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Relatrio Final de Estgio

Nome: Ingrid de Jesus Magdalena

Curso: Biotecnologia
Concluso do curso: 2010/1
Concluso do seminrio: 2010/1
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Rio de Janeiro
2010
Local do Estgio: Laboratrio de Hidrobiologia

Endereo: Avenida Prof. Rodolpho Rocco 211, CENTRO DE CINCIAS DA SADE - CSS -
BLOCO A - Laboratrio de Hidrobiologia - Ilha do Fundo - Cidade Universitria - Rio de
Janeiro RJ

Setor da Instituio pelo Estgio: Laboratrio de Hidrobiologia

Responsvel pelo laboratrio: Dr. Rodolfo Paranhos

Cargo: Tcnico de Biotecnologia

Professor Supervisor do Instituto Federal do Rio de Janeiro IFRJ:

Rodrigo da Cunha Bisaggio

Matrcula: 523481
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Sumrio

I. Introduo ---------------------------------------------------------------------------------------- Pgina 3

II. Objetivo ------------------------------------------------------------------------------------------ Pgina 5
II. 1. Objetivos especficos -------------------------------------------------------------------- Pgina 5
III. Atividades Realizadas ------------------------------------------------------------------------- Pgina 5

III. 1. Limpeza e esterilizao de materiais e vidrarias ------------------------------------- Pgina 6

III. 1.a. Lavagem de materiais e vidrarias ------------------------------------------------ Pgina 6

III. 1.b. Lavagem cida de materiais e vidrarias ---------------------------------------- Pgina 7
III. 1.c. Esterilizao de materiais e vidrarias ------------------------------------------- Pgina 7

III. 2. Preparo de reagentes -------------------------------------------------------------------- Pgina 7

III. 2.a. Esterilizao da gua ultra pura ------------------------------------------------- Pgina 7

III. 2.b. Tampo fosfato salino (PBS) ---------------------------------------------------- Pgina7

III. 2.c. Diluio de Syto 13 --------------------------------------------------------------- Pgina 8

III. 2.d. Formaldedo 2% -------------------------------------------------------------- Pgina 8

III. 2.e. Tween 80 10% --------------------------------------------------------------------- Pgina 8

III. 2.f. Pirofosfato de sdio 10 mM ------------------------------------------------------ Pgina 8

III. 3. Anlises ----------------------------------------------------------------------------------- Pgina 9

III. 3.a. Abundncia bacteriana de guas (costeiras e ocenicas) --------------------- Pgina 8

III. 3.b. Abundncia bacteriana de sedimento marinho -------------------------------- Pgina 10

IV. Discusso --------------------------------------------------------------------------------------- Pgina 12

V. Consideraes finais --------------------------------------------------------------------------- Pgina 16
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VI. Agradecimentos --------------------------------------------------------------------------------- Pgina 17

VII. Bibliografia ------------------------------------------------------------------------------------- Pgina 17

I. Introduo

Localizado no Instituto de Biologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (IB-UFRJ)

desde os anos oitenta, o Laboratrio de Hidrobiologia realiza anlises fsicas, qumicas e
microbiolgicas para determinao de qualidade das guas costeiras e ocenicas.
O Laboratrio faz o monitoramento da Baa de Guanabara (projeto BG Monitora),
realizando coletas mensais de amostras de gua da mesma, assim como, colabora com diferentes
projetos de pesquisa do Instituto de Biologia, de Qumica, de Biofsica, alm de prestar servios
para a Fundao Universitria Jos Bonifcio (FUJB) e para Fundao Biorio. Tambm atua,
juntamente com laboratrios de outras universidades, no projeto HABITAT da Petrobrs, que tem
como objetivo geral estudar a distribuio do ncton demersal, incluindo peixes e cefalpodes, na
regio da Bacia de Campos - RJ.

O projeto BGMONITORA vem sendo realizado h muitos anos e, assim como o projeto
HABITAT, tem como objetivo o levantamento da quantidade de nutrientes (ortofosfato, nitrito,
oxignio dissolvido, silicato) depositados sobre a Baa como tambm a quantificao de bactrias
autotrficas e heterotrficas presentes no local. Podemos dividir os ramos do laboratrio de
Hidrobiologia em dois: o laboratrio responsvel pela parte de anlises microbiolgicas (UCEA) e
o laboratrio responsvel pela parte de anlises fsicas e qumicas. O segundo atingia em sua maior
parte a qumica (mais voltado aos alunos de qumica industrial e meio ambiente), por isso todo o
estgio foi realizado no primeiro laboratrio (mais voltado aos alunos de biotecnologia) destinado
parte biolgica.

O laboratrio de Hidrobiologia foi pioneiro na aplicao da citometria de fluxo nas cincias

ambientais no pas, sendo responsvel pela UCEA (Unidade de Citometria de Fluxo Aplicada a
Ecologia Aqutica e Oceanografia, no IB-UFRJ), onde so realizadas anlises microbianas das
amostras de gua e sedimentos, principalmente.
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A ecologia microbiana pertence a uma linha que tem se desenvolvido bastante com a
aplicao de tecnologias modernas voltadas pra outras reas, entre elas, a citometria de fluxo que
foi originalmente desenvolvida para estudo de clulas de sangue e cncer, tratando-se de uma
tcnica que atua atravs de anlises mltiplas em clulas individuais.

A citometria de fluxo baseada em trs conceitos principais: fludos, tica e eletrnica.

Quanto fludica, as clulas devem estar suspensas em fluxo, em sentido nico na direo da
cubeta. Em grande parte dos equipamentos isso feito injetando-se um fluido carreador (PBS ou
gua deionizada), que passa sob presso por um orifcio. Com isso a amostra fluir por uma rea
central dentro do fluxo de carreador, no se misturando com ele, constituindo um fluxo laminar. A
configurao ideal do sistema quando o fluxo laminar est bem ajustado (velocidade x volume)
de forma a passar apenas uma clula por vez em frente fonte de iluminao.

Em relao tica, necessria uma fonte de luz focalizada no exato ponto da cubeta onde
as clulas passam enfileiradas, conforme mostra a figura 1.a. Os lasers so as melhores opes por
emitirem luz monocromtica e unidirecional. Entre outras, os aparelhos coletam basicamente a
desvio frontal (Foward scatter ou FSC), correspondente ao tamanho da clula, a lateral (side
scatter ou SSC), correspondente a complexidade ou granulosidade da clula, e algumas cores
(verde, laranja e vermelho). Dependendo da partcula ou clula com que se trabalha e do objetivo a
que se destina, os parmetros FSC e SSC podem ser suficientes para caracterizar um determinado
tipo celular. Quando partculas fluorescentes ou marcadas com corantes fluorescentes (anticorpos
conjugados fluorforos ou intercalantes de cido nuclico) so iluminadas, elas absorvem luz e
emitem fluorescncia (figura 1. b). As florescncias ou emisses das clulas podem ser
selecionadas por filtros especficos que deixam passar apenas alguns comprimentos de onda,
tornando o processo ainda mais seletivo. recebendo excitaes e emitindo fluorescncia, quando
marcado com algum anticorpo conjugado a um fluorforo ou molcula intercalante de cido
nuclico.

Por ltimo, no que se refere eletrnica, os sinais analgicos gerados so percebidos por
fotodetectoras e transformados em digitais. Para isso so utilizados recursos computacionais que
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realizam essa tarefa em alta velocidade, sendo necessrio, tambm, um grande banco de dados
para que os mesmo, gerados em enorme quantidade, possam ser armazenados.

Figura 1: (a) Detalhe da formao do fluxo laminar. (b) Esquema da iluminao da amostra por um laser, e o
espalhamento frontal, lateral e as diferentes fluorescncias. Figuras modificadas de Purdue.

II. Objetivo

O objetivo geral do estgio foi realizar o preparo de amostras de gua e sedimento

marinhos para determinao de abundncia bacteriana.

II. 1. Objetivos Especficos

Determinao da abundncia bacteriana em amostras de gua do mar costeira e ocenica.

Determinao da abundncia bacteriana em amostras de sedimento marinho.

III. Atividades Realizadas

No decorrer do perodo de estgio, foram diversas as tarefas realizadas. No primeiro ms
de estgio onde podemos chamar de perodo de adaptao foi em sua maior parte de observao e
aprendizado das rotinas do laboratrio. As tarefas mais simples como arrumao de bancada,
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limpeza de vidrarias, lavagem de material com cido, preparo de reagentes foram predominantes
nesta fase inicial.

A anlise de bactrias, devido necessidade de resultados confiveis, s foi atribuda aps

certo tempo de estgio. Esta anlise se subdivide, principalmente, em duas anlises dentre elas:

Abundncia bacteriana de guas (costeiras e ocenicas)

Abundncia bacteriana de sedimento marinho

Aps o perodo de adaptao essas anlises se tornaram constantes. Diversas eram as

fontes das guas e sedimentos analisadas pelo laboratrio. Algumas amostras eram provenientes de
outros laboratrios da UFRJ que necessitavam da anlise de bactrias, outras amostras vinham de
projetos de fora e era prestado um servio terceirizado. Havia tambm as amostras coletadas pelos
prprios membros do laboratrio (coleta mensal na Baa de Guanabara) e uma grande quantidade
pertencente ao projeto HABITAT.

Todos os dados a respeito das anlises eram salvos num sistema interno (PCServ) feito para
o laboratrio onde continha todos os dados sobre as anlises e os resultados obtidos. Antes de
transferir os resultados para esse sistema, os mesmos eram processados numa planilha prpria para
o clculo da abundncia bacteriana. Esta planilha era impressa e submetida aprovao do tcnico
responsvel para que, em seguida, fosse inserida no sistema.

III. 1. Limpeza e esterilizao de materiais e vidrarias

III.1.a. Lavagem de materiais e vidrarias

Atividade realizada freqentemente no laboratrio, cujo objetivo a limpeza das vidrarias

utilizadas nas anlises. Para isso, utiliza-se um ultra-som contendo soluo de EXTRAN (Merck)
2% v/v. As vidrarias so colocadas dentro do aparelho e permanecem no seu interior por em mdia
1 minuto. Depois retiram-se as vidrarias e enxgua-se primeiramente com gua da torneira e
posteriormente com gua ultra pura.
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III. 1.b. Lavagem cida de materiais e vidrarias

Para garantir a descontaminao completa dos materiais lavados no ultra-som, estes eram
lavados com soluo de cido clordrico (J.T.Baker) 1:1 (v /v) antes de utiliz-los nas anlises de
rotina. Aps a lavagem as vidrarias e materiais so enxaguadas trs vezes com gua ultra pura
(destilada e filtrada em sistema Millipore).

III. 1.c. Esterilizao de materiais e vidrarias

Antes de ser utilizado todo material voltado anlise de bactrias devidamente embalado
com papel pardo e encaminhado para a autoclave, onde permanece por 15 minutos.

III. 2. Preparo de reagentes

III. 2.a. Esterilizao da gua ultra pura

Antes de qualquer utilizao da gua ultra pura para anlise de bactrias, a mesma era
submetida 15 minutos na autoclave para esterilizao.

III. 2.b. Tampo fosfato salino (PBS)

Em primeiro lugar prepara-se a soluo tampo fosfato onde 27,6g de fosfato de sdio
monobsico (Merck) e 35,6g de fosfato de sdio dibsico (J.T.Baker) so dissolvidos e
avolumados, com gua ultra pura, 1L.

Uma vez preparado o tampo fosfato, utiliza-se 100 mL do mesmo e 15,2 g de cloreto de
sdio (Qhemis) para o preparo de 2 L de tampo fosfato salino. Esse procedimento repetido
mais nove vezes para completar um volume final de 20 L.
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Aps o preparo da soluo a mesma filtrada utilizando-se um sistema de filtrao a

vcuo, devidamente lavado com cido, e uma membrana de ster de celulose de 0,22 m
(Millipore). So filtrados 10 L por vez aos quais adiciona-se 0,5 g de azida sdica.

III. 2.c. Diluio de Syto 13

Dilui-se (1:8) a soluo estoque do marcador de cido nuclico syto 13 (Invitrogen

Molecular Probes) em gua ultra pura. O syto 13 diludo preparado aliquotado em microtubos de
2 mL e conservados a -24C.

III. 2.d. Formaldedo 2% (m/v)

Dilui-se (1:20) a soluo estoque de formaldedo 40% em gua dor mar filtrada em filtro de
seringa com membrana de Ester de celulose com poro de 0,22 m (Millipore).

III. 2.e. Tween 80 10% (v/v)

Dilui-se (1:10) o reagente tween 80 (Synth) em gua ultra pura, aquecendo em banho maria
e constante agitao.

III. 2.f. Pirofosfato de sdio 10 mM

Dissolve-se 0,2661g de pirofosfato de sdio (Synth) e avoluma-se 100 mL com gua ultra
pura.

III. 3. Anlises

III. 3.a. Abundncia bacteriana de guas (costeiras e ocenicas)

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Durante a coleta so transferidos 1,7 mL de amostra para microtubos e, ao mesmo, so

adicionados 85 L de formaldedo 40% (m/v) para fixao da amostra que, em seguida,
preservada em nitrognio lquido (Figura 2).

Figura 2: (a) Organizao das amostras em caixas para galo de nitrognio lquido. (b) Gales de nitrognio
lquido para armazenamento das amostras.

Para a anlise adiciona-se em um microtubo de 1 mL 250 L de amostra e 10 L de Syto 13.

A mistura homogeneizada e incubada durante 15 minutos protegida da luz. A ps a incubao
adiciona-se de 1 L 3 L de soluo de microesferas de ltex (Polysciences), dependendo da
concentrao da amostra, e feita a leitura no citmetro CyAn ADP (DakoCytomation) equipado
com um laser de estado slido (488 nm, 25 mW) e com modificaes nos filtros (verde FL1 em
510 mais ou menos 15 nm, e vermelho FL4 em 650 mais ou menos 10 nm). Para aquisio e
processamento dos dados foi utilizado o programa Summit verso 4.3 (DakoCytomation).
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Figura 3: Material necessrio para o preparo das amostras

para leitura no citmetro de fluxo.

Observao: A determinao do volume de soluo de microesferas de ltex a ser adicionado

feita aps uma leitura prvia da amostra no citmetro de fluxo, onde se observa a concentrao
relativa da amostra. No caso de amostras com concentrao muito alta de bactrias, a mesma
diluda em tampo fosfato salino filtrado, pouco antes da anlise, com filtro de seringa com
membrana de Ester de celulose com poro de 0,22 m (Millipore).

III. 3.b. Abundncia bacteriana de sedimento marinho

Durante a coleta, com auxlio de uma esptula de madeira autoclavada, o sedimento

colocado dentro de um microtubo at completar 3/4 do volume do tubo que, ento conservado
em nitrognio lquido.
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Durante o preparo para a anlise so feitas trs rplicas de cada amostra pesando-se, em
tubos de centrifuga de 15 mL, 0,5g de sedimento, conforme mostra a figura 4. Em seguida,
adiciona-se 3 mL formaldedo 2 % (m/v) diludo em gua do mar filtrada e incuba-se 4C
durante 30 minutos. Passados os 30 minutos a amostra congelada -20C por aproximadamente
24 horas.

Figura 4: Pesagem do sedimento em balana analtica para extrao de bactrias.

Para extrao das bactrias a amostra descongelada e, a mesma, so adicionados 5 L de

tween 80 10% (v/v), 1 mL de pirofosfato de sdio 10mM e 4mL de gua ultra pura. A amostra
homogeneizada vinte vezes e imediatamente sonicada em processador ultrasnico (130W) com
potncia de 75% durante 3 minutos com intervalos de 30 segundos nos quais homogeneizada.
Aps a sonicao o tubo contendo a amostra permanece num recipiente com gua durante 15
minutos aps os quais novamente homogeneizada e centrifugada em centrfuga Sigma 4K15
(figura 5) a 800g por 1 minuto.
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Para a anlise, transfere-se 10 L do sobrenadante para microtubo onde tambm so

adicionados 240 L de tampo fosfato salino, para diluio da amostra, 10 L de Syto 13 e 5 L
de soluo de microesferas de ltex seguindo, ento, para leitura no citmetro.

Figura 5: Citmetro de fluxo com os sistemas de injeo de fluido carreador e descarte de esgoto.

IV. Discusso

Aps a coleta necessrio que a preservao da amostra seja feita o mais rpido possvel a
fim de se evitar perdas. Nessa etapa, utilizam-se fixadores a base de aldedos (formaldedo), uma
vez que estes formam ligaes cruzadas inter e intramoleculares com protenas e,
consequentemente, fortalecem os componentes da clula.
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No caso de amostras de gua a fixao necessria unicamente para evitar a degradao

celular, o que poderia ocasionar erro na contabilidade ou mesmo rudos durante a leitura da
amostra no citmetro. Por outro lado, quando se trata de amostras de sedimento, alm de evitar
rudos e erros na contabilizao das clulas, necessrio manter a integridade das mesmas aps a
sonicao, tornando a fixao indispensvel.

Para determinadas amostras torna-se necessria a realizao de diluies com PBS filtrado
em membrana de 0,22 m pouco antes da anlise. Neste caso, a diluio justifica-se pelo aumento
da probabilidade de se computar mais de um evento ou clula por vez, o que pode ocasionar um
erro na contabilidade.

A sonicao, numa viso geral, um processo que utiliza energia das ondas sonoras
auxiliando no processo de agitao das partculas contidas num recipiente, podendo ser usada para
acelerar a dissoluo de determinadas substncias, provimento de energia necessria para uma
determinada reao qumica, degradao de meteriais orgnicos entre outros. Nesse caso,
utilizando uma potncia adequada, a sonicao atua como uma etapa fsica para desagregao das
bactrias da matriz do sedimento. Esta etapa necessria para que no ocorra somente a
quantificao das bactrias em suspenso, levando a um erro nos resultados. vlido ressaltar que
a utilizao de uma potncia abaixo da ideal pode levar a uma ineficincia na separao das
bactrias das partculas do sedimento, assim como, uma potncia muito elevada pode ocasionar
lise celular.

O processador ultrasnico mantido dentro de um caixa de madeira (figura 6) para

minimizar os rudos provenientes do mesmo, uma vez que so prejudiciais audio.
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Figura 6: Processador ultrasnico (130W).

A utilizao de pirofosfato de sdio na extrao de bactrias de sedimento justificada pela

atuao dessa substncia como detergente ou surfactante, possibilitando a extrao das clulas do
material particulado e prevenindo que estas se liguem novamente matriz do sedimento.

Durante a anlise de amostras de sedimento marinho, as partculas presentes na mesma

podem interferir na leitura do citmetro. Para evitar esse erro realizada a centrifugao da
amostra numa velocidade especfica, determinada a partir da bibliografia, para que somente as
partculas do sedimento sejam depositadas no fundo do tubo de centrfuga e as bactrias
permaneam em suspenso.

A tcnica utilizada para contagem detecta tanto as bactrias autotrficas quanto as

heterotrficas. As bactrias autotrficas podem ser detectadas atravs de um de seus produtos,
clorofila, que quando excitada pelo laser, emite fluorescncia. No caso das bactrias heterotrficas
que no produzem pigmentos que possam ser detectados necessria a utilizao de um marcador
de cido nuclico (Syto 13) que quando excitado pelo laser a 488 nm emite fluorescncia verde
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que detectada pela fotodetectora. Como nas amostras utilizadas, gua e sedimento marinho, se
encontram tanto bactrias autotrficas quanto heterotrficas, ambas so marcadas com Syto 13,
porm, emitem nveis de florescncia diferentes devido maior ou menor quantidade de cido
nuclico. Essa diferena na emisso de fluorescncia juntamente com o tamanho da clula vai
gerar pontos em diferentes reas do grfico caracterizando as bactrias como autotrficas ou
heterotrficas.

Como mencionado na metodologia, adiciona-se, na amostra, certo volume de soluo de

microesferas de ltex. Essas microesferas de ltex possuem tamanho e fluorescncia conhecidos e
so usadas como uma forma de calibrao do citmetro de fluxo. Quando as microesferas so
contabilizadas, essas devem gerar pontos que se localizam dentro de uma regio delimitada do
grfico (figura 7). Se os pontos relativos s microesferas carem fora da regio delimitada um
indcio de que ou as mesmas esto degradadas ou o aparelho esta desregulado. Duas ou mais
microesferas aderidas podem ser computadas como uma esfera maior, ocasionando maior
espalhamento frontal e tambm emitir maior fluorescncia. Por outro lado, uma microesfera
degradada emite fluorescncia mais baixa, assim como um tamanho menor, gerando menor
espalhamento lateral.
Para verificar qual das duas opes anteriores vlida, a soluo de microesfras de ltex
observada num microscpio de epifluorescncia. Se aps a observao no microscpio no for
detectada nenhuma alterao nas microesferas porque o aparelho est desregulado. Como
mencionado anteriormente, as microesferas de ltex so contabilizadas durante a leitura da
amostra. Uma vez que as esferas contidas na soluo so previamente contabilizadas em
microscpio de epifluorescncia, estas proporcionam uma maior confiabilidade nos resultados
obtidos na contabilizao das clulas pelo citmetro de fluxo.

Como introduzido no inicio do trabalho ao passarem pela fotodetectora as clulas

marcadas, emitem fluorescncia e so detectadas e computadas, gerando pontos num grfico
denominado citograma. O citograma gerado pode ter alguns parmetros determinados pelo
operador do aparelho como o ajuste de cores e da rea dos quadrantes onde cada tipo celular,
dependendo do tamanho e da fluorescncia, ir cair.
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Devido origem da amostra e a metodologia utilizada para o tratamento da mesma, os

citogramas de amostras de gua e sedimento apresentam perfis diferentes. Amostras de gua
apresentam citogramas com menos rudo e uma menor quantidade de clulas quando comparadas
com amostras de sedimento (figura 7). A maior quantidade de rudos na amostra de sedimento
devido s partculas da matriz do sedimento que no foram retiradas na etapa de centrifugao.

Figura 7: Citogramas tipo Dot Plot de Fluorescncia verde (FL1) contra a fluorescncia vermelha (FL4). (a)
Amostra de gua. (b) Amostra de sedimento.

Na anlise por citometria de fluxo, os cidos nuclicos das bactrias fluorescem em verde,
devido ao Syto 13, e a clorofila, no caso das bactrias, autotrficas, em vermelho. Utilizando esses
parmetros mais o espalhamento lateral podem se analisar as diferentes populaes de bactrias
com facilidade. Os resultados da anlise so nuvens de pontos em grficos escolhidos pelo
operador. Usualmente, utiliza-se um grfico do espalhamento lateral (SSC) contra a fluorescncia
verde, conforme mostra a figura 8.c, e tambm, um grfico da fluorescncia verde (FL1) conta
fluorescncia vermelha (FL4) como ilustrado na figura 8.b. Alm da contagem total de clulas,
uma informao importante que pode ser obtida a separao de clulas por contedo aparente
de cidos nuclicos. Segundo as caractersticas de espalhamento lateral (SSC), da fluorescncia
(Syto 13 ligado aos cidos nuclicos) e auto-fluorescncia da clorofila (quando retiramos
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autotrficos da contagem), as bactria podem ser classificadas como sendo de alto contedo de
cidos nuclicos (HNA) e de baixo contedo de cidos nuclicos (LNA).

Figura 8: Citogramas tpicos com os diferentes painis e informaes obtidas da FCM, ilustrando em verde bactrias HNA, em azul bactrias
LNA, em amarelo as microesferas de ltex de 1,5 m. (a) Espalhamento lateral (SSC) contra a fluorescncia verde (FL1). (b) Fluorescncia verde
(FL1) contra a fluorescncia vermelha (FL4). (c) Histograma da fluorescncia verde (FL1). Fonte: Andrade & Paranhos, 2007.

As tcnicas tradicionais de microscopia no se adaptam a estudos em larga escala, como

operaes oceanogrficas, que geralmente produzem mais amostras do que a capacidade de
analis-las. Sendo assim, uma vantagem da citometria de fluxo a capacidade de avaliar um
grande nmero de clulas (10 mil) em pouco tempo (1 minuto), alm de possibilitar ensaios
multiparamtricos, reduzindo o tempo necessrio para a determinao da abundncia bacteriana, o
tamanho das clulas e sua atividade com enorme vantagem em relao contagem ao
microscpio.

Por outro lado, com a utilizao dessa tcnica, no possvel avaliar a forma das clulas
analisadas, sendo as mesmas, nesse contexto, apenas pontos de luz. Outra desvantagem o alto
custo do equipamento que acaba sendo um impedimento para o avano dessa tcnica nas cincias
ambientais.

V. Consideraes Finais
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Atualmente sob o comando do Doutor Rodolfo Pinheiro da Rocha Paranhos o Laboratrio

de Hidrobiologia foi o destino escolhido por mais de quarenta alunos do IFRJ para realizao do
estgio.

Proporcionando um bom ambiente de trabalho, o laboratrio possui diversas atividades

onde o crescimento do estagirio visado. Trabalhos fora do laboratrio tambm so acessveis
aos alunos como, por exemplo, a coleta realizada mensalmente na Baa de Guanabara que torna o
estgio mais atrativo.

Esse estudo, de total relevncia nos dias atuais, foi fundamental no aprendizado e
amadurecimento pessoal no cotidiano do laboratrio alm de ser um alerta para a preservao
ambiental.

Durante o perodo de estgio pude colaborar com o laboratrio introduzindo algumas

modificaes nos protocolos de anlise que, no futuro, podem vir a contribuir com uma melhor
realizao do trabalho pro parte de novos estagirios.

No futuro, pretendo atuar como tcnica na rea militar assim como concluir a faculdade de
biologia no IFRJ.

VI. Agradecimentos

Em primeiro lugar, gostaria de agradecer a minha famlia que sempre me apoiou nos
estudos assim como em outros momentos da minha vida.

Aos professores do IFRJ que proporcionaram um ensino de qualidade, sempre com a

preocupao em formar profissionais altamente qualificados.

Por ltimo, agradeo aos meus amigos do IFRJ que sempre me deram fora e incentivo
para concluir o curso.

VII. Referncias Bibliogrficas

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1. ANDRADE, Luciana; PARANHOS, Rodolfo. Aplicaes da Citometria de Fluxo na Ecologia

Microbiana. Boletim da Sociedade Brasileira de limnilogia, n. 36 (1), p. 20-24, Maio. 2007

2. Andrade, L.; Gonzalez, A.M.; Araujo, F.V.; Paranhos, R. Flow cytometry assessment of
bacterioplankton in tropical marine environments. J. Microbiol. Meth., 55: 841-850, 2004.

3. Del Giorgio, P.A.; Bird, D.F.; Prairie, Y.T.; Planas, D. Flow cytometric determination of
bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain syto 13. Limnol Oceanogr,
41(4), 783-789, 1996.

4. Kolm, H.E.; Giamberardino Filho, R.E.; Korman, M.C. Spatial distribution and temporal
variability of heterotrophic bacteria in the sediments of Paranagu and Antonina Bays, Paran,
Brazil. Rev. Microbiol., 28, 230-238, 1997.

5. Carvalho, K.D.C.; Distribuio de Bactrias em Sedimentos da Bacia de Campos, Oceano

Atlntico. Programa de Ps-Graduao em ecologia, Abril. 2010.