatil dalam dua ekor rumput laut merah, Pterocladiella capillacea dan

Osmundaria obtusiloba, menggunakan spektrometri massa kromatografi gas headspace statis.

Abstrak Volatile organic compounds (VOCs) dari rumput laut merah Pterocladiella capillacea dan
Osmundaria obtusiloba diperoleh dengan ekstraksi headspace statis dan kemudian dianalisis secara
kualitatif dengan spektrometri massa kromatografi gas (GC-MS) dan secara kuantitatif dengan
kromatografi gas (GC) yang dilengkapi dengan detektor ionisasi api (FID). Secara total, 31 konstituen
diidentifikasi pada dua spesies alga. Pada P. capillacea, di antara 21 isolat (100%), yang utama adalah
heksanal (50,4%), 2-pentilfuran (9,2%), dan heptadecene (8,8%). Pada O. obtusiloba, dari 21
konstituen ( 100%), yang paling representatif adalah heptadecene (57,3%), heksanal (20,5%), dan 1-
pentadecene (2,6%). Ini adalah laporan pertama tentang identifikasi dan kuantifikasi VOC di
Rhodophyta, P. capillacea dan O. obtusiloba.

Pengantar

Laut dan samudra menutupi 70% permukaan bumi dan merupakan rumah bagi sekitar 200.000
spesies rumput laut dan invertebrata laut, seperti spons, okular, ascidia, bryozoans, teripang, serta
ribuan mikroorganisme. Ekosistem yang sangat beragam ini adalah sumber senyawa biologis yang
kaya. Organisme laut yang tinggal di habitat kompleks dan terkena kondisi ekstrim (faktor abiotik
dan biotik), sehingga menghasilkan berbagai zat aktif potensial dan spesifik, yang tidak dapat
ditemukan di lingkungan lain (Costa-Lotufo et al., 2009; Gressler et al. 2009; Blunt et al., 2015;
Hamed et al., 2015).

Organisme laut menghasilkan berbagai macam senyawa organik volatil (volatile organic compounds
/ VOCs), yaitu molekul kecil dari kelarutan air rendah sampai sedang dan tekanan uap tinggi, dan
yang dapat dengan mudah melintang membran sel untuk dilepaskan ke lingkungan. Dalam
ekosistem terestrial, VOC memainkan peran penting dalam interaksi antara feromon serangga dan
tanaman yang menjadi daya tarik penyerbukan. Selain itu, mereka bertindak sebagai perantara agen
interaksi tritropik (tumbuhan, herbivora, dan musuh alami), yaitu ketika tanaman diserang oleh
serangga herbivora, ia mengeluarkan sinyal volatil yang menarik parasitoid, yang membunuh
herbivora, melindungi tanaman dari herbivora. Meskipun diketahui pentingnya VOC, walaupun
nonspesifik, dalam ekologi kimia terestrial, peran mereka di jaring makanan laut sebagian besar
tidak diketahui. Namun, ada kemungkinan VOC dapat memainkan fungsi daya tarik dan pertahanan
dalam ekosistem perairan (Fink 2007).

Rumput laut dapat menghasilkan banyak metabolit sekunder volatil, seperti senyawa halogenasi dan
sulfur, thiocompounds, hidrokarbon, fenol, aldehid, keton, asam, ester, dan terpen. Produksi VOC ini
sangat terkait dengan fisiologi spesies. Sebagai organisme vegetatif, selama siklus hidupnya, alga
harus menyesuaikan diri dengan kondisi stres abiotik, seperti dehidrasi, suhu, dan komposisi garam
air (Gressler et al., 2009; Ferraces-Casais et al 2013).

Studi tentang VOC yang ada pada rumput laut melibatkan metode ekstraksi dan konsentrasi
konvensional yang lambat, memerlukan pelarut organik mahal dan berbahaya, dapat menyebabkan
kerugian selama ekstraksi, dan masih memerlukan sejumlah besar biomassa untuk analisis.
Kelemahan ini dieliminasi dengan penggunaan teknik ekstraksi gas, yang disebut headspace
sampling, yang digunakan dengan kromatografi gas kapiler (GC) untuk analisis fraksi volatile dalam
banyak sampel (Snow and Slack 2002). Ekstraksi headspace adalah metode sederhana yang tidak
menggunakan pelarut; Itu tidak merusak dan hanya memerlukan sejumlah kecil biomassa untuk
analisis dan memberikan profil komponen volatil yang lebih realistis dalam sampel. Prosedur analitik
terdiri dari satu langkah, di mana sampel ditempatkan dalam botol septum yang disegel dan dibawa
ke oven dengan pengatur suhu. Dalam sistem ini, komponen volatil yang dilepaskan dari sampel
ditangkap dan, bila ekuilibrium fasa terbentuk di bawah kondisi isotermal, bagian atmosfer yang
jenuh dengan VOC dikumpulkan dengan jarum suntik dan disuntikkan ke dalam kolom kromatografi
gas - sistem spektrometri massa (GC-MS) untuk analisis kualitatif (Kolb 1999; Vitenberg 2003; Gress,
2009; Ferraces-Casais et al 2013; Aleksic and Knezevic 2014; Hung et al., 2015).

Studi yang mempertimbangkan VOC di tanaman yang lebih tinggi adalah hal yang biasa (Diniz et al.,
2008), namun langka untuk rumput laut (Gressler et al., 2009; Ferraces-Casais et al 2013). Ini adalah
laporan pertama tentang identifikasi dan kuantifikasi VOC di rumput laut merah Pterocladiella
capillacea dan Osmundaria obtusiloba dengan menggunakan GC yang digabungkan dengan
spektrometri massa (MS) dan detektor ionisasi nyala (FID).

Bahan dan metode

Spesimen rumput laut merah Pterocladiella capillacea (S. G. Gmelin) Santelices & Hommersand
dikumpulkan pada bulan Maret 2008, di Pantai Pacheco, Kotamadya Caucaia, Negara Bagian Cear.
Spesimen rumput laut merah Osmundaria obtusiloba (C. Agardh) RE Norris dikumpulkan pada bulan
September 2010, di Pantai Paracuru, Kotamadya So Gonalo do Amarante, Negara Bagian Cear,
keduanya dalam kondisi air surut, dengan izin dari Institut Lingkungan Brasil Dan Sumber Daya Alam
Terbarukan (SISBIO 33913-1).

Ganggang dikumpulkan, dicuci dengan air suling untuk menghilangkan kotoran dan epifit
makroskopik, dan kemudian ditempatkan pada kertas penyerap untuk menghilangkan kelebihan air
dan membeku pada suhu -24 C sampai analisis.

Spesies diidentifikasi di Departemen Teknik Perikanan, Universitas Federal Cear. Spesimen voucher
P. capillacea dan O. obtusiloba disimpan di Herbarium Prisco Bezerra, Departemen Biologi di
universitas yang sama, masing-masing nomor 447310 dan 56432.

Ekstraksi senyawa organik volatil (VOC) dengan metode headspace statis

Aliquot sampel segar P. capillacea (0,7929 g) dan O. obtusiloba (0,9104 g) ditempatkan secara
terpisah di dalam dua botol borosilikat dengan kapasitas 20 mL, yang disegel dengan tutup sekrup
aluminium, dilengkapi septum silikon dilapisi Teflon Untuk mencegah pelarian dari VOC. Kemudian,
botol-botol tersebut ditempatkan di atas nampan ekstraksi dan injeksi otomatis, yang disebut AOC-
PALM 5000, dan diinkubasi pada suhu 100 C selama 15 menit di bawah pengadukan. Suhu dan
waktu ditetapkan mengikuti manual pengguna peralatan.

Kondisi kromatografi

Kromatografi gas spektrometri massa (GC-MS)

Analisis kualitatif VOC dilakukan pada GC-MS (Shimadzu, GC / MS-QP 2010 Ultra) dengan kolom
kapiler silika nonpolar Restek Rtx-5 ms (30 m 0,25 mm i.d. ketebalan film 0,25 m). Volume
injeksi adalah sampel 2000 L dengan rasio 1: 5.
Kromatografi dilakukan dengan menyesuaikan suhu injektor pada suhu 250 C dan suhu detektor
pada suhu 290 C. Gas pembawa yang digunakan adalah helium dengan aliran 1,28 mL min-1. Suhu
oven awalnya disimpan pada suhu 30 C selama 1 menit, dan kemudian diprogram untuk
meningkatkan gradien 4 C min-1 antara 30 dan 180 C dan 20 C min-1 antara 180 dan 280 C,
yang dipertahankan. Selama 5 menit Spektrum massa dicatat dalam mode dampak elektron (70 eV)
dari 30 sampai 450 Da, dan tingkat pemindaiannya adalah 0,30 scan s-1.

Setiap puncak dalam kromatogram berhubungan dengan senyawa, yang diidentifikasi berdasarkan
indeks retensi (mempertimbangkan rangkaian homolog C8-C26 n-alkana), dan pada Kovats Index (IK)
dengan membandingkan pola fragmentasi khas masing-masing senyawa pada massa Spektrum
diendapkan dalam database virtual dan yang dilaporkan dalam literatur (Adams 2012).

Kromatografi gas (GC) dilengkapi dengan detektor ionisasi nyala (FID)

Analisis kuantitatif dilakukan pada GC yang dilengkapi dengan FID menggunakan kolom kapiler silika
nonpolar Restek Rtx- 5 ms (30 m 0,25 mm i.d. ketebalan film 0,25 mM) dengan kondisi yang
sama seperti GC-MS. Jumlah relatif VOC yang ada dalam alga, dinyatakan dalam persentase, dihitung
berdasarkan area puncak pada kromatogram tanpa menggunakan faktor koreksi, dengan
mempertimbangkan luas total puncaknya sebesar 100%.

Hasil dan Diskusi

VOC yang diidentifikasi pada P. capillacea dan O. obtusiloba ditunjukkan pada Gambar. 1. Kedua
spesies tersebut menunjukkan 21 konstituen, mewakili 100% komposisi kimia masing-masing alga.
VOC yang diidentifikasi termasuk dalam tiga kelompok kimia: aldehida, keton, dan hidrokarbon,
seperti ditunjukkan pada Tabel 1 dan 2. Komposisi VOC dari P. kapilerena mengungkapkan 71,9%
aldehida, keton 6,3%, hidrokarbon 10,6%, dan 11,2% Senyawa lainnya Keempat senyawa utama
adalah heksanal (50,4%), 2-pentilfuran (9,2%), heptadeken (8,8%), dan benzaldehida (6,1%) (Tabel
1). Dalam O. obtusiloba, konstituen terdiri dari 30% aldehida, keton 1,8%, hidrokarbon 65,4%, dan
2,8% senyawa lainnya. Tiga senyawa utama dalam spesies ini adalah heptadecene (57,3%), heksanal
(20,5%), dan 1 - nonadecene (4,2%) (Tabel 2).

Dari aldehida yang diidentifikasi dalam P. kapiler (10) dan di O. obtusiloba (9), heksanal adalah
senyawa utama (Tabel 1 dan 2).

Ara. 1 Kromatogram senyawa organik volatil (VOC) dari rumput laut merah Pterocladiella capillacea
(a) dan Osmundaria obtusiloba (b) diperoleh dengan kromatografi gas - spektrometri massa (GC-MS)

Tabel 1 Komposisi kimia senyawa organik volatil (VOC) dari rumput laut merah Pterocladiella
capillacea

Metode Identifikasi RT VOCS Kandungan relatif (%)

Indeks Retensi menurut literatur (Adams 2012)

B Identifikasi berdasarkan spektrum massa yang diperoleh dari Perpustakaan NIST

C Identifikasi berdasarkan spektrum massa yang diperoleh dari literatur (Adams 2012)

Tabel 2 Komposisi kimia senyawa organik volatil (VOC) dari rumput laut merah Osmundaria
obtusiloba

Hexanal juga diidentifikasi pada Rhodophyta Ceramium virgatum (Horincar et al., 2014), Palmaria
palmata (Le Pape et al., 2004), dan Chondrus crispus (Pina et al., 2014); Di Chlorophyta Ulva
(Enteromorpha) linza (Patra dkk., 2015), Cladophora vagabunda dan Ulva intestinalis (Horincar et al.,
2014), dan di Ochrophyta Laminaria spp. Dan Undaria pinnatifida (Ferraces-Casais et al 2013). Ini
terbentuk dari asam linoleat melalui aksi berurut lipoxygenase / asam lemak asam urat lyase (LOX /
HPL), dengan jalur yang sama seperti yang ditemukan rekan pada tanaman yang lebih tinggi
(Boonprab et al 2006; Azarbad dan Jelen 2015).

Aldehida yang ada dalam rumput laut dapat diturunkan dari degradasi asam lemak tak jenuh ganda,
baik dengan autooksidasi atau dengan tindakan enzimatik lipoksigenase, misalnya (Le Pape et al.,
2004).

Lima keton diidentifikasi pada P. Capillacea, dua (2-heptanon dan 2,3-oktaedion) adalah yang paling
representatif (Tabel 1). Dalam O. obtusiloba, keton yang paling umum hanya menyumbang 1,8%
terhadap total persentase VOC alga tersebut (Tabel 2).

2-Heptanon terjadi secara alami pada beberapa makanan dan terdaftar dalam Food and Drug
Administration (FDA) sebagai bahan tambahan makanan, yang dapat ditambahkan langsung ke
makanan untuk konsumsi manusia. Selain itu, ia bertindak sebagai feromon pada reseptor bau
hewan pengerat dan sebagai obat bius pada penyerbu sarang (Wang et al., 2006; Gutirrez-Garca et
al., 2007; Haus 2008; Papachristoforou et al 2012).

Senyawa 2-heptanone juga diidentifikasi dalam Rhodophyta C. virgatum (Horincar et al., 2014), di
Chlorophyta Cladaphora vagabunda dan U. intestinalis (Horincar et al., 2014), di dalam U.
(Enteromorpha) linza (Patra et Al. 2015), dan di prolifera Ulva, U. linza, dan Monostroma nitidum
(Yamamoto et al., 2014).

-Ionone diidentifikasi pada dua spesies alga yang dipelajari, P. kapiler dan O. obtusiloba. Senyawa
ini juga diidentifikasi pada Rhodophyta C. crispus dan Plocamium cartilageneum dan pada
Chlorophyta C. vagabunda, C odiumtomentosum, U. linza, Monostroma nitidum, dan U. prolifera
(Valento et al., 2010; Horincar et al., 2014; Pina Et al 2014, Yamamoto et al 2014. Patra dkk 2015).

Keton lainnya juga diidentifikasi dalam penelitian ini (2, 3- oktiledion dan -ionone) ditemukan pada
Chlorophyta U. prolifera, U. (Enteromorpha) linza, dan M. nitidum (Yamamoto et al., 2014).

Beberapa keton yang diidentifikasi dalam alga berasal dari asam amino, sementara yang lainnya
berasal dari oksidasi asam lemak atau karotenoid (Le Pape et al., 2004; Yamamoto et al., 2014). Asal
mereka masih sedikit mengerti.

-Ionon, geranylacetone, pseudoionone, -ionone, dan 3- hydroxy--ionone, hadir dalam beberapa

spesies tanaman, terbentuk dari degradasi karotenoid (Lashbrooke et al 2013). Kelompok pigmen
alami ini dapat disintesis oleh alga, terlibat dalam penangkapan cahaya, sebagai pigmen aksesori,
dan dalam protoproteksi, mengikis radikal bebas yang mampu menyebabkan kerusakan pada
jaringan tanaman (Vishnevetsky et al, 1999; Gammone dan D'Orazio 2015; Michalak dan Chojnacka
2015).

Ada laporan dalam literatur bahwa aldehid dan keton hadir pada sebagian besar rumput laut berasal
dari degradasi asam lemak tak jenuh dan karotenoid (Izzreen dan Ratnam 2011; Horincar et al.,
2014).

Pada kedua spesies tersebut, P. kapiler dan O. obtusiloba, hidrokarbon asiklik dengan dominasi
heptadeken diidentifikasi. Tidak banyak informasi tentang terjadinya senyawa ini dalam rumput laut;
Ditemukan di Rhodophyta Kappaphycus alvarezii, di Chlorophyta Caulerpa lentillifera, dan di
Ochrophyta Nizamuddinia zanardinii (Izzreen dan Ratnam 2011; Firouzi et al 2013).

Bagi Yamamoto dkk. (2014), asal sebagian besar hidrokarbon tidak diketahui. Bagi peneliti lain,
hidrokarbon berasal dari degradasi karotenoid dan asam lemak. Hidrokarbon sangat umum terjadi
pada alga laut dan memainkan peran penting dalam proses reproduksi, bertindak sebagai pembawa
pesan kimia pada gamet laki-laki (Le Pape et al., 2004; Horincar et al., 2014).

Alkohol, 1-okten-3-ol, yang diidentifikasi dalam P. capillacea dan O. obtusiloba, juga telah terdeteksi
di U. intestinalis, C. vagabunda dan C. virgatum (Horincar et al., 2014), C. crispus ( Pina et al 2014),
dan Laminaria spp. (Takahashi et al 2002). Senyawa ini terkait dengan bau alga dan, walaupun
asalnya tidak diketahui, ada kemungkinan diturunkan dari penguraian asam hidrokarbon peroksida
sekunder (Le Pape et al., 2004).

Pada gilirannya, 2-pentylfuran dan trans-2- (2-pentenyl) furan diidentifikasi pada P. capillacea (Tabel
1), sementara hanya yang pertama diidentifikasi pada O. obtusiloba (Tabel 2). Furan ini telah
ditemukan di Rhodophyta C. crispus, K. alvarezii, di Chlorophyta C. vagabunda dan U. intestinalis,
dan di dalam Ochrophyta Sargassum polycystum (Izzreen dan Ratnam 2011; Horincar et al., 2014;
Pna et al., 2014). ). Menurut Gu et al. (2013), furan terdiri dari keluarga bahan kimia penting dalam
pembentukan rasa kepiting dan bersumber dari degradasi oksidatif asam linolenat.

Rhodophyta adalah kelompok alga terkaya untuk keragaman dan kelimpahan metabolit sekunder.
Menurut kajian oleh Pereira dkk. (2011), turunan isoprena dan asetaminin adalah kelas utama
senyawa kimia yang ada dalam alga yang mengekspresikan tindakan defensif terhadap konsumen
potensial.

Di rumput merah P. palmata, dikumpulkan di Pleubian, Prancis, tiga puluh tiga VOC diekstrak dengan
ruang kepala yang dinamis dan diidentifikasi oleh CG-MS, termasuk tujuh senyawa halogenasi, tujuh
aldehida, dua keton, tiga alkohol, dan empat hidrokarbon. Diantaranya, alga yang paling khas,
terutama rumput laut merah, adalah senyawa halogenasi, termasuk iodoetana, diklorometana,
triklorometana, 2-fluoroprop-1-ene, iodopentana, chlorobenzene, dan tribromomethane (Le Pape et
al., 2004).

Menurut Horincar dkk. (2014), beberapa senyawa volatil yang ditemukan di rumput laut memiliki
aplikasi industri sebagai aditif di industri makanan, farmasi, atau kosmetik.

Rumput laut merupakan waduk alami senyawa bioaktif dengan potensi tinggi untuk aplikasi
makanan dan farmasi. Sejumlah kecil ganggang laut Brasil telah diperiksa untuk VOC, menggunakan
ekstraksi headspace statis dan analisis kromatografi oleh GC-MS dan GC yang digabungkan dengan
FID. Juga, ini adalah laporan pertama identifikasi dan kuantifikasi VOC pada P. capillacea dan O.
obtusiloba. Teknik ini, cocok untuk menentukan VOC pada rumput laut segar, menyajikan
keuntungan seperti kebutuhan sampel kecil, penanganan sampel minimal, ekstraksi gas satu
langkah, kecepatan, dan pelarut bebas.
Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengeliminasi mekanisme yang terlibat dalam
produksi, penyimpanan, dan pengangkutan metabolit sekunder, serta untuk mengungkapkan
signifikansi ekologi VOC dan aktivitas biologis.

Konsulusi

Ini adalah laporan pertama tentang identifikasi dan kuantifikasi VOC dalam ekstrak rumput laut P.
kapilacea dan O. obtusiloba dengan menggunakan ekstraksi headspace statis dan analisis
kromatografi oleh GC-MS dan GC yang digabungkan dengan FID. Teknik ini menunjukkan bahwa
senyawa utama termasuk dalam tiga kelompok kimia: aldehid, keton, dan hidrokarbon.

Ucapan Terimakasih Para penulis ingin mengucapkan terima kasih atas hibah dan dukungan finansial
yang diterima dari Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq),
Fundao Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (FUNCAP), dan
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal De Nvel Superior (CAPES) dari Pemerintah Brasil. AH
Sampaio dan CS Nagano adalah peneliti senior CNPq (Brasil).