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MICOLOGIA PAMR

Fecha: Agosto 2011


GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
MANUAL DE MEDIOS Y Versin: 02
RED DE MICOLOGIA REACTIVOS
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MANUAL DE MEDIOS Y

REACTIVOS DEL

LABORATORIO DE MICOLOGIA

RED DE MICOLOGIA

GCBA

Elaborado por: RNegroni, L.Guelfand, M.C.Perrone Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM


Fecha: 6 de mayo 2008 Fecha: Agosto 2011
Version original
Revisado por: A. Romeo, L. Guelfand
Fecha: Julio 2011
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INDICE

1.- REACTIVOS PARA OBSERVACION MICROSCOPICA


1.1 HIDRXIDO DE POTASIO (KOH) al 40% ..................................................................... pg. 6

1.2 .a HIDRXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER.................................................... pg. 6

1.2 .b HIDRXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER modificada..

1.3 HIDROXIDO DE POTASIO CON DIMETILSULFXIDO ............................................... pg. 7

1.4 BLANCO CALCOFLUOR............................................................................................... pg. 7

1.5 TINTA CHINA.................................................................................................................. pg. 8

1.6 COLORACIN DE GIEMSA........................................................................................... pg. 9

1.7 GRAM............................................................................................................................ pg. 10

1.8 AZUL DE METILENO ................................................................................................... pg. 12

1.9 KINYOUN ..................................................................................................................... pg. 13

1.10 GRAM-WEIGERT ....................................................................................................... pg. 14

1.11.a GROCOTT-METENAMINA PLATA ......................................................................... pg.15

1.11.b COLORACIN ABREVIADA DE GROCOTT .......................................................... pg.18

1.12 AZUL DE O TOLUIDINA modificado ......................................................................... pg.19

1.13 INMUNOFLUORESCENCIA (para Pneumocystis spp) ........................................... pg.20

1.14 PAS (Acido peridico Schiff) .................................................................................... pg.21

1.15 MUCICARMIN DE MAYER.......................................................................................... pg.23

1.16 ALCIAN BLUE DE LISON ........................................................................................... pg.24

2.- LQUIDOS PARA MONTAR CULTIVOS


2.1 AZUL DE LACTOFENOL .............................................................................................. pg.25
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2.2 COLORANTE DE GUEGUEN ....................................................................................... pg.26

3.- SOLUCIONES DE TRABAJO


3.1 SOLUCION MADRE DE ANTIBITICOS ..................................................................... pg.26

3.2 SOLUCIONES MADRES DE VITAMINAS .................................................................... pg.27

3.3 SOLUCIN MADRE DE CICLOHEXIMIDA .................................................................. pg.27

4.- MEDIOS DE CULTIVO


4.1 AGAR GLUCOSADO DE SABOURAUD...................................................................... pg.28

4.2 AGAR SABOURAUD DEXTROSA ............................................................................... pg.28

4.3 AGAR MIEL DE SABOURAUD..................................................................................... pg.29

4.4 LACTRIMEL................................................................................................................... pg.29

4.5 AGAR BANANA-AVENA-LECHE ................................................................................. pg.30

4.6 AGAR PAPA GLUCOSADO ......................................................................................... pg.30

4.7 AGAR CEREBRO CORAZN....................................................................................... pg.30

4.8 AGAR V8........................................................................................................................ pg.31

4.9 MEDIO DE GORODKOWA............................................................................................ pg.31

4.10 MEDIO DE THAYER-MARTIN..................................................................................... pg.32

4.11 AGAR AGUA ............................................................................................................... pg.32

4.12 AGAR CZAPEK ........................................................................................................... pg.32

4.13 AGAR SABOURAUD CON CICLOHEXIMIDA Y CLORANFENICOL........................ pg.33

4.14 AGAR PAPA- ZANAHORIA ........................................................................................ pg.33

4.15 AGAR DIXON Modificado .......................................................................................... pg.33

4.16 MEDIO Dermatophyte Test Medium (DTM) .............................................................. pg.34


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5.- MTODOS DE PRESERVACIN DE CULTIVOS


5.1 MTODO DE SABOURAUD ......................................................................................... pg.35

5.2 MTODO DE CASTELLANI O DEL AGUA DESTILADA ............................................ pg.36

5.3 PRESERVACIN DE CEPAS POR CONGELACIO..................................................... pg.36

6.- PRUEBAS PARA IDENTIFICACIN DE ESPECIES FNGICAS


6.1 PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO (TG).................................................................. pg.37

6.2 AGAR HARINA DE MAIZ CON TWEEN 80.................................................................. pg.37

6.3.a AGAR CROMOGNICO PARA LEVADURAS .......................................................... pg.38

6.3.b AGAR CROMOGNICO MODIFICADO (CMA)..pg.38

6.3.c AGAR CREMOPHOR EL (EL SLANT) pg.39

6.3.d AGAR TWEEN ESCULINA (TE SLANT) pg.39

6.4 AGAR LECHE CON TWEEN 80.................................................................................... pg.39

6.5 AGAR SEMILLA DE GIRASOL..................................................................................... pg.40

6.6. a AGAR TABACO ....................................................................................................... pg.41

6.6. b AGAR TABACO Modificado .................................................................................... pg42

6.7 AGAR DE STAIB (Guizotia abyssnica) ................................................................... pg.42

6.8 MEDIO DE SALKIN ...................................................................................................... pg.43

6.9 MEDIO CGB................................................................................................................... pg.44

6.10 MTODOS PARA LA DETECCIN DE UREASA...................................................... pg.44

6.10.1 UREA DE CHRISTENSEN ....................................................................................... pg.45

6.10.2 TEST DE UREA RAPIDO ......................................................................................... pg.45

6.10.3 TABLETAS DE UREA (Rosco) .............................................................................. pg.45

6.11 ASIMILACION DE TREHALOSA RAPIDA ................................................................. pg.46


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7.- HEMOCULTIVOS
7.1 TUBOS PARA LA RECOLECCIN DE HEMOCULTIVOS.......................................... pg.46

8.- REACTIVOS PARA INMUNODIAGNSTICO


8.1 MEDIO PARA INMUNODIFUSIN (ID) ........................................................................ pg.46

8.2 AGAROSA PARA CONTRAINMUNOELECTROFORESIS (CIE) ................................ pg.47

9.- MEDIOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFNGICA


9.1 MEDIO DE SHADOMY Modificado .............................................................................. pg.48

9.2 MUELLER HINTON CON GLUCOSA Y AZUL DE METILENO ................................... pg.48

9.3 MEDIO RPMI PARA REALIZAR CIM ........................................................................... pg.49


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1.- REACTIVOS UTILIZADOS PARA OBSERVACION MICROSCOPICA

1.1 HIDRXIDO DE POTASIO (KOH) al 40%

Principio
El KOH disuelve la queratina y aclara la preparacin sin afectar la morfologa de
los elementos fngicos, permitiendo una mejor visualizacin de los mismos.

Preparacin del reactivo


Hidrxido de potasio (lentejas) ------------------------------ 40 g *
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Conservar a temperatura ambiente. Para la obtencin de preparaciones ms
duraderas, agregar glicerina al 10% que reduce la evaporacin.

Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.

Descripcin de la tcnica
Colocar una gota de KOH 40% en el centro de un portaobjetos limpio, ubicar la
muestra en el KOH y cubrir con cubreobjetos. Dejar digerir 10 min. El efecto
aclarante se acelera calentando la preparacin suavemente a la llama hasta el
desprendimiento de las primeras burbujas.

Resultado
Los dermatofitos se observan como hifas hialinas, tabicadas y ramificadas de 4 a 6
m de dimetro. Las levaduras se visualizan como elementos esfricos u ovalados
(blastosporos) que pueden presentar brote y/o seudohifas. Los hongos miceliales
se ven como hifas hialinas o pigmentadas, tabicadas o no, de dimetro irregular
segn el hongo al que corresponde.

Nota: Se puede utilizar concentraciones de OHK de 10 al 40%, para ello solo


se debe pesar 10, 20 o 30 gr y asi obtener una solucion de OHK al 10%, 20%
o 30%.

1.2.a HIDRXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER SUPER QUINK de


PARKER (azul negro permanente)
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Principio
dem 1.1. La tinta azul negra pigmenta la pared de los hongos y permite una mejor
visualizacin de los mismos.

Preparacin del reactivo


Hidrxido de potasio al 40% ----------------------------------10 ml
Tinta azul negra permanente* (Quink de Parker)--------10 ml
Conservar a temperatura ambiente

(*) Puede ser otro color de tinta, pero debe ser como Permanente y Quink-
Parker

Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.

Descripcin de la tcnica
dem 1.1

Resultado
Los filamentos y levaduras toman la tinta y aparecen color azul. Es particularmente
til para la deteccin de Malassezia spp en escamas cutneas.

1.2.b HIDRXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER SUPER QUINK de


PARKER modificado

Principio
dem 1.2.a. Para mantener los preparados por varios dias, se debe incluir glicerina

Preparacin del reactivo


Solucin I:
Hidrxido de potasio al 20% ------------------------------- 100 ml
Glicerina--------------------------------------------------------- 10 ml
Mantener a temperatura ambiente por 1 ao.

Solucin de trabajo:
Solucin I------------------------------------------------------------ 1,5 ml
Cartucho de Tinta negra permanente(Quink Parker)---- 1,0 ml
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Conservar a temperatura ambiente

(*) Puede ser otro color de tinta, pero debe ser como Permanente y Quink-
Parker

Control de Calidad
dem 1.2.a

Descripcin de la tcnica
dem 1.2.a

Resultado
dem 1.2.a

1.3 HIDROXIDO DE POTASIO CON DIMETILSULFXIDO (DMS)

Principio
dem 1.1. El agregado de DMS reduce o elimina la necesidad de calentar el
preparado

Preparacin del reactivo


Hidrxido de potasio --------------------------------------------- 20 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Dimetilsulfxido al 40% -------------------------------------- 100 ml
Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo.

Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.

Descripcin de la tcnica
dem 1.1 realizando la primera observacin, sin calentar el preparado a la llama.

Resultado
dem 1.1

1.4 BLANCO CALCOFLUOR (Calcofluor white) (CFW)


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Principio
El CFW es un colorante fluorocrmico no especfico, que se une a la quitina y
celulosa de la pared de los hongos. Tiene el inconveniente de exigir para la
observacin del preparado, la utilizacin de un microscopio de fluorescencia. Ha
sido recomendado para el estudio de las muestras poco parasitadas. De los
diversos fluorocromos usados, el Blankophor tiene la ventaja de disolverse con
facilidad en el KOH.

Preparacin del reactivo


Solucin A:
Calcofluor white MR2 ---------------------------------------- 100 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml

Calentar suavemente. Conservar en frasco color caramelo


Solucin B:
Hidrxido de potasio 10%-40%

Control de Calidad
Seguir el procedimiento utilizando una Candida albicans ATCC. Se debe observar
una fluorescencia brillante de las clulas de levaduras. Eliminado:
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.

Descripcin de la tcnica
Mezclar una gota de solucin A con una gota de solucin B sobre un portaobjetos,
ubicar la muestra y colocar un cubreobjetos. Calentar suavemente sobre la llama,
incubar de 5 a 10 min y observar el preparado con microscopio de fluorescencia,
bajo luz UV, rango 300 a 440nm (segn la marca del microscopio empleado).

Resultado
Las formas fngicas exhiben en su permetro fluorescencia azul brillante

1.5 TINTA CHINA (TCH)

Principio
La TCH es til para observar la presencia de la cpsula de Cryptococcus spp (Cn),
basada en la coloracin negativa. La cpsula repele las partculas de carbn de la
TCH dando un halo claro, bien demarcado alrededor de cada clula capsulada.
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Preparacin del reactivo


Puede prepararse con o sin el agregado de Tween 80 y solucin de mertiolate
comercial o preparada, que se utiliza para inhibir el desarrollo de
microorganismos.

Tinta china---------------------------------------------------------- 5 ml
Solucin fisiolgica ----------------------------------------------- 5 ml
Tween 80 --------------------------------------------------------- 0.1 ml
Solucin de mertiolato-borato de sodio -------------- 0.1 ml (*)

(*) Solucin de mertiolato-borato de sodio:


Mertiolato de sodio ------------------------------------------------- 1 g
Borato de sodio -------------------------------------------------- 1.4 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Disolver primero el borato de sodio y luego el mertiolato. Conservar a temperatura
ambiente.

Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.

Descripcin de la tcnica
Colocar una gota de TCH y luego una gota del sedimento (fluido corporal, orina,
LCR) en un portaobjetos limpio, mezclar y cubrir con cubreobjetos. Examinar al
microscopio con objetivo de 10x, 20x y confirmar con 40x.

Resultados
La presencia de levaduras con o sin brote, con halo claro alrededor de la clula
fngica que indica presencia de cpsula. Se debe tener en cuenta que los glbulos
blancos pueden repeler las partculas de carbn de la TCH, pero presentan un
halo irregular con granulaciones internas y membrana nuclear, y la imagen no se
observa tan ntida como la pared del Cn.

1.6 COLORACIN DE GIEMSA (GI)

Principio
Esta coloracin es til para bsqueda de levaduras intracelulares, como la fase
tisular del Histoplasma capsulatum (Hc) y Penicillium marneffei (Pm); observar los
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cuerpos intraqusticos (CI) (ascosporos) de Pneumocystis jirovecii (Pj), describir la


citologa de las muestras clnicas y para descartar infecciones virales producidas
por Herpes, Citomegalovirus (CMV) y Molluscum contagiosum.

Preparacin del reactivo


Metanol 100%, Giemsa diludo 1/10 con agua destilada o agua de la canilla. La
preparacin debe realizarse en el momento de usar.

Control de Calidad
No est estandarizado, sin embargo puede utilizarse un frotis de sangre y
observar la coloracin de los glbulos blancos que tendrn un citoplasma celeste
claro (mononucleares) y violeta rosado (polimorfonucleares) con sus
granulaciones caractersticas

Descripcin de la tcnica
Fijar la muestra con metanol por 1 min., luego inundar el extendido con la dilucin
de Giemsa por 20 min. Lavar el preparado con abundante agua de la canilla y
dejar secar al aire.

Resultado
Permite observar levaduras pequeas y ovales en el interior de los macrfagos.
En el caso de Hc las levaduras se tien en casquete de color azul, con un halo
claro debido a que la pared del hongo no se colorea con este colorante. En Pm las
clulas fngicas presentan en su interior un tabicamiento transversal. En los
pacientes inmunosuprimidos graves, se pueden observar estos elementos fuera
de los macrfagos. Para Pj esta coloracin tie solamente los cuerpos
intraqusticos (CI) (ascosporos) o formas trficas, observndose el citoplasma de
color celeste y pequeos ncleos de color rojo-prpura. La pared del quiste (asco)
no se tie y se ve un halo claro alrededor de los CI, observndose generalmente
en grupos o clusters y ocasionalmente en macrfagos. El porcentaje de
sensibilidad de esta tcnica para detectar Pj vara del 70 al 92% segn diferentes
autores y dependiendo del material respiratorio analizado.

1.7 GRAM (Modificado por Hucker)

Principio
Esta coloracin es utilizada para clasificar microorganismos en base a su tamao,
forma, morfologa celular y reaccin de Gram.
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Preparacin del reactivo

Solucin A-1 (Cristal violeta)


Cristal violeta ---------------------------------------------------------2g
Alcohol etlico (95%) --------------------------------------------10 ml
Disolver el colorante en el alcohol
Agua destilada--------------------------------------------------- 100ml
Filtrar por papel

Solucin A-2 (Oxalato de amonio)


Oxalato de amonio --------------------------------------------------4g
Agua destilada--------------------------------------------------- 400ml

Mezclar Solucin A-1 con A-2

Solucin B (Lugol)
Yodo --------------------------------------------------------------------1g
Yoduro de potasio ---------------------------------------------------2g
Disolver completamente en 5 ml de agua destilada
Agua destilada c.s.p ----------------------------------------- 240 ml
Bicarbonato de sodio 5% --------------------------------------60 ml
Conservar en botella de vidrio color caramelo

Solucin C (Decolorante)
Etanol 95% --------------------------------------------------------70 ml
Acetona ------------------------------------------------------------30 ml

Solucin D (Contracolor)
Safranina O (*) -------------------------------------------------------1g
Etanol 95% --------------------------------------------------------40 ml
Disolver el colorante en el alcohol
Agua destilada-------------------------------------------------- 400 ml
(*) se puede reemplazar por fucsina fenicada diluda 1/50

Como alternativas de las soluciones A-1 y A-2 puede emplearse la siguiente


solucin:
Cristal violeta -------------------------------------------------------- 5 g
Fenol ----------------------------------------------------------------- 20 g
Etanol Absoluto --------------------------------------------------10 ml
Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml
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Control de calidad
Gram Negativo: Escherichia coli ATCC 25922
Gram Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923

Descripcin de la tcnica
Preparar extendidos delgados. Fijar el material con calor metanol. Colorear con
la Solucin A por 30 segundos, lavar con agua corriente. Inundar con la Solucin
B, dejar 30 segundos y lavar con agua corriente. Decolorar 10 segundos con
Solucin C, dependiendo del grosor del preparado, lavar con agua corriente. Teir
con Solucin D durante 30 segundos, lavar con agua corriente. Secar el extendido
al aire.

Resultado
Gram positivo: Azul violeta
Gram negativo: Fucsia (de rosa a rojo)

Los hongos son Gram positivos (Ej. Candida spp) pero algunos se colorean
parcialmente (Ej. Cryptococcus neoformans), otros se observan como Gram
variable (Ej. Blastomyces dermatitidis) Gram negativo (Ej. Pneumocystis spp y
Zygomycetes).

1.8 AZUL DE METILENO (AM)

Principio
El AM tie la pared del hongo permitiendo una fcil visualizacin. Se utiliza para la
bsqueda de Malassezia spp.

Preparacin del reactivo


Azul de Metileno ---------------------------------------------------- 1 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Conservar a temperatura ambiente

Control de Calidad
Colorear una preparacin con clulas siguiendo el procedimiento y observar con
400x. Se observan clulas teidas de azul (ncleos y citoplasma) con un fondo
celeste claro

Descripcin de la tcnica
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Preparar el extendido con el producto del raspado de la lesin y suero para pegar
las escamas. Dejar secar al aire. Inundar el preparado lentamente (para no
despegar el material) con el colorante AM, dejar durante 1 minuto. Lavar el
extendido suavemente por inmersin en agua, dejar secar al aire y observar con
objetivo de 40x y de inmersin.

Se observan filamentos flexuosos, tabicados y cmulos de blastosporos esfricos


de 3 a 8 m de dimetro de color azul.

1.9 KINYOUN (Modificado para Nocardia)

Principio
Se utiliza para la deteccin de los microorganismos cido-resistentes (Ej. Nocardia
spp) y permite diferenciarlos de otros Actinomycetes.

Preparacin del reactivo


Solucin A: Fucsina fenicada
Fucsina bsica ------------------------------------------------------ 4 g
Fenol cristalizado ------------------------------------------------- 8 ml
Alcohol etlico 95% ----------------------------------------------20 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml

Disolver el colorante en el alcohol y luego agregar el agua y el fenol

Solucin B: Decolorante
Acido sulfrico concentrado------------------------------------ 1 ml
Agua destilada----------------------------------------------------99 ml
Agregar el cido al agua, no viceversa

Solucin C: Contracolor
Azul de metileno ------------------------------------------------- 2.5 g
Etanol 95% ------------------------------------------------------ 100 ml

Descripcin de la tcnica
Preparar el extendido y fijarlo a la llama, cubrir luego con papel de filtro. Inundar el
portaobjeto con la solucin A durante 5 minutos. Volcar el exceso de colorante y
lavar con agua corriente. Decolorar con la solucin B y lavar con agua. Colocar la
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solucin C por 1 minuto, lavar con agua corriente y dejar secar al aire. Observar
con objetivo de inmersin (100x).

Resultado
Los microorganismos cido resistentes se tien de color rosa a rojo. Sirve tambin
para detectar esporas sexuadas en los cultivos de levaduras.

1.10 GRAM-WEIGERT (GW)

Principio
Tie las paredes de los quistes (ascos) de Pneumocystis spp y de otros hongos.
Esta coloracin es muy til en la deteccin de Actinomycetes anaerobios
(Actinomyces spp) y aerobios (Nocardia, Actinomadura, Streptomyces,
Nocardiopsis, Rhodococcus, Arachnia y Dermatophylus)

Preparacin del reactivo


Solucin A: Eosina
Eosina Y -------------------------------------------------------------- 1 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml

Solucin B: Cristal Violeta


B1
Anilina --------------------------------------------------------------- 2 ml
Agua destilada----------------------------------------------------88 ml

B2
Cristal Violeta -------------------------------------------------------- 5 g
Etanol 95% --------------------------------------------------------10 ml

Mezclar solucin B1 y B2. Filtrar antes de utilizar. Estable por 3 meses.

Solucin C: Yodo
Yodo ----------------------------------------------------------------- 1 g
Yoduro de potasio ------------------------------------------------ 2 g
Disolver completamente en 5 ml de agua destilada
Agua destilada c.s.p. ------------------------------------------------- 300 ml

Solucin D: Anilina
Aceite de anilina -------------------------------------------------- 5 ml
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Xileno ---------------------------------------------------------------- 5 ml

Descripcin de la tcnica
Fijar los frotis y secar al aire. Colorear con Solucin A por 5 minutos y lavar con
agua corriente. Teir con Solucin B 5 minutos y lavar con la Solucin C, dejar el
yodo 5 minutos. Lavar con agua y absorber el extendido con papel secante, secar
al aire. Decolorar con Solucin D, moviendo el portaobjeto suavemente hasta que
no salga color prpura. La utilizacin de una segunda decoloracin ayuda a la
evaluacin de la coloracin. Enjuagar con xileno, secar al aire y examinar el
preparado con objetivo de inmersin (100x).

Resultados
Las paredes de los quistes (ascos) de Pneumocystis spp y el resto de los hongos,
se tien de color azul-violeta irregular. Los quistes se observan como estructuras
circulares o en forma de taza, de 5m de tamao. Las estructuras internas no se
colorean. El fondo aparece de color rosado y los ncleos celulares se tien de
rosa, pero algunos pueden retener el cristal violeta y confundirlos con quistes
(ascos) de (Pj). En nuestra experiencia, el porcentaje de sensibilidad con esta
tcnica es semejante a la coloracin de Giemsa.

1.11.a GROCOTT-METENAMINA PLATA (GMP)

Principio
Colorea la pared del hongo por la afinidad con los polisacridos. Tiene la ventaja
de teir a los hongos muertos, situacin que no ocurre con el PAS y otras
coloraciones histolgicas.

Preparacin del reactivo

A) Soluciones de stock
Pueden conservarse por tiempo indefinido

Solucin I:
Metenamina (Hexametilentetramina Urotropina) ---------3g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml

Solucin II:
Nitrato de plata ------------------------------------------------------ 5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
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Solucin IIl:
Acido crmico-------------------------------------------------------- 5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml

Solucin IV:
Brax ( uso fotogrfico) ------------------------------------------- 5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml

Solucin V:
Bisulfito de sodio---------------------------------------------------- 1 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml

B) Solucin madre de metenamina-plata

Solucin I (Metenamina 3%) -------------------------------- 100 ml


Solucin II (Nitrato de plata 5%) ------------------------------ 5 ml

Se forma un precipitado blanco que desaparece por agitacin. Es conveniente


prepararla cada vez que se realice la coloracin

C) Solucin de trabajo de metenamina-plata

Solucin madre de metenamina - plata --------------------50 ml


Solucin IV (Brax 5%) ----------------------------------------- 6 ml
Agua destilada c.s.p.--------------------------------------------50 ml
Esta solucin de trabajo debe prepararse siempre en el momento de realizar la
coloracin

D) Soluciones para los pasos optativos:

Solucin VI:
Cloruro de oro ---------------------------------------------------- 0.1 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml

Solucin VII:
Tiosulfato de sodio (Hipo) ------------------------------------- 2.5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml

Solucin VIII:
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Verde luz S.F. (amarillo) --------------------------------------- 0.2 g


Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
cido actico glacial ------------------------------------------- 0.2 ml

En el momento de usar diluir 10 ml de la solucin VIII en 50 ml de agua destilada.

Solucin IX
Alumbre de hierro1 g
Agua destilada c.s.p.100 ml

Control de Calidad
Colorear un preparado de Candida spp.

Descripcin de la tcnica
Si se utilizan cortes histolgicos, se deben desparafinar. Oxidar con el cido
crmico (Solucin III) por 1 hora, este paso se realiza colocando los portaobjetos
sobre varillas y la droga no debe recuperarse luego de su uso. Lavar durante 10
minutos con agua corriente, cuidadosamente para evitar el desprendimiento del
material (utilizar un vaso de Coplin y que el agua caiga sobre la parte trasera del
portaobjetos). Enjuagar con agua destilada.
Colocar las preparaciones sobre varillas y agar agar bisulfito de sodio (Solucin
IV) durante 1 minuto, lavar con agua corriente (en vaso de Coplin) por 10 minutos,
enjuagar varias veces con agua destilada. Colorear con la solucin de trabajo de
metenamina plata durante 1 hora aproximadamente en estufa a 50 C hasta que
los cortes tomen un color pardo dorado. Este paso es clave para el resultado de la
tcnica, por lo tanto es necesario controlar cada 15 minutos para evitar la
sobrecoloracin. Enjuagar repetidas veces con agua destilada, deshidratar
pasando por xilol y montar.

Pasos optativos

1) Virado: se puede efectuar el virado con colururo de sodio (Solucin VI)


durante 3 minutos y luego Hiposufito de sodio (Solucin VII) por 2 minutos.
Deshidratar, pasar por xilol y montar.

2) Coloracin de fondo: Se puede teir con cualquier coloracin que se desee,


incluso con colorantes azules violceos, ya que producen buen contraste con el
negro. Pero para diagnsticos difciles, es preferible no realizar coloracin de
fondo utilizar una coloracin monocromtica como el verde luz (Solucin VIII)
durante 30-45 minutos, deshidratar pasando por xilol y montar
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3) Sobreimpregnacin: En caso de sobrecoloracin argntica, se puede decolorar


con un bao de alumbre de hierro (Solucin IX) y controlar visualmente; cuando se
obtenga el tono deseado, lavar con agua destilada, deshidratar, pasar por xilol y
realizar el montaje o la coloracin de fondo.

Resultados
Los hongos se colorean de pardo dorado u oscuro debido a la impregnacin
argntica. Esta tcnica ha sido tradicionalmente considerada Gold Standard para
la visualizacin de los quistes (ascos) de Pj, los cuales se colorean de marrn
oscuro a negro y se observan con un pliegue interno (doble coma) de color negro.
Las bacterias y algunos elementos tisulares (especialmente fibras elsticas)
pueden teirse de negro o gris. Los cuerpos amilceos, frecuentemente en los
materiales respiratorios, tambin son argentfilos y pueden confundirse con
Cryptococcus y Paracoccidioides. En caso de utilizar virado, todos los hongos se
tien de negro y el resto de los tejido se decoloran ligeramente.

1.11.b COLORACIN ABREVIADA DE GROCOTT

Principio
Idem 1.11.a

Preparacin del reactivo

Solucin I:
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml
Brax al 5% (p/v) ------------------------------------------------- 6 ml

Solucin II: Madre de Metenamina-plata


Metenamina al 3% (p/v) ----------------------------------------50 ml
Nitrato de plata al 10% (p/v) ------------------------------- 1.25 ml

Solucin de trabajo: Mezclar partes iguales de solucin I y solucin II

Solucin de verde luz: Contracolor


Verde luz-------------------------------------------------------------- 2 g
cido actico----------------------------------------------------- 0.2 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
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Control de Calidad
Colorear un preparado de Candida spp.

Descripcin de la tcnica
Fijar el preparado con metanol hasta secado al aire (no lavar). Colocar cido
crmico al 10% sobre la muestra durante 15 minutos, luego lavar con agua
corriente. Si se utilizan cortes histolgicos parafinados, oxidar con cido crmico al
5% (p/v) durante 1 hora, posteriormente lavar 10 minutos con agua corriente y
enjuagar con agua destilada. Si se observa la muestra de color amarillo, agregar
bisulfito de sodio al 1% (p/v) durante 1 minuto, esto es para eliminar el exceso de
cido crmico. Lavar con agua destilada 4 5 veces. Sumergir en la solucin
colorante de metenamina-plata y calentar en microondas a una potencia de 60%
durante 20 segundos, 5 6 veces hasta que la muestra tome color pardo. Si no se
dispone de microondas agregar solucin colorante sobre la muestra y calentar con
hisopo hasta color pardo- dorado. Lavar con agua corriente, agregar tiosulfato de
sodio al 2% durante 2 a 5 minutos, para eliminar el exceso de plata, finalmente
lavar con agua corriente y contracolorear con solucin de verde luz diludo 1/20
durante 5 minutos. Se puede elegir otros contrastes como los azules rojos, pero
este es el recomendado, deshidratar, pasar por xilol 10 segundos secar y montar.
Luego observar con objetivo de 40x 100x.

1.12 AZUL DE O TOLUIDINA modificado (OT)

Principio
Colorea la pared del hongo por la afinidad con los polisacridos.

Preparacin del reactivo


Solucin A ( reactivo de sulfatacin)
cido actico glacial --------------------------------------------90 ml
cido sulfrico concentrado-----------------------------------30 ml

En un erlenmeyer sumergido en agua fra (no ms de 10C), colocar el cido


actico glacial y agregar lentamente el cido sulfrico. Conservar esta solucin a
temperatura ambiente al abrigo de la luz. Cuando toma color deber descartarse.

Solucin B:
Azul de O-toluidina ---------------------------------------------0.64 g
Agua destilada----------------------------------------------------30 ml
cido clorhdrico fumante--------------------------------------- 1 ml
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Etanol absoluto---------------------------------------------------70 ml
Colocar en un frasco color caramelo y bajo campano el azul de O- toluidina y el
agua, agitar vigorosamente hasta disolver el colorante y agregar en este orden: 1
ml de cido clorhdrico y 70 ml de etanol absoluto. Esta solucin se mantiene
estable durante 1 ao a temperatura ambiente.

Control de Calidad
Colorear un preparado con suspensin de Candida albicans, observar a 40x las
clulas de levaduras se observan de color violeta-prpura

Descripcin de la tcnica
Fijar los extendidos con alcohol etlico absoluto durante 1 minuto, secar 5 minutos.
Sumergir los vidrios en la Solucin A durante 10 minuto homogeneizar cada 5
minutos para mezclar) y lavar suavemente con agua fra durante 5 minutos. Cubrir
los extendidos con la Solucin B durante 12 minutos y luego lavar con metanol
95% por 10 segundos, pasar los extendidos por etanol absoluto otros 10
segundos, aclarar con xilol 10 segundos, secar al aire y examinar con objetivo de
inmersin (100x).

Resultados
La pared qustica (asco) del Pneumocystis se colorea de violeta-prpura y se
observa un pliegue interno (doble coma) teido de violeta oscuro.

1.13 INMUNOFLUORESCENCIA (para Pneumocystis spp)

Principio
Utiliza anticuerpos monoclonales marcados con isotiocianato de fluorescena:
tcnica de IFD (inmunofluorescencia directa). Estos anticuerpos estn dirigidos
contra la pared celular y antgenos del microorganismo. Se debe utilizar un
microscopio de Inmunofluorescencia para su observacin.

Preparacin del reactivo


Segn instrucciones del fabricante del reactivo comercial

Control de Calidad
Segn instrucciones del fabricante del reactivo comercial

Descripcin de la tcnica
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Colocar el material sobre un portaobjeto y secar al aire, luego sumergir en acetona


fra durante 15 minutos, finalmente dejar secar al aire y realizar la coloracin
segn instrucciones del fabricante.

Resultado
Se observa la morfologa caracterstica del Pneumocystis en color verde manzana
fluorescente y el fondo del preparado se observa rojizo. La sensibilidad de la
tcnica para esputos inducidos es del 90% aproximadamente.

1.14 PAS (cido peridico Schiff)

Principio
Colorea la pared del hongo por afinidad a las mucoprotenas y mucopolisacridos.

Preparacin del reactivo

Solucin A: cido peridico


cido peridico --------------------------------------------------- 0.4 g
Alcohol 95%-------------------------------------------------------35 ml
Disolver y agregar
Acetato de sodio 0.2 M ------------------------------------------ 5 ml
(27.2 g en 1000 ml de agua destilada)
Conservar y usar a temperatura ambiente (22-25C), si toma color pardo
desechar.

Solucin B: Bao reductor


Ioduro de potasio --------------------------------------------------- 1 g
Tiosulfato sdico ---------------------------------------------------- 1 g
Alcohol 96%-------------------------------------------------------30 ml
Agua destilada----------------------------------------------------20 ml
Se forma un depsito de azufre que puede despreciarse. Conservar a temperatura
ambiente (22-25C). No dura ms de 14 das.

Solucin C: Reactivo de Schiff

Fucsina bsica ------------------------------------------------------ 1 g


Agua destilada-------------------------------------------------- 400 ml
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En un erlenmeyer colocar el agua y se calienta hasta ebullicin. Se disminuye la


llama y cuando desaparece el burbujeo, se aade la fucsina. Enfriar a 50C y
filtrar.
Agregar:
Cloruro de tionilo-------------------------------------------------- 1 ml

Mantener en la oscuridad por 12 horas


Aclarar mediante agitacin durante 1 minuto con:
Carbn activado----------------------------------------------------- 2 g

Filtrar, guardar en la oscuridad a 0-4 C. Utilizar a temperatura ambiente y en la


oscuridad.

Solucin D: Azul de celestino


Alumbre de hierro------------------------------------------------ 2.5 g
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml
Disolver y dejar en reposo toda la noche a temperatura ambiente, luego agregar:
Azul de celestino R ---------------------------------------------0.25 g
Hervir durante 3 minutos, filtrar una vez fro y agregar 7 ml de glicerol

Solucin E: Anaranjado G
Anaranjado G -------------------------------------------------------- 2 g
cido fosfotngstico sol. acuosa 5%---------------------- 100 ml
Dejar en reposo y utilizar el sobrenadante.

Descripcin de la tcnica
Lavar los cortes en alcohol 70%, sumergirlos en Solucin A 5 minutos y lavar con
alcohol 70%. Llevarlos al bao reductor con la Solucin B 1 minuto y lavar con
alcohol 70%. Sumergir en Solucin C durante 20 minutos y lavar con agua
corriente durante 10 minutos. Teir con Solucin D de 5 a 6 minutos. Diferenciar
en alcohol cido al 1%, lavar con agua corriente 30 minutos. Colorear el fondo con
la Solucin E durante 10 segundos. Lavar en agua hasta que los cortes queden de
color amarillo plido (30 segundos). Deshidratar, pasar por xilol, agregando lquido
de montar y cubrir con un cubreobjetos.

Resultados
Las mucoprotenas y mucopolisacridos neutros se tien de color rojo prpura
intenso. Permite visualizar con mayor detalle la pared de Coccidioides spp y
contrastarlo con los esporos. En la histoplasmosis es la tcnica por eleccin para
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cortes histolgicos, debido a que se observa con nitidez la pared del hongo en
negativo, en contraste con la membrana plasmtica bien teida. Colorea bien la
cpsula gelatinosa de Cryptococcus neoformans. En paracoccidioidomicosis,
aspergilosis, candidiasis y maduromicetomas los resultados son muy buenos pero
no alcanzan a superar los obtenidos con la coloracin de metenamina-plata.

1.15 MUCICARMIN DE MAYER

Principio
Colorea los mucopolisacridos de la cpsula de Cryptococcus spp en los cortes
histolgicos.

Preparacin del reactivo


Solucin A: hematoxilina frrica de Weigert
A-1
Hematoxilina --------------------------------------------------------- 1 g
Alcohol 95%----------------------------------------------------- 100 ml
A-2
Cloruro frrico (sol. Acuosa 29%)4 ml
Agua destilada----------------------------------------------------95 ml
cido clorhdrico concentrado1 ml

En el momento de usar mezclar partes iguales de A-1 y A-2

Solucin B: Colorante Mucicarmn


Carmn----------------------------------------------------------------- 1 g
Cloruro de aluminio anhidro ---------------------------------- 0.5 g
Agua destilada----------------------------------------------------20 ml
Para disolver los componentes agitar constantemente sobre un mechero con llama
pequea.

Solucin C: Amarillo-Metanil
Amarillo-metanil -------------------------------------------------25 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
cido actico glacial ----------------------------------------- 0.25 ml

Preparar el colorante en un tubo de ensayo y calentar suavemente en la llama


hasta que se torne siruposo y negro. Agregar 100 ml de alcohol 50%, dejar
reposar 24 horas, filtrar y diluir con agua.
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Descripcin de la tcnica

Tener preparados cortes parafinados de 6 micrmetros. Pasar los cortes como es


habitual por xilol y la serie de alcoholes y finalmente por agua destilada. Colorear
durante 7 minutos con la Solucin A, lavar en agua 5 a 10 minutos y teir con
Solucin B por 30 a 60 minutos o ms si fuera necesario. Lavar rpidamente en
agua destilada y agregar durante 1 minuto la Solucin C. Rpidamente enjuagar
con agua y pasar por alcohol 95%. Deshidratar, pasar por xilol y montar.

Resultados
La mucina se colorea en rosa intenso rojo, los ncleos en negro y otros
elementos en amarillo.

1.16 ALCIAN BLUE DE LISON

Principio
Colorea loa mucopolisacridos de la cpsula de Cryptococcus spp en los cortes
histolgicos.

Preparacin del reactivo


Fijador
Bouin, Bouin-hollande, formol al 10%, formol neutro, buffer fosfatos, alcohol-
formol-actico.

Solucin A:
Alcian blue BG al 1% (solucin acuosa) -------------------50 ml
cido actico al 1% (solucin acuosa) ---------------------50 ml
Filtrar
Timol ---------------------------------------------------------------15 mg

Solucin B:
Fast red 5 B ------------------------------------------------------50 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml

Solucin C:
cido fosfomolbdico ----------------------------------------------- 1 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
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Hematoxilina de Mayer (Hemalumbre de Ehrlich)


Alumbre de hierro------------------------------------------------ 2.5 g
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml
Disolver y dejar en reposo toda la noche a temperatura ambiente.

Descripcin de la tcnica
Tener preparados cortes parafinados. Pasar los cortes del agua al hemalumbre
dejndolos actuar 10 a 15 minutos, lavar hasta obtener un color azul, teir con la
Solucin A durante 10 minutos y enjuagar con agua destilada. Agregar la Solucin
C por 10 minutos, lavar rpidamente en agua destilada y teir con la Solucin B
durante 10 a 15 minutos, enjuagar y montar.

Resultados
Los ncleos teidos en rojo prpura, los grnulos de mastocitos, mucina,
sustancia basal de los cartlagos y ciertos tipos de fibras conjuntivas se observan
en verde azulado. Las fibras de colgeno y huesos se tien en rojo cereza y el
citoplasma y msculo en amarillo plido.

2. LQUIDOS PARA MONTAR CULTIVOS

2.1 AZUL DE LACTOFENOL (LPCB)

Principio
Esta solucin es muy til para examinar el material fngico tomado de los cultivos.
El fenol mata el hongo, el cido lctico es un agente aclarante que preserva la
estructura del hongo, la glicerina previene la desecacin y el azul de algodn o
cotton blue colorea la quitina y celulosa del hongo.

Preparacin del reactivo


Solucin A
Fenol en cristales ------------------------------------------------- 20 g
cido lctico-------------------------------------------------------20 ml
Glicerina------------------------------------------------------------40 ml

Mezclar bien

Solucin B
Azul cotton de Poirrier -----------------------------------------0.05 g
(o Azul de Anilina)
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Agua destilada c.s.p.--------------------------------------------20 ml

Mezclar bien Solucin A y Solucin B, conservar a temperatura ambiente por ms


de 6 meses.

Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 40x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias

2.2 COLORANTE DE GUEGUEN

Principio
Este lquido resulta til para montar el material fngico tomado de los medios de
cultivo

Preparacin del reactivo


Azul cotton de Poirrier -----------------------------------------0.10 g
Sudn III ----------------------------------------------------------0.10 g
Tintura de iodo fresca --------------------------------------20 gotas
cido lctico----------------------------------------------------- 100 ml
Disolver en un mortero el Sudn III con el cido lctico, pasarlo a un erlenmeyer y
calentar hasta obtencin de un lquido lmpido de color cereza. Dejar reposar 24
horas, disolver en un mortero el azul cotton de Poirrier con el Sudn III-lctico,
agregar el iodo y filtrar por lana de vidrio. Conservar en frasco color caramelo.

Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 40x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias

3.- SOLUCIONES DE TRABAJO

3.1 SOLUCION MADRE DE ANTIBITICOS (SMA)

Cloranfenicol --------------------------------------------------------- 1 g
Estreptomicina* -------------------------------------------------- 0.5 g
Agua destilada estril----------------------------------------- 100 ml
Se mantiene en heladera. Se adiciona a los medios de cultivo en concentracin
final de 100 g / ml
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*Puede utilizarse otro aminoglucsido

3.2 SOLUCIONES MADRES DE VITAMINAS

Se utiliza el Agar Trichophyton (Difco), disponible comercialmente

A) Tiamina (Clorhidrato) --------------------------------------10 mg


Agua destilada pH: 4-5 --------------------------------------- 100 ml

B) I-Inositol ----------------------------------------------------- 250 mg


Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Esterilizar en autoclave a 120 C durante 10 minutos y conservar a 4C (heladera)

C) cido nicotnico ---------------------------------------------10 mg


Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Esterilizar en autoclave a 120C durante 10 minutos y conservar a 4-5C
(heladera)

D) I-Histidina --------------------------------------------------- 150 mg


Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Esterilizar en autoclave a 120C durante 10 minutos y conservar a 4-5C
(heladera)

3.3 SOLUCIN MADRE DE CICLOHEXIMIDA

Cicloheximida----------------------------------------------------- 1 mg
Acetona pura------------------------------------------------------- 3 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Disolver la cicloheximida en acetona pura y luego agregar agua destilada.
Tener mucho cuidado por la toxicidad de la cicloheximida

4.- MEDIOS DE CULTIVO

Consideraciones generales
Los medios de aislamiento primario deben tener un pH: entre 6.5 y 7.2. Las
condiciones cidas que se utilizan en algunos medios de cultivo, son para inhibir el
crecimiento bacteriano, pero tambin disminuye el desarrollo de algunos hongos.
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Por lo tanto, es preferible agregar agentes antibacterianos (100 g / ml de


cloranfenicol/estreptomicina) al medio de cultivo, para reducir la contaminacin
bacteriana.

4.1 AGAR GLUCOSADO DE SABOURAUD (SDA)

Principio

Medio poco utilizado ya que normalmente se usa la modificacin de Emmons.


Puede no crecer Blastomyces dermatitidis. Disponible comercialmente

Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 40 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 15 g
Agua deionizada --------------------------------------------- 1000 ml
Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolucin completa. Esterilizar a
121C durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado
Modificacin: Aadir SMA (100 g/ml)

Control de calidad
Aspecto: medio slido, mbar, transparente
pH final a 25C: 5.6 0.2
Trichophyton mentagrophytes: Crece
Staphylococcus epidermidis: Inhibicin parcial o total en el medio con cloranfenicol

4.2 AGAR SABOURAUD DEXTROSA modificado por Emmons (SABE)

Principio

Es el medio estndar para la recuperacin y mantenimiento de una gran variedad


de hongos aislados de materiales clnicos. Tiene como ventaja su simple
preparacin y la obtencin de colonias con caracteres macroscpicos tpicos, su
desventaja radica en que al tener una fuente de carbohidratos fcilmente utilizable
por los hongos, estos desarrollan vegetativamente en forma exuberante pero con
escasa fructificacin, lo cual limita la identificacin de la especie fngica.

Preparacin del medio


Dextrosa ------------------------------------------------------------ 20 g
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Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
pHfinal: 6.8-7.0
Disolver los ingredientes calentando hasta ebullicin, distribuir 7 ml por tubo de
ensayo y autoclavar a 120 C, 15 minutos, enfriar los tubos en posicin inclinada
(pico de flauta, sin fondo).

Modificacin: Aadir SMA (50 mg/l)

Control de Calidad
Aspecto: medio slido, mbar, transparente
PH final a 25C: 7.0 0.2

Aspergillus spp. : Crece


Staphylococcus epidermidis: inhibicin parcial o total en el medio con cloranfenicol

4.3 AGAR MIEL DE SABOURAUD (SAB+M)

Miel de abejas ----------------------------------------------------40 ml


Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Extracto de levaduras --------------------------------------------- 5 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p.1000 ml
Disolver los ingredientes calentando hasta ebullicin
Enfriar y tomar el pH: 6.8-7.0

Agregar Carbonato de Calcio.5 gr


Mezclar y distribuir 7 ml por tubo de ensayo y autoclavar a 121 C 15 minutos.
Enfriar los tubos en posicin inclinada.

Modificacin: Aadir SMA (100 g/ml)

4.4 LACTRIMEL (LAC)

Miel de abejas ----------------------------------------------------40 ml


Harina de trigo----------------------------------------------------- 10 g
Leche ------------------------------------------------------------- 200 ml
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Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml
Disolver los ingredientes calentando hasta ebullicin, distribuir 7 ml por tubo de
ensayo y autoclavar a 121 C 15 minutos. Enfriar los tubos en posicin inclinada.

Modificacin: Aadir SMA (100 g/ml)

4.5 AGAR BANANA-AVENA-LECHE (ABAL)

Una banana licuada---------------------------------------------200 g


Harina de avena -------------------------------------------------- 10 g
Leche ------------------------------------------------------------- 200 ml
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p ---------------------------------------- 1000 ml

Licuar la banana con leche, disolver los restantes ingredientes calentando hasta
su ebullicin, distribuir 7 ml por tubo de ensayo y autoclavar a 121 C, 15 minutos.
Enfriar los tubos en posicin inclinada.

4.6 AGAR PAPA GLUCOSADO (APA)

Papa pelada-------------------------------------------------------- 20 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml
Pelar y rallar la papa, disolver la glucosa en el agua y agregar los dems
ingredientes. Hervir 20 minutos y filtrar por gasa y rectificar volumen a 1000 ml.
Fraccionar 7 ml por tubo y esterilizar a 121 C durante 15 min, enfriar los tubos en
posicin inclinada.

4.7 AGAR CEREBRO CORAZN (BHI Agar)

Este medio se recomienda para la recuperacin de hongos patgenos exigentes


como Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis, especialmente para
sus formas levaduriformes. Con este propsito puede agregarse 5% de sangre
ovina estril cuando el medio est fundido y enfriado a 45-50 C. Se encuentra
disponible comercialmente. Seguir indicaciones del fabricante para su preparacin.
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Modificacin: Aadir SMA (100 g/ml)

Control de Calidad
Aspecto: mbar claro a semitransparente, sin precipitado (cuando no est
adicionado de sangre)
PH final a 25C: 7.4 0.2
Candida albicans: crece bien
Neisseria meningitidis ATCC 13090: crecimiento aceptable a bueno
Sporothrix schenckii: conversin a levadura a 37C

4.8 AGAR V8 (V8)

Se utiliza para la formacin de ascosporos de levaduras.

Jugo vegetal V8 ------------------------------------------------ 150 ml


Agua de levadura*--------------------------------------------- 850 ml
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Ajustar a pH: 7.0

* Agua de levadura: hervir 1 litro de agua durante 30 minutos con 40 g de levadura


prensada. Enfriar y llevar a 1 litro.Dejar reposar en heladera 48 horas, utilizar el
sobrenadante (850 ml).

Disolver los ingredientes calentando hasta ebullicin. Fraccionar 7 ml por tubo y


autoclavar a 121 C durante 15 min, enfriar los tubos en posicin inclinada. Los
ascosporos de levaduras, desarrollados en este medio son fcilmente identificados
en extendidos teidos con la tcnica de KY, ya que son cido resistente.

4.9 MEDIO DE GORODKOWA (GOR)

Se utiliza para la formacin de ascosporos de levaduras

Glucosa -----------------------------------------------------------1.25 g
Peptona --------------------------------------------------------------- 5 g
Cloruro de sodio ------------------------------------------------2.50 g
Extracto de carne --------------------------------------------------- 5 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 10 g
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Agua destilada-------------------------------------------------- 500 ml


Fraccionar 7 ml por tubo y esterilizar a 121 C durante 15 minutos, enfriar los
tubos en posicin inclinada.
Los ascosporos de levaduras, desarrollados en este medio son fcilmente
identificados en extendidos teidos con la tcnica de KY, ya que son cido
resistente

4.10 MEDIO DE THAYER-MARTIN (TM)

Este medio de cultivo disponible comercialmente, es usado para aislamiento de


especies de Neisseria spp, y tambin Nocardia spp.

4.11 AGAR AGUA (AA)

Estimula la formacin de conidios. Recomendable para hifomicetes de


pigmentacin oscura (dematiceos) e incluso para dermatofitos poco o nada
esporulados. Favorece la esporulacin de hongos saprofitos.

Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
Calentar hasta disolver los componentes, autoclavar a 121 C durante 15 min.,
distribuir en placas de petri

Control de Calidad
Microsporum canis: abundante produccin de macroconidios.

4.12 AGAR CZAPEK (ACZ)

Se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmente Aspergillus spp. y


Penicillium spp. Es el medio de referencia para la identificacin de Aspergillus spp.
Tambin est disponible comercialmente.

Nitrato sdico -------------------------------------------------------- 3 g


Fosfato dipotsico -------------------------------------------------- 1 g
Sulfato magnsico----------------------------------------------- 0.5 g
Cloruro potsico-------------------------------------------------- 0.5 g
Sulfato ferroso ---------------------------------------------------0.01 g
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Sacarosa------------------------------------------------------------ 30 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 15 g
Agua deionizada ---------------------------------------------1.000 ml
Calentar hasta disolver todos los componentes, esterilizar a 121C durante 15
min., distribuir en placas de Petri

Control de Calidad
Apariencia: mbar plido, slido transparente.
pH final a 25 C: 7.3 0.2
Aspergillus flavus: crece colonia amarilla-verde

4.13 AGAR SABOURAUD CON CICLOHEXIMIDA Y CLORANFENICOL (SCC)

Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de hongos patgenos a partir


de muestras muy contaminadas con hongos saprofitos y bacterias. Se utiliza
fundamentalmente en el aislamiento de dermatofitos y hongos dimrficos. Inhibe
algunas especies de hongos de inters mdico (Candida no albicans, Aspergillus,
Zygomycetes, Cryptococcus neoformans, etc).
Se utilizan preparados comerciales, se preparan de acuerdo con las instrucciones
del fabricante

Control de Calidad
Aspecto: Agar firme, amarillento, transparente.
Trichophyton mentagrophytes: Crece
Aspergillus flavus: Inhibicin parcial o completa
Staphylococcus epidermidis: inhibicin parcial o total

4.14 AGAR PAPA- ZANAHORIA (APZ)

Idneo para estimular la esporulacin de hongos miceliales, muy indicado para la


identificacin de hongos dematiceos.

Papa rallada-------------------------------------------------------- 10 g
Zanahoria rallada ------------------------------------------------- 20 g
Agar ----------------------------------------------------------------- 18 g
Agua ------------------------------------------------------------ 1000 ml

4.15 AGAR DIXON Modificado (DXN)


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Utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puede modificarse aadiendo


cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida.

Extracto de malta ------------------------------------------------- 36 g


Peptona --------------------------------------------------------------- 6 g
Oxgall, desecada -------------------------------------------------- 20g
Tween 40 ---------------------------------------------------------10 ml
Glicerol -------------------------------------------------------------- 2 ml
Acido oleico -------------------------------------------------------- 2 ml
Agar ------------------------------------------------------------------ 12 g
Agua deionizada1000 ml
Calentar bien, disolver todos los componentes, esterilizar a 121 C durante 15
min., distribuir en placas de Petri

Control de Calidad
Aspecto: Blanco amarillento, no muy slido
pH final: 6.0
Malassezia restricta: Crece

En el medio inhibidor
Malassezia restricta: Crece
Aspergillus flavus: Inhibicin parcial o completa
Staphylococcus epidermidis: Inhibicin parcial o completa

4.16 MEDIO Dermatophyte Test Medium (DTM)

Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Dextrose ------------------------------------------------------------ 10 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Rojo Fenol ---------------------------------------------------------40 ml
Cl 0.8 M ------------------------------------------------------------- 6 ml

Cicloheximida-----------------------------0.5 g ( 500mg. disueltos en 2 ml de acetona)


Sulfato de gentamicina-----------------0.1g ( 100 mg disueltos en 2ml de agua
destilada)
Cloramfenicol-----------------------------250 mg (disueltos en 10 ml de etanol)
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
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Disolver la peptona, la dextrosa y el agar en agua. Calentar a BM. Agregar el rojo


Fenol agitando. Ajustar el pH con HCl, agitndola agregar la Gentamicina (o
Streptomicina), agitando. Fraccionar en frascos de 200 ml. Autoclavar a 121 C
durante 10 minutos. Enfriar a 50 C y agregar el cloramfenicol. (para 200 ml de
medio, 5ml de antibitico). El pH final debe ser 5.5 0.1.Distribuir a razn de 7 ml
por tubo, en tubos de ensayo estriles. Enfriar en bisel y guardar, listos para su
uso, en la heladera.

Solucin Rojo Fenol

Rojo fenol ----------------------------------------------------------- 0.5g


HONa 0.1 N ------------------------------------------------------ 15 ml.
Agua destilada-------------------------------------------------- 100ml.

Solucin HCl 0.8 M

HCl 1N---------------------------------------------------------------8 ml.


Agua destilada-----------------------------------------------------2 ml.

5.- MTODOS DE PRESERVACIN DE CULTIVOS

5.1 METODO DE SABOURAUD

Se utiliza para conservar algunas cepas de Zygomicetes y formas miceliares no


esporuladas, evita el pleomorfismo especialmente de los dermatofitos.

Medio de Cultivo
Peptona --------------------------------------------------------------- 3 g
Agar -------------------------------------------------------------------- 2 g
Agua destilada c.s.p. ----------------------------------------- 100 ml
pH final: 6.8-7.0
Fraccionar en tubos y autoclavar a 121C, 15 minutos. Enfriar los tubos en
posicin inclinada.

Solucin de Aceite
Aceite neutro mineral estril. Autoclavar por 2 horas a 121C y luego calentar en
una estufa de secado a 100 C por 1-2 horas para evaporar la humedad
remanente.
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Procedimiento

Sembrar el hongo previamente aislado, en el medio de cultivo para preservacin.


Incubar hasta obtener el crecimiento deseado. Cubrir con aceite neutro mineral,
colocar tapn de goma estril y sellar con parafina. Se conserva a temperatura
ambiente.

5.2 METODO DE CASTELLANI O DEL AGUA DESTILADA

El mtodo descripto por Castellani es una tcnica econmica y sencilla de realizar.


Permite la conservacin de varios hongos filamentosos y levaduras por ms de 1
ao.

Procedimiento para levaduras


Fraccionar 2-3 ml de agua destilada en viales con cierre hermtico para prevenir la
evaporacin y/ la contaminacin. Autoclavar a 121 C por 15 minutos. Tomar con
un ansa 2 3 colonias de un cultivo de 24-48 horas y suspenderlas en el vial. Las
cepas se conservan a temperatura ambiente o refrigeradas.

Procedimiento para hongos filamentosos


En un cultivo activamente esporulado, agregar de 2-3 ml de agua estril. Con un
ansa estril remover las esporas de la colonia sin romper el agar. Se toma la
suspensin de esporas con una pipeta estril y se la transfiere a un vial estril de
cierre hermtico. Las cepas se conservan a temperatura ambiente o refrigeradas.

5.3 PRESERVACIN DE CEPAS POR CONGELACIN

Es un mtodo sencillo que permite la conservacin de varios hongos filamentosos


y levaduras por varios aos. Este medio preserva bien Candida spp y
Saccharomyces spp pero no es recomendado para Cryptococcus neoformans por
su baja recuperacin.

Procedimiento para hongos filamentosos

Preparar cultivos activamente esporulados en criotubos a rosca, con agar en pico


de flauta. Luego conservar los viales en freezer a -70 C.

Procedimiento para levaduras


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Glicerol -------------------------------------------------------------30 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml

Fraccionar 1 ml en crioviales, esterilizar a 12 C por 15 min y mantenerlos a 5C.


Suspender 2-3 colonias de un SAB de 24-48 horas de incubacin. Luego
conservar los viales en freezer a 70 C.

6.- PRUEBAS PARA IDENTIFICACIN DE ESPECIES FNGICAS

6.1 PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO (TG)

Es el mtodo rpido para la identificacin presuntiva de Candida albicans.

Procedimiento
Se utiliza 0.3 a 0.5 ml de un pool de suero fresco, suero bovino equino en tubo
de hemlisis. Tocar una colonia de levadura de la placa de 24 horas y suspenderla
en el suero. Incubar a 35 C por 2 a 3 horas. Ubicar una gota de la suspensin en
un portaobjeto, colocar cubreobjeto y observar en microscopio a 400x

Control de Calidad
Positivo: C. albicans ATCC 60193
Negativo: C. parapsilosis ATCC 66029

6.2 AGAR HARINA DE MAIZ CON TWEEN 80 (CORN-MEAL AGAR)

Se utiliza para observar la produccin de clamidosporos de Candida albicans y la


micromorfologa y distribucin de las blastoconidias y artroconidias y pseudohifas
para diferenciar las distintas especies de Candida. Tambin puede ser usado para
la produccin de pigmento para identificar Trichophyton rubrum y Trichophyton
mentagrophytes para este fin se le agrega al medio 10 g de dextrosa.

Procedimiento

Se encuentra comercialmente disponible, pero puede prepararse con harina de


maz (polenta)

Harina de maz ---------------------------------------------------- 40 g


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Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Tween 80 (polisorbato) ------------------------------------------10ml
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml

Si se utiliza harina de maz, se calienta con agua a 60 C durante 1 hora. Filtrar y


completar a 1 litro con agua. Agregar el agar, el Tween 80 hervir y autoclavar.

6.3.a AGAR CROMOGNICO PARA LEVADURAS Eliminado:

Es til para la deteccin de infecciones mixtas de distintos materiales como orina,


sangre, heridas, flujos vaginales, esputos, etc. Este medio permite la identificacin
presuntiva de algunas levaduras. El medio contiene sustratos enzimticos unidos
a compuestos cromgenos que producen un color determinado en presencia de la
enzima especfica. Algunas especies de levaduras desarrollan un color
caracterstico. Existen diferentes medios comerciales en nuestro mercado, los
cuales desarrollan distintos colores segn las especies que pueden detectar.

6.3.a.1 CHROMagar (CHROMagarTM )


Verde: C. albicans
Azul: C. tropicalis
Rosa (aspecto seco): C. krusei

6.3.a.2 Brilliance Candida Agar (Oxoid)


Azul: C. albicans
Verde: C. tropicalis
Rosadas (aspecto seco): C. krusei

6.3.a.3 Agar Candida ID II (BioMerieux)


Azul: C. albicans
Rosa:C. tropicalis,C. lusitaniae y C. kefyr

Procedimiento
Los medios 6.3.a.1 y 6.3.a.2 se preparan segn instrucciones del fabricante. El
medio 6.3.a.3 se comercializa directamente en placas. Todos pueden mantenerse
varios das en heladera al abrigo de la luz. Las placas sembradas se incuban a 28
C - 35 C durante 48 a 72 horas.

6.3.b AGAR CROMOGNICO PARA LEVADURAS LIPOFLICAS (CMA)


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Procedimiento

Preparar segn las instrucciones del fabricante con el agregado de 10 ml de


Tween 40 por litro. Eliminado:
6.3.c AGAR CREMOPHOR EL (EL Slant)

Procedimiento

SDA ..65g
Cremophor EL (sigma).10 ml
Agua destiladac.s.p.1000ml

Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolucin completa. Esterilizar a


121C durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado.

6.3.d AGAR TWEEN ESCULINA (TE Slant)

Procedimiento

Peptona .10g
Glucosa .10g
Extracto de levadura..2g
Tween 60..5 ml
Citrato frrico amnico..0.5g
Esculina ..1g
Agar ...15g
Agua destilada ...c.s.p.1000ml

Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolucin completa. Esterilizar a


121C durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado.

6.4 AGAR LECHE CON TWEEN 80

Se utiliza para observar la produccin de clamidosporos y tubo germinativo de


Candida albicans y C. dubliniensis del resto de las especies de Candidas. Esta
tcnica tiene la ventaja que realiza dos mtodos diagnsticos en una misma
prueba. Tambin permite ver produccin o ausencia de seudohifas y la disposicin
del micelio y blastosporas.
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Agar -------------------------------------------------------------------- 2 g
Tween 80 ----------------------------------------------------------- 1 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Autoclavar a 121 C por 20 minutos. Agregar a 56 C 1 ml de leche descremada
en polvo estril.

Control de Calidad
Positivo: C. albicans ATCC 60193
Negativo: C. tropicalis ATCC 66029

Procedimiento

Fraccionar en tubos. En el momento de usar, fundir el medio y preparar un


portaobjetos con tres mililitros del agar, como para inmunodifusin. Sembrar con
una estra en la superficie y cubrir con un cubreobjeto previamente flameado a la
llama. Se incuba en una placa de Petri con un dispositivo similar al empleado para
microcultivos (Ver AMID)

6.5 AGAR SEMILLA DE GIRASOL

El medio contiene cido cafeico (extracto semilla de girasol) que permite la


deteccin de la enzima fenol-oxidasa producida nicamente por Cryptococcus
neoformans / C. gatti. Esta reaccin enzimtica da como producto final melanina,
la cual es absorbida por la pared del hongo dando un color marrn claro.

Glucosa --------------------------------------------------------------- 1 g
Creatina -----------------------------------------------------------0.78 g
Agar ----------------------------------------------------------------- 18 g
Cloranfenicol -----------------------------------------------------0.05 g
Extracto de semilla de girasol* ----------------------------- 350 ml
Calentar hasta disolucin. Distribuir en frascos con tapa a rosca entre 50 a 100 ml.
Autoclavar a 121 C durante 15 min.

*Preparacin del extracto: Pulverizar las semillas de girasol, pesar 70g del
mismo y suspenderlo en 350ml de agua destilada, hervir y filtrar con gasa.
Autoclavar a 121 C durante 15 min. Mantener en heladera en frasco con cierre
hermtico.
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Control de calidad
C. neoformans ATCC 66031
C. albicans ATCC 60193

Procedimiento
En el momento de utilizar, fundir el medio y plaquear.
Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en
estudio, incubar a 28C durante 96 horas.

6.6. a AGAR TABACO

Permite la deteccin de la enzima fenoloxidasa producida por Cryptococcus


neoformans. Esta reaccin tiene como producto final la melanina, la cual le da al
hongo una coloracin marrn caracterstica.

Tabaco -------------------------------------------------------------- 50gr


Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml

Hervir durante 30 minutos en bao de Mara. Filtrar a travs de gasa, corregir


volumen a 1000 ml,
Agar ----------------------------------------------------------------- 20 gr

pH: 5.4. Autoclavar a 121C durante 15 minutos. Plaquear 20 ml de medio en


cajas de Petri de 90 mm de dimetro.

Control de calidad
Candida albicans: color blanco
Cryptococcus neoformans: Color marrn

Procedimiento
Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en
estudio, incubar a 28 C durante 96 horas.

6.6. b AGAR TABACO Modificado

Permite la deteccin de la enzima fenoloxidasa producida por Cryptococcus


neoformans. Esta reaccin tiene como producto final la melanina, la cual le da al
hongo una coloracin marrn caracterstica.
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Es utilizado como una prueba ms para diferenciar C. albicans de C. dubliniensis.

Se rompen 2 atados de cigarrillos (Malboro) y se vuelca el tabaco en un


erlenmeyer con 1l de agua destilada.

Hervir durante 30a Bao de Mara. Filtrar a travs de gasa y corregir volumen a 1l

Agregar 20 g de agar, mezclar bien. Ajustar el pH a 5.4

Autoclavar a 121C durante 15 min. Plaquear a razn de 20 ml por placa.

Procedimiento
Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en
estudio, incubar a 28 C durante 96 horas.

Interpretacin
Candida albicans: colonia color blanco o crema, lisa, borde liso.
Observacin microscpica del borde a las 48 h: Clamidosporas (-)
Candida dubliniensis: colonia color pardo amarillenta, rugosa, borde festoneado.
Observacin microscpica del borde a las 48 hs: Clamidosporas (+)
Cryptococcus neoformans: colonia color marrn

6.7 AGAR DE STAIB (Guizotia abyssnica). Agar semillas de alpiste

Utilizado para aislar Cryptococcus spp. y Cryptococcus neoformans. Este ltimo es


el nico que al metabolizar la guizotia abyssinica (alpiste), produce melanina
originando un color marrn oscuro. El cloranfenicol lo convierte en medio selectivo.
Tambin puede ser til en la diferenciacin de Candida dubliniensis

Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g
Creatinina---------------------------------------------------------0.78 g
Cloranfenicol -----------------------------------------------------0.05 g
Difenilo (disuelto en 10 ml de etanol 95%) ------------- 100 mg
Guizotia abyssinica----------------------------------------------- 70 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua deionizada --------------------------------------------- 1000 ml

Moler las semillas y aadir 350 ml de agua, esterilizar en autoclave y filtrar. Aadir
agua hasta 1000 ml, agregar el resto de los componentes excepto el difenilo.
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Esterilizar a 121C 15 min. Enfriar a 45C. Aadir el difenilo antes de dispensar el


medio en las placas

Control de Calidad
C. neoformans: colonias color marrn oscuro
Cryptococcus spp: colonias claras

6.8 MEDIO DE SALKIN

Solucin de Cicloheximida: 1.6 mg en 10 ml de agua destilada

Solucin de Rojo de Fenol: 500 mg en 100 ml de agua destilada.

Base

Agar-agar ----------------------------------------------------------- 20 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 700 ml
Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm.

Suplemento

Medio Base de Nitrgeno(YNB) ----------------------------- 6.7 g


Solucin cicloheximida -----------------------------------------10 ml
Solucin Rojo de fenol -----------------------------------------30 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 260 ml
Glicina --------------------------------------------------------------- 10 g
Esterilizar por filtracin

Para preparar el medio mezclar 70:30 Base fundida y enfriada a 45C y


Suplemento. Fraccionar en tubos de hemlisis estriles en pico de flauta.

Control de Calidad
C. neoformans: el medio no vira de color
Cryptococcus gattii: el medio vira al color rojo en 1-5 das

6.9 MEDIO CGB

Solucin A (Suplemento)
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Glicina --------------------------------------------------------------- 10 g
PO H K---------------------------------------------------------------- 1 g
4 2
SO Mg----------------------------------------------------------------- 1 g
4
Tiamina.ClH ------------------------------------------------------- 1 mg
L-canavanina ----------------------------------------------------30 mg
Agua destilada csp -------------------------------------------- 100 ml

Ajustar el pH a 5.6 .Esterilizar por filtracin

Solucin B
Azul de bromotimol sdico ------------------------------------ 0.2 g
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml

Base
Mezclar 440 ml de agua destilada, 20 ml de Solucin B y 10 g de agar. Autoclavar
15 minutos a 1 atm.

Para preparar el medio mezclar una parte del Suplemento con 9 partes de la Base
fundida y enfriada a 45C. Envasar en tubos de hemlisis estriles en pico de
flauta.

Control de Calidad
C. neoformans: el medio no vira de color
Cryptococcus gattii: el medio vira al color azul en 1-5 das.

6.10 MTODOS PARA LA DETECCIN DE UREASA

Se basan en la capacidad de algunos microorganismos en producir la enzima


ureasa, la cual puede ser detectada por diferentes mtodos. Los medios utilizados
contienen urea, que en presencia de la enzima se desdobla en
dixido de carbono y amonio, elevando el pH y produciendo un cambio de color en
el indicador rojo de fenol del amarillo al fucsia

6.10.1 UREA DE CHRISTENSEN

Procedimiento
El medio base se prepara de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Autoclavar
a 120C durante 15 minutos. Adicionar la solucin de urea estril al 40%, al medio
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base fundido y enfriado a 45C. Fraccionar 3 ml por tubo, enfriar los tubos en
posicin inclinada.
Sembrar el agar, incubar a 28C 72 horas.

Control de Calidad
T. mentagrophytes: positivo (rojo)
T. rubrum: negativo (amarillo)

6.10.2 TEST DE UREA RPIDO

Tiene la ventaja que su lectura se realiza entre 3 a 5 minutos.


Solucin A
Solucin madre de rojo de fenol al 0.01%
Mantener en heladera

Solucin B
Solucin de urea al 10%
Mantener en heladera

Procedimiento
En el momento de usar, colocar en un tubo de hemlisis 0.5 ml de la Solucin A y
agregar 1 gota de Solucin B. Tomar algunas colonias de levaduras con un hisopo
estril e introducirlo en el tubo, dejar de 3 a 5 min y realizar la lectura final.

Control de Calidad

T. mentagrophytes: positivo (rojo)


T. rubrum: negativo (amarillo)

6.10.3 TABLETAS DE UREA (Rosco)

Procedimiento
Seguir instrucciones del fabricante del producto comercial

6.11 ASIMILACIN DE TREHALOSA (Tabletas Rosco)

Procedimiento
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Seguir instrucciones del fabricante del producto comercial

7. HEMOCULTIVOS (por Lisis Centrifugacin)


TUBOS PARA RECOLECCIN DE HEMOCULTIVOS

Saponina-------------------------------------------------------------- 5 g
Polianetol sulfonato de sodio --------------------------------- 0.5 g
Solucin fisiolgica -------------------------------------------- 100 ml
Fraccionar en tubos con tapa a rosca esterilizables en autoclave, 1 ml por tubo.
Autoclavar 15 minutos a 1 atm.

8. REACTIVOS PARA INMUNODIAGNSTICO

8.1REACTIVOS PARA INMUNODIFUSIN

Solucin buffer fosfatos pH 7.4

M/15 Na2HPO4---------------------------------------------------------------------- 80,8 ml


M/15 NaH2PO4---------------------------------------------------------------------- 19,2 ml

Gel de Agar

Agua destilada------------------------------------------------ 99.0 ml


Solucin buffer de fosfatos-------------------------------- 1.0 ml
NaCl------------------------------------------------------------ 0.85 g
Fenol ----------------------------------------------------------- 0.3 ml
Agar purificado----------------------------------------------- 1.0 g
PEG 6000------------------------------------------------------ 1.0 g

Se prepara la solucin fisiolgica fenolada al 3: Al agua destilada se le agregan


el NaCl y el fenol. Luego se agrega el agar y el PEG y se mezclan durante 5
minutos. Se lleva a bao de agua a 100 C hasta su disolucin completa y se
distribuye en tubos con tapa a rosca con 5 y 15 ml por tubo y se conserva a 4 C
hasta su utilizacin.

Solucin buffer de citrato-cloruro de sodio pH 8,2

Citrato trisdico -------------------------------------------------------- 5g


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Solucin salina isotnica ------------------------------------------- 100 ml

Mezclar bien hasta disolucin total del citrato, envasar en un frasco con tapa a
rosca. Mantener a temperatura ambiente.

Solucin de Azul de Coomasie

Azul brillante de Coomasie R-250--------------------------------- 1g


Etanol--------------------------------------------------------------------- 90 ml
Acido actico glacial-------------------------------------------------- 20 ml
Agua destilada---------------------------------------------------------- 90 ml

Disolver el azul en etanol y luego agregar el cido actico y el agua destilada.


Esta solucin puede reutilizarse muchas veces.

PREPARACIN DE LAS LMINAS O PLACAS

Se funde el agar en bao de agua a ebullicin y se deja enfriar hasta 55-60 C


Se vierte un tubo de 15 ml, si se realiza la ID en placa
Para preparar portaobjetos, primero se diluye 1 ml de agar en 7 ml de agua
destilada y se cubre el portaobjetos con una capa muy fina y se deja secar hasta
formar una pelcula seca y opaca. Luego se agregan 2,5 ml de agar sin diluir.
Se deja solidificar y se puede mantener a 4 C hasta una semana. Los
portaobjetos as preparados deben conservarse en cmara hmeda.

8.2 AGAROSA PARA CONTRAINMUNOELECTROFORESIS

Agarosa --------------------------------------------------------------- 1 g
PEG 6000------------------------------------------------------------- 1 g
Buffer veronal pH 8.2 ----------------------------------------- 100 ml
Merthiolate 1/100 ----------------------------------------------- 1 ml

Mezclar. Disolver por calentamiento. Envasar en tubos de ensayo (10 ml)


Se utiliza 3 ml por portaobjeto.

Recubrir uno o varios portaobjetos con 3 ml de agarosa al 1 % en solucin acuosa


caliente y dejar enfriar 10 minutos. Se pueden conservar en cmara hmeda a 4
C durante una semana.
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DE BUENOS AIRES
MANUAL DE MEDIOS Y Versin: 02
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9. MEDIOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIFNGICOS

9.1 MEDIO DE SHADOMY MODIFICADO


Solucin 1
YNB ----------------------------------------------------------------- 6.7 g
l-asparagina ------------------------------------------------------- 4.5 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g
Cloranfenicol --------------------------------------------------- 100 mg
Alcohol 99 --------------------------------------------------------- 2 ml
Agua destilada csp -------------------------------------------- 100 ml
Disolver el cloranfenicol en el alcohol y agregar 50 ml de agua. Calentar la
solucin a 35-40C, agregar el YNB, l-asparagina y la glucosa mientras se
revuelve. Luego se completa a 100 ml con agua destilada. Se esteriliza por
filtracin con membrana de 0.45 m o filtro Seitz
.
Solucin 2
PO H Na.H2O ---------------------------------------------------0.37 g
4 2
PO HK2 ------------------------------------------------------------0.96 g
4
Agar (Oxoid N1)-------------------------------------------------- 10 g
Agua destilada csp -------------------------------------------- 900 ml

Se disuelve el agar en 900 ml de agua destilada calentando hasta ebullicin y se


agregan los fosfatos, enfriar lentamente hasta 60C y se mide pH(6.8-7.2) Llevar a
volumen final de 900 ml y esterilizar en autoclave 20 minutos a 1 atm. Despus de
autoclavar enfriar a 55-60C y agregar aspticamente la Solucin 1 mientras se
agita. Mantener a 45-55C mientras se fracciona en frascos estriles (100 ml).

9.2 MUELLER-HINTON CON GLUCOSA Y AZUL DE METILENO

Agar Mueller-Hinton ---------------------------------------------- 37 g


Glucosa ------------------------------------------------------------- 20 g
Azul de metileno 1% ------------------------------------------- 0.1 ml
Agua destilada csp ------------------------------------------ 1000 ml
Disolver el agar y la glucosa en el agua y calentar. Agregar el azul de metileno.
Fraccionar en frascos (100 ml) y autoclavar 15 minutos a 1 atm.

9.3 MEDIO RPMI PARA REALIZAR CIM

Medio RPMI ---------------------------------------------------- 1 sobre


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MOPS------------------------------------------------------------ 34.53 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 18 g
Agua destilada csp ------------------------------------------ 1000 ml

Disolver 1 sobre de RPMI en 600-700 ml de agua destilada en un matraz aforado


de 1000 ml.
Disolver el MOPS en 50 ml de agua destilada en un Erlenmeyer.
Agregar la solucin de MOPS al RPMI
Aadir la glucosa y mezclar hasta disolucin completa.
Ajustar el pH a 7 con NaOH 40%.
Agregar agua destilada hasta volumen de 1000 ml.
Esterilizar por filtracin y envasar en frascos de vidrio estriles de 100-200 ml cada
uno. Conservar en heladera.

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