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Resumen
1
Bilogo, Ms.C. Docente, Universidad Cooperativa de Colmbia. Sede Santa Marta.
2
Microbilogo, Joven Investigador, universidad Libre Seccional Barranquilla.
3
Mdico y Cirujano, Docente Investigador Universidad Cooperativa de Colombia sede Santa Marta.
4
Microbilogo, Ms.C. Docente Investigador, Universidad Cooperativa de Colmbia. Sede Santa Marta.
Correspondencia: Jos Bernardo Gonzlez Pedraza, Universidad Cooperativa de Colombia, Programa
de Medicina. Troncal Del Caribe Km.1 Va Mamatoco. Santa Marta, Magdalena. josebernardogonzalez-
Vol. 30, N 1, 2014
pedraza@hotmail.com Telfono celular: 3016815627. ISSN 0120-5552
http://dx.doi.org/10.14482/
sun.30.1.4316
Abstract
This review presents an analysis about the methods to identify Salmonella spp. and the
molecular studies to diagnosis this microorganism is deepened. Is believed Salmonella
to be responsible of the most of cases of food-borne disease worldwide. This bacterium
colonizes the most of the animals and the humans. It is not detectable in foods that has a
low number of cells and the traditional methods for their detection have low specificity,
sensitivity and consume long time. A systematic bibliographical search was developed
in web sites, available data bases and original article. in the last year several protocols
have seen developed using molecular methods to Salmonella spp. detection from clinical
sample and food. The molecular detection of Salmonella spp. by PCR is more expensive
than the traditional methods, but the high sensitivity and specificity that the PCR offers,
the benefits to the health sector when obtaining a fast and accurate diagnosis, the relation
cost benefit that grants to the productive sector allowing to release nutritional products
to the market really fast way and the saving of costs, justify the implementation of that
technique. The possibility of detecting microorganisms of difficult isolation in different
matrices exists, using proper molecular methods and of applying them in epidemiological
sanitary controls.
Key words: Salmonella, PCR, diagnosis.
del medio de cultivo y/o del ambiente (pH, intestinales, la bilis estimula el crecimiento
temperatura y actividad acuosa) (14). Sin de Salmonella e inhibe la flora competitiva,
embargo, recientemente las evaluaciones de el verde brillante impide el desarrollo de la
riesgos microbiolgicos requieren de datos flora gram positiva y el carbonato clcico
cuantitativos para estimar el riesgo de que acta como tampn para mantener el pH.
una poblacin contraiga salmonelosis por
consumo de un determinado alimento conta- En el caldo SC, la selenita inhibe el creci-
minado. La Association of Official Analytical miento de gran parte de la flora intestinal
Chemist (AOAC) (15), describe los pasos a competitiva (E. coli, Enterococos), sin afectar
seguir para obtener buenos resultados, los a Salmonella, Shiguella, Pseudomonas o Proteus,
cuales pueden demorar entre 4 a 5 das. El mientras que la Cistina acta favoreciendo el
aislamiento e identificacin de Salmonella en crecimiento de Salmonella. En el medio RV, el
una muestra requiere de cuatro etapas que verde malaquita inhibe el crecimiento de la
se precisan a continuacin: flora competitiva, los fosfatos monopotsico
y dipotsico mantienen estable el pH del me-
a. Etapa de Pre-enriquecimiento. dio durante el almacenamiento y el cloruro
magnsico enriquece el caldo favoreciendo el
Segn la AOAC (15), el objetivo de esta etapa desarrollo de Salmonella (26). En la actualidad,
es normalizar metablicamente las clulas de el BAM (Bacteriological Analytical Manual)
Salmonella spp. que se encuentren en deter- recomienda el uso del medio Rappaport-
minada matriz para su perfecto desarrollo y Vasiliadis para los alimentos con niveles
todos los microorganismos compiten por los altos o bajos de carga microbiana. El caldo RV
nutrientes. Se realiza a partir de medios de reemplaza al Selenito Cistina para el anlisis
cultivo no selectivos como agua peptonada de todos los alimentos, excepto para goma
(16, 17), caldo nutritivo, caldo lactosado (18) o Guar. La temperatura de incubacin del
agua destilada estril adicionada con solucin Tetrationato vara dependiendo de la carga
de verde brillante al 0,1% en el caso de leche microbiana del alimento, si es muy alta se
en polvo (19, 20). Es necesario una incubacin recomienda utilizar una temperatura de 43C
a 37 Celsius durante 18 a 24 horas. y si la carga microbiana es muy baja, emplear
una temperatura de 35C (27). La AOAC reco-
b. Etapa de Enriquecimiento selectivo. mienda utilizar simultneamente dos de ellos,
puesto que difieren en su selectividad (15).
Esta etapa estimula y favorece el crecimiento
de Salmonella spp. inhibiendo el crecimiento c. Etapa de Aislamiento en medios selec-
de la flora acompaante; los medios de cultivo tivos.
utilizados son: Caldo Tetrationato-Bilis-Verde
Brillante segn Mueller-Kauffmann (21), Esta etapa permite la diferenciacin de
Caldo Rappaport-Vasiliadis (RV) (22-25) y colonias de Salmonella de otras bacterias,
Selenito Cistina (SC). esta diferenciacin radica en la composi-
cin de los distintos medios que permiten
En el medio selectivo caldo tetrationato- el crecimiento de las colonias con aspectos
Bilis-Verde Brillante: el tetrationato inhibe el caractersticos. Para aislar y diferenciar las
crecimiento de coliformes y otras bacterias colonias de Salmonella, los medios de cultivo
contienen sustancias inhibitorias tales como: En Agar Bismuto Sulfito (BS): Colonias
antibiticos, sales biliares, desoxicolato, verde marrones, gris o negras, a veces con brillo
brillante, bismuto de sulfito (19), los medios metlico. El medio es usualmente marrn al
ms empleados son: agar Entrico Hektoen principio se torna negro conforme se incre-
(EH) (28), agar Xilosa, Lisina, Desoxicolato menta el tiempo de incubacin, producin-
(XLD) (29) y agar Bismuto sulfito (BS) (19). dose el llamado efecto halo.
En estos medios, las colonias tpicas de Sal-
monella se aprecian de la siguiente manera: d. Pruebas bioqumicas diferenciales.
En Agar enterico Hektoen (HE): Colonias En esta etapa se diferencian las bacterias por
azules o verde azuladas con o sin centro ne- su actividad metablica. La identificacin
gro. Muchos cultivos de Salmonella sp pueden o confirmacin de las colonias presuntivas
producir colonias con un centro negro gran- de Salmonella, se lleva a cabo en dos medios
de brillante o colonias casi completamente diferenciales usados simultneamente como
negras. el agar triple azcar hierro (TSI) (30) y el agar
Lisina hierro (LIA) (31,32), tambin se realizan
En Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD): pruebas bioqumicas complementarias como
Colonias rosadas con o sin centro negro. urea, fermentacin del dulcitol, crecimiento
Muchos cultivos de Salmonella sp pueden en caldo KCN, utilizacin del malonato de
producir colonias con un centro negro gran- sodio y produccin del indol (ver tabla 2).
de brillante o colonias casi completamente
negras.
Salmonella
Especie Salmonella enterica
bongori
Subespecie enterica (I) salamae (II) arizonae (IIIa) diarizonae (IIIb) houtenae (IV) indica (VI)
Dulcitol + + - - - D +
ONPG (2hrs) - - + + - D +
Malonato - + + + - - -
Gelatina - + + + + + -
Sorbitol + + + + -/+ - +
KCN - - - - + - +
D-tartrato + - - - - - -
B-glucoronidasa D D - + - D -
Mucato + + + -0,7 - + +
Salicina - - - - + - -
Lactosa - - -0,75 0,75 - D -
D, diferentes reacciones por serovars distintos. +,90% o ms cepas positivas. -,90% o menos cepas negativas.
Fuente: Instituto nacional de enfermedades infecciosas departamento bacteriologa, Manual de Procedimientos
Salmonella Parte I Aislamiento, identificacin y serotipificacin. 2003.
sueros consume mucho tiempo y requiere del por aglutinacin y la deteccin simultanea
uso de unos 167 sueros especficos, adems de los antgenos O y H, omitiendo la fase de
de un personal entrenado para tal propsito inversin debido a la alta sensibilidad de la
(41). Debido a los inconvenientes presentados tcnica, adems, de ser extendida para la sero-
con la tcnica tradicional de aglutinacin, y tipificacin y deteccin de otras bacterias (44).
con el fin de mejorar el diagnostico en una po-
blacin de Nigeria, Smith et al. 2011, tomaron En el mejoramiento de los procesos diag-
muestras de sangre de pacientes con cuadro nsticos, las tcnicas inmunolgicas se han
febril y sospecha clnica de fiebre tifoidea las combinado con tcnicas moleculares (45,
cuales fueron examinadas usando el test de 46). Luk et al, 1997; describieron un proce-
widal y la prueba rpida S. typhi dri dot. dimiento para detectar, luego de una PCR,
Los resultados arrojaron una alta especifici- a los productos (amplicones) con el ensayo
dad cerca al 97.8%, esta tcnica emplea una por inmunoabsorcin ligado a enzimas
tira de nitrocelulosa impregnada con un (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent
antgeno especifico ubicado en la membrana Assay). Los oligonucletidos fueron mar-
externa de Salmonella tiphy que reacciona cados con digoxogenin (DIG)-11-dUTP, el
con los anticuerpos IgM e IgG presentes en cual fue incorporado al producto de PCR. El
la muestra de suero generando un complejo amplicn fue capturado en fase slida, va
antgeno-anticuerpo. Para visualizar el com- interaccin con avidin-biotin y anticuerpos
plejo las tiras se incuban con la adicin de anti-digoxigenin. Para obtener resultados
una peroxidasa conjugada con anticuerpos visibles este ensayo tomo aproximadamente
anti IgG e IgM y un sustrato cromognico. 6 horas en total (4 horas en PCR y 2 horas en
Una coloracin azul intensa o de igual color ELISA), antecedido de un breve preenrique-
al control, indica una lectura positiva (42,43). cimiento 16 horas para un total de 22 horas,
Cai et al. 2005, desarrollaron una novedosa ofreciendo un rpido, exacto y semicuanti-
tcnica de serotipificacin de cepas de Sal- tativo mtodo para detectar Salmonella spp.
monella entrica usando pozos cubiertos con con el propsito de ser implementado como
resina super epoxy teidas con anticuerpos anlisis de rutina en laboratorios clnicos o
ajustados al sistema de Kauffmann-White. diagnostico epidemiolgico. El uso un plato
El modelo utiliza 35 anticuerpos para la de 96 pozos, permite automatizar el proceso y
identificacin de las 20 serovariedades mas analizar muchas muestras simultaneamente.
comunes en Canad y evalua 117 marca- Por otro lado, un inconveniente de la tcnica
dores especficos para cepas de Salmonella DIG-ELISA para el anlisis de productos
y 73 para cepas no relacionadas. El ensayo de PCR, es la inhabilidad para confirmar la
permiti la identificacin de 86 cepas y la identidad del ADN amplificado, es decir,
identificacin parcial de 30, excluyendo a las no determina de qu especie de Salmonella
73 cepas no relacionadas. En este ensayo la proviene, convirtindose inespecfico para
reaccin antgeno-anticuerpo se desarrolla en la determinacin de especie (47).
microvolumenes seguido de un marcaje fluo-
rescente de la cepa investigada. La deteccin b. Ensayo de Flujo Lateral (LFAs)
emplea un scanner comn de fluorescencia.
La tcnica ofrece la reduccin del tiempo de Una modificacin de la tcnica de ELISA es el
anlisis, la estandarizacin de la reaccin Ensayo de Flujo Lateral (LFAs) o Ensayo In-
de captura por afinidad como el uso de (NASBA), Hibridacin de ADN con sondas
Bacterifagos. La alta especificidad de los y microensayos, entre otras. La ms utili-
fagos es debida a las protenas asociadas en zada es la PCR, cuyo objetivo principal es
su cola que reconocen molculas especficas la multiplicacin in Vitro de uno o varios
presentes en la superficie de la bacteria. Su segmentos de ADN, por accin una enzima
uso pueda estar encaminado a favorecer el ADN polimerasa, ADN dependiente ter-
crecimiento selectivo de Salmonella spp. en un moestable. Para esto, el ADN bicatenario debe
medio enriquecido, atacando y reduciendo estar desnaturalizado para formar cadenas
la microflora acompaante o ser utilizados lineales en presencia de altas concentraciones
para detectar especficamente Salmonella spp de oligonucletidos y cloruro de Magnesio,
e inducir lisis celular, mediando la transfor- entonces dos cadenas nuevas del dplex ori-
macin de ADP en ATP, el cual es detectado ginal deben ser formadas (65, 66, 67, 68,69).
como luz visible por medio de una reaccin Esta tcnica es simple, reproducible, rpida
de bioluminiscencia) (62-64). La sensibilidad y flexible. Desde entonces se presentan mu-
de la tcnica mejora al aplicar anticuerpos chas variantes de este mtodo como la PCR
especficos que detecten los fagos unidos a las mltiple y la PCR en Tiempo Real (qPCR)
bacterias, adems se han empleado fagos que (70, 71, 72,73) adems se ha implementado
actan como mensajeros de genes reporteros, junto con tcnicas como, la hibridacin de
por ejemplo, que sintetizan protenas verde ADN (74), el uso de biochips (75) y de enzi-
fluorescentes, que pueden ser fcilmente mas de restriccin, entre otras, que facilitan
detectadas y cuantificadas (62). el diagnstico microbiolgico molecular de
patgenos en diferentes matrices. Desde 1992
Mtodos basados en cidos nuclecos muchas investigaciones estn encaminadas al
diagnostico molecular de Salmonella a travs
Entre las tcnicas moleculares aplicables a de la tcnica de PCR empleando diversos
la deteccin de patgenos como Salmonella sets de oligonucletidos, en las que se ha
spp en alimentos, encontramos: Reaccin en evaluado la selectividad (76), la especificidad
Cadena de la Polimerasa (PCR), Reaccin y la sensibilidad de estos frente a la prueba
en Cadena de la Polimerasa en tiempo real microbiolgica, considerada como la prueba
(qPCR), pirosecuenciacin, amplicacin de oro (ver tabla 3).
basada en la secuencia del acido nucleco
TIEMPO DE LIMITE DE
TCNICA MICROBIOLGICA AUTOR, AO
TCNICA DETECCIN UFC*
Cultivo estndar-tradicional 5 DIAS 2 UFC Conde et al, 2006
Cultivo estndar-tradicional 5 DIAS 2 UFC Villareal et al, 2008
Cultivo estndar-tradicional USDA+/FSIS 4 - 5 DIAS 1 UFC Gallegos et al, 2008
*Unidades formadoras de colonias.
+ United States Department Agriculture.
Food Safety and Inspection Service.
Marathe et al, en el ao 2012, detectaron Sal- (89), antes de cada ensayo o mediante el
monella spp en leche, helado y jugo de frutas previo enriquecimiento selectivo con el me-
directamente de la muestra, sin paso previo dio Rappaport-Vassiliadis, BGA o XLD (90)
de pre-enriquecimiento usando primers que para estimar la carga microbiana e identi-
detecten el gen hilA y empleando qumicos ficar el riesgo que puede causar un agente
rutinarios del laboratorio para reducir la con- patgeno y los factores que influyen en la
taminacin en las muestras, aumentando la seguridad alimentaria para (91). Una de las
eficiencia de 3-4 horas y obteniendo un lmite preocupaciones en la eliminacin de la etapa
de deteccin de 5-10 UFC/mL (87). de pre-enriquecimiento de la muestra es el
riesgo de amplificar secuencias de bacterias
El diagnstico molecular por la tcnica de no viables en la muestra, es as como las in-
PCR, se ha combinado con otros mtodos vestigaciones se han encaminado en extraer y
como sondas fluorescentes (88), inmuno- amplificar secuencias de ARNm de muestras
separacin magntica (46,48,60), filtracin de alimento para ser empleadas en RT-qPCR
(92). Gonzlez et al, en su estudio, amplifi- estudi el efecto de agentes que promuevan
caron el ARNm del gen InvA de Salmonella, el crecimiento como el piruvato de sodio, la
los resultados obtenidos fueron comparables yema de huevo y el efecto de agentes selec-
cuando a la tcnica se le antepuso un paso de tivos como la novobiocina, verde brillante,
pre-enriquecimiento para mejorar el lmite de verde de malaquita, tergitol, dexosicolato de
deteccin (93), McCabe et al, desarrollaron y sodio y el sulfamandelato, sin embargo, no
evaluaron una PCR usando el gen hilA para se encontraron diferencias significativas en
detectar Salmonella en muestras de carne, ninguno de los ensayos aplicados (95).
se emplearon muestras de ADN y de ARN
evaluando eficiencia y lmite de deteccin de Otro ensayo de PCR en tiempo Real fue
la tcnica, concluyendo que el ensayo de PCR realizado por DUrsoa y colaboradores,
con ADN es til para alimentos en proceso de quienes evaluaron un mtodo de filtracin
produccin mientras que el ensayo de PCR para la recuperacin de bacterias viables de
con ARN es til para productos listos para Salmonella entrica y adems de Listeria mo-
el consumo (94). nocytogenes en 30 minutos. El procedimiento
de filtracin consisti en pasar la suspensin
b. Reaccin en Cadena de la Polimerasa bacteriana en un papel filtro de 0,2 m de
en tiempo real (qPCR). dimetro para Salmonella entrica y 0,4 m
para Listeria monocytogenes. Este tratamiento
Debido al alto costo del sistema de PCR no mostr ningn efecto en la viabilidad de
(Termociclador, cmara de electroforesis, las clulas. En el caso de los alimentos la
sistema de fotodocumentacion, etc) y la con- tcnica fue capaz de detectar 10 bacterias por
taminacin por arrastre asociada con la mala 10 g de Yogurt y adems capaz de detectar
manipulacin y uso de los reactivos antes clulas viables en la presencia de un amplio
y despus de la amplificacin, surgi una rango de clulas muertas (96). La seleccin
nueva tecnologa de PCR que emplea fluo- de los primers y las sondas para los ensayos
rmetros/fotomometros para la deteccin de PCRq, son elementos cruciales para el
de amplicones fluorescentes denominada diseo de la metodologa diagnstica, es Asi
PCR en Tiempo Real (PCRq). Este nuevo como Chen et al, usando genmica compa-
desarrollo tecnolgico elimino la contami- rativa disearon los oligonucletidos para el
nacin por arrastre al desarrollar todo la desarrollo de la metodologa el cual marca
reaccin y cuantificacin en el tubo de PCR una secuencia dentro del gen de la sintetsa
sin necesidad de abrirse. Cabe mencionar el ATP del sistema de secrecin tipo III (ssaN),
desarrollo de un ensayo de PCR en Tiempo asi mismo disearon un control interno de
Real (PCRq) desarrollado por Josefsen et al, amplificacin con sus respectiva sonda. El
el ensayo fue optimizado para la deteccin ensayo demostr 100% de inclusividad para
de Salmonella spp en 12 horas en muestras de las 40 cepas de Salmonella ensayadas y un
carne, en las que se incluye 8 horas de pre- 100% de exclusividad para las 24 cepas no
enriquecimiento, seguida de una extraccin relacionadas (97).
automtica de ADN y por ltimo la amplifi-
cacin. Se evaluaron diferentes alternativas Por otra parte se han diseado sistemas
de medios nutritivos como el agua peptonada rpidos como el EntericBioMultiplex PCR,
, caldo BHI y tripticasa de soya, tambin se que permite la deteccin simultnea de
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