Dr Nemanja Rajevi

Biohemijska i molekularna sistematika biljaka

Veba 7 Molekularne metode u sistematici - izolacija biljne DNK

Molekularne metode u sistematici biljaka

Za razliku od morfolokih karaktera koji su lako dostupni, da

bismo doli do nukleinskih kiselina, neophodno je primeniti
sledee molekularne metode: Hloroplast

1. Ekstrakcija DNK Jedro

2. Amplifikacija eljenog regiona (PCR)

3. Elektroforeza i/ili sekvenciranje Mitohondrija

Ekstrakcija DNK
Slino kao u biohemijskoj sistematici, i ovde moramo sebi Drugaije reeno, u 1 g mladog tkiva lista e se nai daleko
postaviti tri pitanja: vei broj ivih elija nego u 1 g odraslog lista. Ovo je posebno
bitno kada se radi istraivanje jedarnog genoma poto se u
ta? DNK svakoj eliji nalazi samo po jedna kopija.
Pored listova, mogu se koristiti i drugi organi. Koren, seme,
Gde? u svim ivim elijama*
stablo, rizom itd. Osnovni problemi u ekstrakciji DNK iz svih ovih
organa je postojanje velikog broja mrtvih elija ili elija sa
Kad? dok je tkivo mlado
izuzetno zadebljalim zidovima i velike koliine metabolita koji se
akumuliraju u ovom tkivu.
* Ukoliko elimo da izolujemo specifini genom, npr. hloroplastni, tkivo iz
kojeg izolujemo ovaj genom mora da poseduje plastide to nije sluaj sa Za DNK analizu je najbolje imati sve materijal, meutim ovo
svim elijama! je veoma retko sluaj pa se za ekstrakciju najee koristi suvi.
Na terenu se delovi biljke mogu odmah zamrznuti u tenom
Iako se DNK nalazi u svim ivim elijama, i moemo je azotu (-196 C). No, znatno ee se ubrani biljni materijal stavlja
izolovati iz bilo kog biljnog organa, najee ekstrakciju vrimo u kesice sa silikom gde e ga zrnca silike veoma brzo isuiti. Ovaj
iz mladih listova i pupoljaka. U biohemijskoj sistematici smo korak je izuzetno bitan jer po smrti elije dolazi do oslobaanja
uzorkovali biljni materijal u fazi kada je imao najveu koliinu velikog broja enzima i drugih reaktivnih hemijskih jedinjenja
sekundarnih metabolita, kako bi ih to lake izolovali i (posebno iz vakuole) koje vre degradaciju DNK. Da bi spreili
identifikovali. Meutim, sekundarni metaboliti u molekularnoj njenu hemijsku degradaciju neophodno je da se ti enzimi
sistematici predstavljaju zagaenje. Dakle, jedan od glavnih zaustave bilo zamrzavanjem na izuzetno niskim
razloga to ekstrakciju DNK radimo iz mladih listova i pupoljaka temperaturama ili isuivanjem. Najdugotranije uvanje biljnog
lei u injenici da su oni relativno siromani primarnim i materijala se postie liofilizacijom. DNK moemo izolovati i iz
sekundarnim metabolitima. Drugi razlog zbog kojeg se koriste je herbarizovanog materijala, ali tada moramo da raunamo da je
i koliina DNK. U mladim listovima ima vrlo malo neivih elija, a materijal do izvesnog stepena oteen.
s druge strane elije koje ine mlado tkivo su sitnije, sa tanjim
elijskim zidovima i manjim vakuolama.

Ovaj dokument je namenjen studentima Biolokog fakulteta za kurs Biohemijska i molekularna sistematika biljaka, kao kratki podsetnik gradiva obraenog
na vebama, te predstavlja samo dopunu zvaninoj literaturi.
 Ekstrakcija DNK

Mladi listovi (ili drugi biljni organi koji su nam dostupni) se

moraju homogenizovati kako bi doli do same DNK.
Homogenizacija je prvi korak u ekstrakciji ukupne DNK iz biljne
elije. Razvijen je veliki broj metoda za homogenizaciju biljnog
materijala, ali se u odnosu na pristup ona moe podeliti na
fiziku i hemijsku homogenizaciju. U oba sluaja zadatak je isti
raskinuti elijski zid i ostale membrane koje se nalaze oko DNK.
Hemijska homogenizacija je bazirana na reakcijama enzimatskog
razlaganja elijskog zida i membrana ovojnica. Osnovni
nedostatak ove metode je to se dobija jako malo DNK. Iz tog
razloga, znatno rairenija je fizika homogenizacija koja se
bazira na mehanikom raskidanju svih ovih membrana. Fizika
homogenizacija moe biti runa (spraivanjem smrznutog
materijala u avanu) ili mainska, nekom od dostupnih ureaja za
homogenizaciju poput TissueLyser-a
U biljnoj eliji se nalaze tri razliita genoma. Svaki od ovih
genoma je "upakovan" u razliite elijske organele. Svaka od CTAB protokoli CTAB je katjonski deterdent koji rastvara
njih ima sopstveni lipo-proteinski omota, dok je cela biljna elija membrane i formira komplekse sa DNK
dodatno zatiena elijskim zidom. Svi ovi omotai, ali i brojni SDS-Kalijum Acetat protokoli alternativa CTAB protokolu
primarni i sekundarni metaboliti koji se nalaze u eliji dodatno u isto vreme dolazi do precipitacije proteina i polisaharida
oteavaju ekstrakciju iste DNK. Zbog velike varijabilnosti, pre pod visokim koncentracijama kalijum-acetata uz prisustvo
svega u sastavu i koliini sekundarnih metabolita kod razliitih SDS-a
vrsta, razvijen je itav niz protokola za ekstrakciju. No, svi oni
Protokoli bazirani na izolacijama celih organela ne dolazi
imaju iste ciljeve: da uklone elijski zid i membrane, odvoje
do interakcije DNK u organeli sa RNK iz citosola kao i drugim
nukleinske kiseline od primarnih i sekundarnih metabolita i
kontaminantima
ouvaju njihov integritet tokom ekstrakcije.
Pored protokola za izolaciju, danas su komercijalno dostupni
kitovi za izolaciju DNK. Ovi kitovi omoguavaju lako izolovanje,
rad sa netoksinim hemikalijama i jednostavno dobijanje velike
koliine DNK. Osnovni nedostatak je njihova cena.

65oC 4oC

SEVAG C3H7OH
K
DN
CTAB protokol PCR
EtOH
Doyle i Doyle (1987) CTAB NaCl
dH2O
K

K
DN
DN
K

K
DN

DN

1. Ekstrakcija 2. Centrifugiranje 3. Preiavanje 4. Precipitacija2 5. Rastavaranje 6. RNAza

DNK

1.U tubu sa spraenim biljnim materijalom se doda 750l 2%
CTAB deterdenta (za uklanjanje polisaharida) i -
merkaptoetanol (ili BSA, DTT, itd. za uklanjanje polifenola).
Tube se inkubiraju 60 minuta na 65oC uz povremeno
meanje. U svaku tubu nakon inkubacije se doda SEVAG (24
hloroform : 1 izoamilalkohol) za uklanjanje proteina i
drugih neistoa.
2.Tube se centrifugiraju 10 min na 13.000 rpm
3.Odvaja se supernatant u kome se nalazi DNK i prebacuje
se u nove tube gde se dodaje izopropanol koji e da izvre
taloenje DNK kao i NaCl koji e da pobolja rastvorljivost
polisaharida u alkoholu i tako ih ukloni. Ekstrakt stoji 60
minuta na 4oC a potom se centrifugira kako bi se DNK
istaloila na dno tubice.
4.Dodaje se hladni etanol kako bi izvrio precipitaciju DNK.
Nakon kratkog stajanja, tubice se centrifugiraju a
supernatant paljivo odvaja kako bi ostao DNK pelat na dnu.
5.Kad je DNK pelat suv dodaje se dejonizovana sterilna voda
(200l) i rastvara se DNK.
6.Nakon 12h mirovanja, dodaje se RNAza i inkubira 30
minuta na 37oC kako bi RNAza izvrila digestiju RNK.
7.Nakon inkubacije, meri se koliina i istoa izolovane DNK.

2
 Kontaminanti u ekstrakciji DNK

PROBLEM REENJA
Nevidljivi i teko se uklanjaju. Visoke koncentracije soli: Visoka koncentracija NaCl (>0,5M) poveava
1. POLISAHARIDI

Veoma vrste se vezuju za DNK i pastvorljivost polisaharida u etanolu

ometaju ili potpuno
CTAB: Katjonski deterdent: u rastvorima siromanim jonima a bogatim
onemoguuju aktivnost enzima
NaCl formira nerastvorljive komplekse sa proteinima i veinom kiselih
poput: polimeraze, restrikcionih
polisaharida, dok DNK ostaje rastvorena u rastvoru
endonukleaza itd.

Nalaze se u vakuli. U polifenole Dodavanje antioksidansa kako bi se spreila njihova oksidacija Polivinil-
spadaju: flavonoidi, terpenoidi, pirolidon ili Polivinil-polipirolidon
tanini... Po oslobaanju iz
PVP(P) je adsorbent koji na niskim pH formira komplekse sa
vakuole oksidaze iz citosola ih
2. POLIFENOLI

polifenolinim jedinjenjima putem vodoninih veza i dozvoljava njihovo

oksiduju, a oksidovani polifenoli
stupaju u ireverzibilne interakcije
sa DNK i izazivaju tamnjenje DNK
pelata.
odvajanje od DNK
-MERKAPTOETANOL spreava polimerizaciju tanina koji bi spreili
izolaciju DNK na isti nain kao i polisaharidi. -merkaptoetanol takoe
ima mogunost raskidanja disulfidnih veza pa se koristi i za
preiavanje ekstrakta od proteina

Spreavaju ili oteavaju 1. SDS ili DDT taloe proteine

enzimatske reakcije. Neki vre 2. -merkaptoetanol raskida disulfidne veze
3. PROTEINII

digestiju DNK molekula 3. Fenoli i hloroform taloe proteine. Fenoli se ne mogu koristiti kod
biljaka bogatih fenolnim jedinjenjima jer s njima grade komplekse!
4. Katjonski deterdent (CTAB) u rastvorima siromanim jonima, a
bogatim NaCl formira nerastvorljive komplekse sa proteinima

Doprinosi pogrenom merenju RNAza enzim koji vri digestiju RNK

koncentracije DNK i ometa
4. RNK

precizno generisanje
molekularnih markera

nekad je neophodno izolovati Pre homogenizacije materijala se izoluje jedro u puferima sa

istu jedarnu DNK, u tom sluaju osmoprotektantima (osmoza, saharoza) i membranskim stabilizatorima
5. Vanjedarna DNK

su mitohondrijalna i hloroplastna (spermin, spermidin, polilizin...) koji stabiliu jedarne membrane

DNK kontaminanti Nekad se koristi i TRITON X-100 koji lizira mitohondrijalne i hloroplastne
membrane.
Nakon izolovanja jedra, vri se izolacija DNK uz preiavanje
Jedarni pelat dobijen nakon centrifugiranja se lizira koristei pufer za
liziranje a DNK se dobije ekstrakcijom sa cezijum-hloridom

Kojom god da smo metodom izolovali DNK, pre dalje analize
neophodno je utvrditi koncentraciju DNK u dobijenom vodenom
rastvoru kao i njenu istou. Za odreivanje koliine se
najeee koristi kvantifikacija pomou UV-Vis
spektrofotometra.
Osnovni princip: nukleinske kiseline apsorbuju UV svetlost
odreenih talasnih duina. Maksimum apsorpcije je na 260 nm.
Dakle, to je apsorpcija na 260 nm vea, to je vea koliina DNK.
Eksperimentalno je utvreno da pri koncentraciji od 50 ng/l,
dvolanana DNK ima apsorbancu jednaku jedinici.
Osnovni problem je to i RNK i DNK apsorbuju podjednako
na talasnoj duini od 260 nm. Takoe, kao to moete da vidite
na slici, i polifenoli imaju jedan od maksimuma apsorpcije na
260 nm. Da bi to preciznije odredili kolika je koliina DNK u
ekstraktu, kao i prisustvo kontaminanata, apsorbanca se meri na
jo nekoliko talasnih duina: 230, 270 i 280 nm. Proteini imaju
maksimum apsorpcije na 280 nm, dok polifenoli imaju jo jedan
maksimum na 270 nm. Drugim reima, odnos apsorbanci na
odreenim talasnim duinama ukazuje na odreeno zagaenje.
Odnos absorbanca:
A260/A280 treba da je u opsegu od 1,7 do 2,0 manja od 1,7
kontaminacija proteinima, vea od 2,0 kontaminacija RNK.
Odnos absorbanca A260/A230 treba da je u vei od 1,7 manja
znai kontaminacija polisaharidima
Odnos absorbanja A260/A270 treba da je u opsegu 1,2 do 1,3,
van opsega kontaminacija polifenolima
Druge metode: elektroforeza na gelu, restrikciona digestija,
HPLC, PCR amplifikacija...