Manual de Prácticas - Biotecnologia Ambiental - Perfecto

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS
Ingeniero Bioqumico Ambiental
Manual de Prcticas
de Laboratorio
Biotecnologa Ambiental
Dra. Susana del Carmen de la Rosa Garca
Modelo Basado en Competencias
2015
Como citar este manual:
De la Rosa-Garca SC 2014. Manual de prcticas de laboratorio de Biotecnologa Ambiental Facultad de

Ciencias Qumico Biolgicas, Universidad Autnoma de Campeche. Mxico. 64 pp.
UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE
Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas
Manual de Prcticas de Laboratorio
Compilado por:
Dra. Susana del Carmen De la Rosa Garca
Aprobado por Academia de IBA-LCTA.
Fecha:
Validado por Consejo Tcnico.
Fecha:
DIRECTORIO
Lic. Gerardo Montero Prez

Rector de la Universidad Autnoma de Campeche
Lic. Manuel Sarmiento Morales

Secretario General de la Universidad Autnoma de Campeche
Mtra. Anglica Soto Martnez

Coordinadora General Acadmica de la Universidad Autnoma de Campeche
Mtra. Mara Guadalupe Maldonado Velzquez.

Directora de la Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas
M. en C. Primavera Garca Prez

Coordinadora de la Licenciaturas de IBA-LCTA
M en C. Jos Eduardo Martn Pool Gmez

Presidente de la Academia de las Licenciaturas de IBQ Ambiental y LCTA
Dra. Susana del Carmen De la Rosa Garca

Catedrtica de la unidad de aprendizaje de Biotecnologa Ambiental
NDICE
1. ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRCTICAS ...................................................................... 1

1.1 INTRODUCCIN ............................................................................................................... 1
1.2 COMPETENCIA A LAS QUE CONTRIBUYE ..................................................................... 2
1.3 COMPETENCIA UBICADA DENTRO DEL MAPA CURRICULAR ..................................... 3
1.4 NIVEL DEL DESEMPEO................................................................................................. 4
2. PROGRAMA DEL SISTEMA DE PRCTICAS ..................................................................... 5
3. PRCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD ....................................................................... 6
3.1 RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE ............................................................... 6
3.2 NORMAS OFICIALES MEXICANAS QUE APLICAN PARA TODAS LAS PRCTICAS ... 8
4. PARAMETROS DE EVALUACIN ..................................................................................... 8
4.1 SISTEMA DE RUBRICAS.................................................................................................. 9
4.2 CRITERIO .......................................................................................................................... 9
4.3 PARMETRO .................................................................................................................. 10
PRCTICA 1 ......................................................................................................................... 11
SELECCIN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE AMILASA ............................................. 11
PROPSITO DE LA PRCTICA............................................................................................ 11
CRITERIO DEL DESEMPEO .............................................................................................. 12
RESULTADOS ESPERADOS ................................................................................................ 12
NORMAS DE SEGURIDAD ESPECFICAS EN LA PRCTICA .............................................. 12
INTRODUCCIN .................................................................................................................. 13
METODOLOGA ................................................................................................................... 14
RECURSOS MATERIALES ................................................................................................... 14
TCNICA ............................................................................................................................... 15
PRIMERA SESIN ................................................................................................................ 15
SEGUNDA SESIN .............................................................................................................. 15
TERCERA SESIN ................................................................................................................ 16
CUESTIONARIO ................................................................................................................... 17
PARAMETROS DE EVALUACIN ....................................................................................... 17
LISTA DE COTEJO................................................................................................................ 18
CUADRO DE DISPOSICIN DE DESECHOS ....................................................................... 18
DIAGRAMA ECOLGICO DE LA PRCTICA ....................................................................... 19
BIBLIOGRAFA UTILIZADA ................................................................................................. 19
PARA SABER MS ............................................................................................................... 20
PRCTICA 2 ......................................................................................................................... 21
AISLAMIENTO DE BACTERIAS TERMOTOLERANTES...................................................... 21
INTRODUCCIN .................................................................................................................. 23
METODOLOGA ................................................................................................................... 24
TCNICA ............................................................................................................................... 25
PRIMERA SESIN ................................................................................................................ 25
SEGUNDA SESIN .............................................................................................................. 25
TERCERA SESIN ................................................................................................................ 26
CUESTIONARIO ................................................................................................................... 27
LISTA DE COTEJO................................................................................................................ 28
PARA SABER MS ............................................................................................................... 30
PRCTICA 3 ......................................................................................................................... 31
AISLAMIENTO DE HONGOS DEGRADADORES DE CELULOSA ...................................... 31
INTRODUCCIN .................................................................................................................. 33
METODOLOGA ................................................................................................................... 34
TCNICA ............................................................................................................................... 35
PRIMERA SESIN ................................................................................................................ 35
SEGUNDA SESIN .............................................................................................................. 35
TERCERA SESIN ................................................................................................................ 36
CUESTIONARIO ................................................................................................................... 37
LISTA DE COTEJO................................................................................................................ 37
PARA SABER MS ............................................................................................................... 39
PRCTICA 4 ......................................................................................................................... 40
AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEGRADADORES DE PETRLEO................................... 40
INTRODUCCIN .................................................................................................................. 42
METODOLOGA ................................................................................................................... 43
TCNICA ............................................................................................................................... 44
PRIMERA SESIN ................................................................................................................ 44
SEGUNDA SESIN .............................................................................................................. 45
TERCERA SESIN ................................................................................................................ 45
CUESTIONARIO ................................................................................................................... 46
LISTA DE COTEJO................................................................................................................ 46
PARA SABER MS ............................................................................................................... 48
PRCTICA 5 ......................................................................................................................... 49
ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE BACTERIAS DEGRADADORES DE PETRLEO........... 49
INTRODUCCIN .................................................................................................................. 51
METODOLOGA ................................................................................................................... 52
TCNICA ............................................................................................................................... 53
PRIMERA SESIN ................................................................................................................ 53
SEGUNDA SESIN .............................................................................................................. 54
TERCERA SESIN ................................................................................................................ 54
CUESTIONARIO ................................................................................................................... 55
LISTA DE COTEJO................................................................................................................ 56
PARA SABER MS ............................................................................................................... 58
ANEXO 1 (Guas descripcin colonial) ................................................................................. 59
ANEXO 2 (Frmulas) ........................................................................................................... 60
ANEXO 3 (Tablas ejemplo) .................................................................................................. 61
ANEXO 4 (Composicin de Medios de cultivos) ................................................................. 62
ANEXO 5 (Portada reporte prctica) .................................................................................. 63
ANEXO 5 (Contenido del reporte de la prctica) ............................................................... 64
MANUAL DE PRCTICAS DE BIOTECNOLOGA AMBIENTAL 2015
1. ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRCTICAS
1.1 INTRODUCCIN
La biotecnologa consiste en un gradiente de tecnologas que van desde las tcnicas de la

biotecnologa "tradicional", largamente establecidas, ampliamente conocidas y muy utilizadas
(ejemplo la fermentacin de alimentos, control biolgico natural), hasta la biotecnologa
moderna, que utilizas las tcnicas del DNA recombinante, los anticuerpos monoclonales y los
nuevos mtodos de cultivo de clulas y tejidos. La biotecnologa se desarrolla en el marco de un
enfoque multidisciplinario que involucra varias disciplinas y ciencias, por lo que utilizars toda la
informacin adquirida durante tu trayectoria acadmica, desde las materias bsicas como la
Qumica orgnica, bioqumica, Microbiologa, hasta las ms complejas como Bioqumica
microbiana, Microbiologa ambiental, y obviamente la Biologa molecular.
El objetivo del este manual es desarrollar tu inters para explorar y explotar la capacidad
biosntesis de microorganismos poco comunes, que jams pensante que tendra una aplicacin,
como aquellos que habitan los ambientes ms inhspitos como la piedra. Ya que es innegable
que el potencial y mltiples aplicaciones de los microrganismos extremfilos, han marcado un
parteaguas en la biotecnologa, como las enzimas termotolerantes que han cambiado el rumbo
del diagnstico e identificacin molecular de muchos organismos. Pero tambin han abierto las
puertas a nuevas tecnologa para la biodegradacin de diversos compuestos xenobiticos y
recalcitrantes, biominera, as como en la produccin de biopolmeros, enzimas,
biofertilizantes, electricidad y biocombustibles.
El presente manual est diseado con el propsito mostrarte las diversas estrategias y
metodologa que te permitan el aislamiento de nuevos microorganismo, que puedan aplicarse
usados a las estrategias de biorremediacin y as modificar los procesos microbianos tpicos de
tratamiento de aguas, suelo y residuos, en el marco de la legalidad tica, en la constante
bsqueda de mitigar el impacto ambiental regional y nacional. En cada prctica se te brinda la
oportunidad de que uses tu creatividad en la eleccin de diferentes muestras y estrategias de
aislamiento, que te permitan la recuperacin de una mayor cantidad y variedad de
microorganismos con potencial biotecnolgico, adems con el uso de metodologas dirigidas
podrs demostrar su eficiencia y sus posibles aplicaciones.
QBA. Susana del Carmen De la Rosa Garca PhD
UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE INGENIERO BIOQUMICO AMBIENTAL

1
1.2 COMPETENCIA A LAS QUE CONTRIBUYE
Las competencias que se pretenden desarrollar en los estudiantes y que se consideran

transferibles al mbito laboral son las siguientes:
Competencia Genrica: Habilidad de investigacin, capacidad metodolgica, capacidad

emprendedora y sensibilidad para temas medioambientales.
Competencia Especfica: Desarrolla sistemas de gestin ambiental integral para optimizar el uso
de recursos naturales, humanos y econmicos logrando una interaccin adecuada entre la
naturaleza, sociedad y empresa, considerando la normatividad en un marco de planeacin
estratgica y trabajo multidisciplinario.
Competencia del rea de conocimiento: Disear, desarrollar y adaptar tecnologas ambientales

para prevenir, reducir y controlar la contaminacin del agua, aire, suelo mediante el uso de la
legislacin nacional e internacional vigente y el manejo adecuado de los recursos naturales.
Competencia de la Unidad de Aprendizaje: Identificar y modificar los procesos microbianos

tpicos para tratamiento de aguas, suelo y residuos en va de utilizar nuevas estrategias de
Biorremediacin en el marco de la legalidad tica, que mitiguen el impacto ambiental regional y
nacional.

2
1.3 COMPETENCIA UBICADA DENTRO DEL MAPA CURRICULAR
La materia de Biotecnologa Ambiental es una materia obligatoria que se oferta en el octavo

semestre. La materia ofrece una oportunidad integradora ya que esta al final de una serie de
materias bsicas (Biologa, Ecologa y Qumica orgnica bsica), y sustantivas (Microbiologa
bsica, Bioqumica, Bioqumica avanzada y Bioqumica Microbiana) con apoyo de otras
materias integradoras como Biologa Molecular bsica, Impacto ambiental, Auditora
ambiental y Ecotoxicologa.

3
1.4 NIVEL DEL DESEMPEO
Nivel de Competencia:
Al finalizar tus prcticas logrars un nivel de competencia Nivel 4 ya que obtendrs las
herramientas necesarias para la toma de decisiones sobre qu tipo de muestras y metodologa
elegir para tener xito en la recuperacin de microorganismos con alto potencial biotecnolgico, as
como su eficiencia para solucionar problemas ambientales, estas habilidades te permitirn
insertarse y competir en el mercado profesional. Al realizar en equipo e individualmente los diseos
metodolgicos, habrs adquirido las habilidades para la elaboracin de futuros proyectos
novedosos y viables con la capacidad de manejar personal multidisciplinarios, en la resolucin de
problemas ambientales dentro del marco de la legalidad: que pueden ser sometidos antes
autoridades gubernamentales, o empresas privadas para su financiamiento y ejecucin.

4
2. PROGRAMA DEL SISTEMA DE PRCTICAS
Subcompetencia Nombre de la prctica Objetivo de la prctica mbito el Programacin Nivel de

desarrollo desempeo
Semanas Duracin
(hrs)
I. Analizar la utilidad de la Seleccin de bacterias Aislar y determinar el potencial para Laboratorio 3 6 3
biotecnologa y el manejo de las productoras de amilasa producir la enzima amilasas a partir de
enzimas para comprender su
aplicacin en los procesos diferentes muestras de suelos
bioindustriales
Aislamiento de bacterias Uso de diferentes tcnicas de aislamiento, Laboratorio 3 6 3
termotolerantes para la recuperacin de una mayor
numero de bacterias termotolerantes, a
partir de muestras de ambientes
extremos.
Aislamiento de hongos Uso de diferentes tcnicas de aislamiento Laboratorio 3 6 3

degradadores de celulosa para seleccionar hongos epilticos que
proviene de ambientes extremos con alta
capacidad degradante de la celulosa.
II. Analizar los problemas Aislamiento de bacterias Aislar bacterianas degradadoras de Laboratorio 3 6 4
ambientales y su posible control, degradadoras de petrleo petrleo de muestras contaminadas con
remediacin y/o eliminacin
mediante el uso de estrategias y petrleo usando medios que contienen
microrganismos conocidos, y hidrocarburos como nica fuente de
proponer la bsqueda de carbono.
microrganismos novedosos que
permitan un control ms efectivo en Actividad emulsificante de Determinar la capacidad emulsificantes de Laboratorio 3 6 4
la solucin de problemas bacterias degradadoras de bacterias con capacidad de crecer sobre
ambientales en el marco de la
legalidad y tica. petrleo hidrocarburos.

5
3. PRCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD
3.1 RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE
Las prcticas de laboratorio aqu diseada, requieren de la manipulacin de muestras

biolgicas y microorganismos, y an que estos no son patgenos, es importante que trabajes
de manera ordenada, respetando tu rea de trabajo y la de tus compaeros, con la finalidad
evitar algn accidente que ponga en riesgo tu integridad personal o tu salud. Por tal motivo es
importantes que leas y observes cuidadosamente las siguientes reglas de laboratorio y que
conozca las Normas Oficiales Mexicanas de seguridad que aplican en el laboratorio. Al finalizar
las prcticas debes separa los residuos generados siguiendo las disposiciones generales de
gestin ambiental de nuestra institucin.
1- Durante cada prctica, de manera obligatoria debes portar la bata de laboratorio de

algodn bien abotonada, y calzar zapatos de piel cerrados.
2- Antes de realizar una prctica, debes leer detenidamente el contenido de la prctica a
realizar para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. (Los resultados
deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan).
3- Las pertenencias y objetos personales que no sea indispensables durante el desarrollo de
la prctica de laboratorio, debern ser colocados en el lugar que corresponda (anaqueles,
armarios, etc.), de tal forma que el rea de trabajo quede despejada
4- Despus de 20 minutos de retraso en la hora de entrada programada, se considerar
como falta.
5- Antes de iniciar cualquier prctica, debes limpiar tu lugar de trabajo con un desinfectante,
dejando actuar al menos unos 5 minutos antes de iniciar y al finalizar la prctica.
6- El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. En
consecuencia, al terminar cada prctica debes lavar cuidadosamente el material que se ha
utilizado. Cada equipo ser responsable de su zona de trabajo y de su material.
7- Protege cualquier herida de tus manos con curitas, guantes o cualquier otra barrera de
proteccin.
8- No debes tocar con los guantes superficies tales como de telfonos, teclados, carpetas,
cuadernos, tu cara si estas o has estado trabajando con material biolgico.
9- Debes lavarte perfectamente las manos con jabn o con un desinfectante, al inicio y al
dejar el laboratorio.
10- Los accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras,
debers comunicarlo inmediatamente.
11- Al finalizar la prctica el material debes desechar los residuos en los contenedores
asignados, materia orgnica, materia inorgnica, etc.

6
12- El material biolgico deber ser colocado en bolsas para su esterilizacin y su posterior
desecho.
13- Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, en otros) deben mantenerse alejados de
las llamas de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado
de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. Cuando no se utilizan los mecheros, stos
deben guardarse y debes estar seguro que has apagado al final de cada da de prctica.
14- Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el
que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin.
15- Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios,
debes manejarlos con cuidado para evitar que se golpes o el forzar los mecanismos.
16- Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con microorganismos
(como pipetas usadas, placas Petri o tubos), debes colocarlos en soluciones
desinfectantes para posteriormente proceder posteriormente a su esterilizacin.
17- Nunca deben sustraerse ningn equipo, medio o cultivos de microorganismos del
laboratorio.
18- Nunca introducir o ingerir cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
19- No se admiten visitas personales que distraigan la atencin y pongan en riesgo la
seguridad en el trabajo que se realizar.
20- Al terminar la prctica, asegrese de que las llaves de gas y agua queden cerradas.
21- Todo el material de laboratorio utilizado durante la prctica lo debers entregarse
perfectamente.
NOTA: Es de suma importancia leer y cumplir con el reglamento de laboratorio vigente en la

facultad.

7
3.2 NORMAS OFICIALES MEXICANAS QUE APLICAN PARA TODAS LAS PRCTICAS
Durante tu asistencia a las prcticas debers leer y observar y las siguientes normas de
seguridad.
NORMA REFERENTE A
Edificios locales, instalaciones y reas en centros de trabajo-condiciones de
NOM-001-STPS-2008
seguridad.
Condiciones de seguridad -Prevencin y proteccin contra incendios en los
NOM-002-STPS-2010
centros de trabajo.
Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el

NOM-005-STPS-1998
manejo, transporte y almacenamiento de sustancias qumicas peligrosas.
Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se manejen,

NOM-010-STPS-1999 transporten, procesen o almacenen sustancias qumicas capaces de generar
contaminacin en el medio ambiente laboral.
NOM-025-STPS-2008 Condiciones de iluminacin en los centros de trabajo.
NOM-017-STPS-2008 Equipo de proteccin personal, uso y manejo en los centros de trabajo.
Sistema para la identificacin y comunicacin de peligros y riesgos por sustancias

NOM-018-STPS-200O
qumicas peligrosas en los centros de trabajo.
Constitucin, integracin, organizacin y funcionamiento de las comisiones de

NOM-019-STPS-2011
seguridad e higiene.
Colores y seales de seguridad e higiene, e identificacin de riesgos por fluidos

NOM-026-STPS-2008
conducidos en tuberas.
NOM-028-STPS-2004 Organizacin del trabajo - Seguridad en los procesos de sustancias qumicas.
NOM-030-STPS-2009 Servicios preventivos de seguridad y salud en el trabajo- Funciones y actividades.
NOM-052-SEMARNAT-2005 Establece las caractersticas, el procedimiento de identificacin, clasificacin y los

listados de los residuos peligrosos.
NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 Proteccin ambiental-Salud Ambiental-Residuos Peligrosos Biolgicos-
Infecciosos- Clasificacin y especificaciones de manejo.
4. PARAMETROS DE EVALUACIN
Al trmino de cada prctica, se evaluar tu desempeo mediante la siguiente rbrica y en la
cual se considerar el siguiente cdigo de colores con el respectivo porcentaje para cada uno de
ellos

8
Evidencias a entregar por el estudiante:

Tabla de cotejo validadas por el docente
Reporte de prctica
4.1 SISTEMA DE RUBRICAS
1 Seguridad general 10%

2 Muestras y procesamientos 40%
3 Descripcin de los aislamiento y actividades biolgicas 10%
4 Lista de cotejo 10%
5 Reporte de la prctica 30%
100%
4.2 CRITERIO
CRITERIOS NIVEL DEL DOMINIO
EXCELENTE BUENO DEFICIENTE
Seguridad general Realizaste la prctica de Realizaste la prctica de Realizaste la prctica de
laboratorio atendiendo todos laboratorio atendiendo laboratorio pero NO
los procedimientos de algunos los procedimientos atendiste a todos los
seguridad. de seguridad. procedimientos de
seguridad.
Parmetros cumplidos 5/5 3/5 1/5
Muestras y procesamiento Demuestra dominio en el Demuestra dominio medio Demuestra un dominio
procesamiento de la muestras, en el procesamiento de la medio en el procesamiento
considerando su origen, muestras, considerando su de las muestras, pero no
usando las metodologa origen, usando las emplea la metodologa
necesarias para la recuperacin metodologa necesaria para necesaria para la
de microorganismos con la recuperacin de recuperacin de
potencial biotecnolgico. microorganismos con microorganismos con
potencial biotecnolgico. potencial biotecnolgico.
Descripcin de los Demuestra habilidades para Demuestra una habilidad Demuestra una habilidad
aislamiento y actividades describir, evidenciar y media para describir, nula para describir,
biolgicas diferenciar aislamientos con evidenciar y diferenciar evidenciar y diferenciar
potencial biotecnolgico. aislamientos con potencial aislamientos con potencial
biotecnolgico. biotecnolgico.
Lista de cotejo Entrego en tiempo y forma la Entregaste en forma pero no No entregaste en tiempo y
lista de cotejo en tiempo la lista de cotejo. forma la lista de cotejo.
Reporte de la prctica Cumpli en tiempo y forma la Cumpli en forma pero no en No Cumpli en tiempo y
entrega de la prctica, tiempo la entrega de la forma la entrega de la
ajustndose a los requisitos prctica, ajustndose a los prctica, ajustndose a los
requeridos con las evidencias requisitos requeridos con las requisitos requeridos con las
fotogrficas, cuadros y grficas evidencias fotogrficas, evidencias fotogrficas,
de los aislamiento activos. cuadros y grficas de los cuadros y grficas de los
aislamiento activos aislamiento activos

9
4.3 PARMETRO
LISTA DE COTEJO
PARAMETROS EVALUACIN
1. Trajiste impresa la prctica? DEL
2. Utilizaste la bata de forma correcta?
ESTUDIANTE
3. Colocaste adecuadamente tu zona de trabajo?
4. Seguiste las normas de seguridad en el laboratorio?
5. Te lavaste y desinfectaste las manos antes y despus de la prctica?
1. Trajiste las muestras solicitadas en el manual?
2. Elaboraste el diagrama de aislamiento de acuerdo al tipo de muestra?
3. Trabajaste de manera correcta en tu zona de esterilidad?
4. Realizaste de manera adecuadas el procesamiento de la muestras?
1. Traes la tabla para llenar las descripciones morfolgicas de los aislamientos?
2. Realizaste la descripcin atendiendo a la gua?
1.
3. Realizaste las evidencias fotogrficas de manera adecuada?
4.
2. Identificas claramente los aislamientos con actividad?
5. Identificas que tipo de sustratos son mejores para la obtencin de aislamientos con mayor
potencial biotecnolgico?
1. Trajiste impresa la hoja de cotejo?
2. Cumpliste con la entrega de la hoja de cotejo en el tiempo indicado?
1. Entregaste a tiempo la prctica?
2. Cumpliste con los requisitos de caratula, resultados, discusiones, cuestionario y
bibliografa?
3. Graficaste y comparaste los resultados obtenidos?
4. Tomaste las evidencias fotogrficas representativas de actividad biolgica
5. Completaste el cuestionario, soportado las respuestas con al menos dos referencias
Bibliogrficas?

10
PRCTICA 1
SELECCIN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE AMILASA
Imagen Izquierda: Caja con bacterias amilolticas revelada con iodo

Cortesa de: Judith Cruz Jimnez
Imagen derecha -amilasa 3.2.1.1.
Tomada de: Sundarram et al. 2014.
Nmero de profesionales en formacin por prctica (6 Equipos con 4 0 5 integrantes)
PROPSITO DE LA PRCTICA
El profesional en formacin ser capaz de aislar bacterias productoras de amilasas y
seleccionar sustratos idneos en la bsqueda en microorganismos amiloltic0s.

11
CRITERIO DEL DESEMPEO

Sers competente para determinar qu tipo de sustratos son los idneos para el aislamiento de
bacterias con potencial amiloltico, cuando:
Lleves las muestras solicitadas de acuerdo a las especificaciones de la prctica.

Realices el diseo de la metodologa a seguir para el aislamiento de las bacterias
productoras de la enzima amilasa considerando la muestra a procesar.
Procese e inocules de manera adecuada las diferentes muestras.
Realices la descripcin morfolgica de las bacterias aisladas con actividad amiloltica.
Determines el nmero total de bacterias aisladas en trmino de UFC/ml e Identifiques las
bacterias productoras de enzimas.
Seas capaz de calcular el ndice de actividad amiloltica.
Tomes las evidencias fotogrficas de la actividad amiloltica.
Reconozcas que tipo de sustratos son potenciales en la recuperacin de bacterias
amilolticas, considerando la cantidad y el ndice de actividad de los aislados.
Integres la informacin obtenida en forma de grficas, para una mejor interpretacin
resultados.
Revises al menos 3 referencia bibliogrficas del tema, para comparar los resultados
obtenidos.
RESULTADOS ESPERADOS
Tabla de cotejo validada por el docente.

Cajas con bacterias productoras de la enzima amilasa.
Reporte final de la prctica con evidencias fotogrficas que avalen la actividad
amiloltica, as como una y tabla que describa de la morfologa colonia de los aislamientos que
producen la enzima amilasa, con el cuestionario resuelto sustentado con al menos 3 referencias
bibliogrficas.
NORMAS DE SEGURIDAD ESPECFICAS EN LA PRCTICA

Tipo de peligro Como evitarlo Como proceder en caso de
Quemadura con fuego. Maneja las sustancias flamables Avisa inmediatamente al instructor.
alejadas del mechero. Sigue las instrucciones del uso del
No prendas un mechero con otro extinguidor en caso necesario.
mechero Utiliza el botiqun de primeros
Los mecheros de alcohol deben auxilios
estar secos por fuera. Colcate pomada de picrato en la
quemadura si es leve.

12
INTRODUCCIN
La enzimas de tipo amilasas son ubicadas de acuerdo a la Comisin de Enzimas (de sus sigla en
Ingls Enzyme Comisin) con el cdigo EC 3.2.1, y son aquellas enzimas que hidrolizan enlaces
entre oxgenos azufre-glucosdicos, De acuerdo al sitio de hidrlisis que efectan sobre la
molcula de almidn, glucgeno y otros polisacridos, se clasifican como endo y exo amilasas,
En el grupo de las endo amilasas las ms conocidas son la - amilasa (EC 3.2.1.1), la pululanasa
(EC 3.2.1.41), la glucan 1,4--maltohidrolasa (EC 3.2.1.133) y a la isoamilasa (EC 3.2.1.68),
(Nonaka et al., 2003).
En particular las enzimas -amilasas catalizan la

hidrlisis de enlaces glucosdicos internos -(1-4)
presentes en el almidn, glucgeno y otros
polisacridos, asimismo hidrolizan enlaces
glucosdicos -(1-6) en un menor porcentaje que el
-(1-4) (Fig. 1.1) (Vihinen y Mantsala, 1989).
Representan el tipo de amilasas ms estudiado y
se encuentran ampliamente distribuidas entre
plantas, animales, bacterias y hongos, sin
embargo debido a su gran demanda a nivel
industrial son producidas a gran escala por los dos
ltimos organismos (Kilara et al., 2002). Figura 1.1 Diferentes sitios de corte de la enzima -
amilasa sobre la molcula de almidn
(Tomado de http://lccbtis7.blogspot.mx/2011/06/enzimas.htlm)
Las amilasas estn conformadas en tres dominios (Kuriki

y col., 2005), el peso molecular de las -amilasas vara entre
10 y 139kDa (Vihinen y Mantsala, 1989). Las amilasas son
enzimas las cuales hidrolizan molculas de almidn dando
como productos dextrinas y polmeros compuestos
progresivamente por unidades de glucosa. Las amilasas
son producidas por diferentes microorganismos como
bacterias y hongos. Estas enzimas tienen diferentes
aplicaciones industriales como la alimentaria, bebidas
alcohlicas, panadera, detergentes entre otras. El suelo y
Figura 1.2. Estructura 3D de la -amilasa de el estircol de los rumiantes son los lugares idneos para
Bacillus cereus. Modificado de Protein Data B
encontrar microorganismos productores de amilasas. Por
ejemplo, B. licheniformis BS1 (Vaseekaran et al., 2010), B. subtilis MA9, B. cereus MK8 (Fig. 1.2),
(Devi et al., 2010) y diversas cepas de B. amyloliquefaciens son aisladas de estos sustratos.

13
Una de las grandes ventajas en la bsqueda de la

enzima amilasas, es su fcil deteccin, ya que solo
se requiere medios agarizados, donde la nica
fuente de carbono es el almidn y para revelar la
actividad se usa el yodo (Fig. 1.3). La utilidad de las
amilasas en el sector industrial es indudable, ya que
proporcionan una forma limpia de conversin o
eliminacin de polmeros, principalmente
almidones, adems tienen caractersticas
bioqumicas y enzimticas muy variadas, por lo que
pueden ser aadidas en cualquiera de las distintas
etapas de los procesos industriales en las que son
Figura 1.3. Deteccin de la actividad de la enzima empleadas la constante demanda de amilasas a
amilasa revelada con Yodo, (Tomado de Montor 2007)
nivel mundial ha conducido a la bsqueda de
amilasas con caractersticas importantes para la industria, naturalmente existen especies de
microorganismos que producen amilasas alcalinas, psicrfilas, termfilas y resistentes a
inhibidores.
METODOLOGA
RECURSOS MATERIALES
Muestra
Suelo caeros y estircol de rumiantes.
Material
Agua destilada
Solucin salina (0.85 % de NaCl)
Agar nutritivo
Almidn
Solucin de Yodo 1%
Algodn
Gasas
Papel Aluminio
Matraz Erlenmeyer de 250 ml.
Tubos de ensaye de 125 x 16 mm
Gradilla para tubo de ensaye de 125 x 16 mm

14
Marcador indeleble
Torunda de algodn y gasa
Esptula
Charola de pesado
Asa de platino
Equipo de laboratorio
Balanza
Placa de calentamiento
Autoclave
Estufa bacteriolgica
Campana de flujo laminar/Mechero
Sonicador
Micropipeta de 200-1000 L + puntas de 1 ml. /Pipeta de cristal de 1 ml + Propipeta
TCNICA
PRIMERA SESIN
1. Prepara 500 ml de agar nutritivo (AN) siguiendo las indicaciones del proveedor de acuerdo a
la marca del medio de cultivo (cantidad de agar y modo de preparacin), y adiciona 5 gramos
de almidn, disuelve y calienta hasta que el agar cristalice.
2. Coloca un tapn de algodn con gasa al matraz con medio y cbrelo con papel aluminio, y
esteriliza los matraces por 20 minutos a 120 C y 15 libra de presin.
3. Deja enfriar el matraz hasta una temperatura de aproximadamente 50 C (lo sabrs al tocar
rpidamente con el antebrazo el matraz y soportar la temperatura) y vierte el agar en las cajas
de Petri estriles de manera cuidadosa, de esta manera evitas la formacin de burbujas en las
placas. Deja enfriar sin mover las cajas para permitir que el agar se gelifique perfectamente,
invierte las cajas y djalas por 24 horas a 37 C, para que las placas pasen prueba de esterilidad.
SEGUNDA SESIN
1. Toma las diferentes muestras, y prepara por separado

con cada una dilucin 1:10 con solucin salina (pesa 1
gramos de la muestra y depostalo en un tubo con 9 ml de

15
solucin salina al 0.85%) y agita vigorosamente por un minuto, hasta obtener un solucin
homognea.
2. Toma 1ml. de la primera dilucin y continua haciendo diluciones; toma 1 ml de la dilucin

anterior y vierte en el siguiente tubo de ensayo que ya contiene 9 ml de solucin salina (dilucin
=10-2), y as consecutivamente hasta una dilucin 10-6.
3. Inocula 100 L de cada dilucin en la placas de Petri que contiene

el AN adicionado con almidn y con una asa extiende el inoculo por el
mtodo del pentgono.
4. Incuba las cajas a una temperatura de 35-37 C y checa el crecimiento bacteriano cada 24
horas.
TERCERA SESIN
1. Realiza la descripcin morfolgica de las colonias acuerdo a sus caractersticas

macroscpicas como: elevacin, borde, forma, adems de datos como color, tamao y
pigmentacin de cada una de las colonias que crecieron, usa la gua del Anexo 1, y documntala
en forma de tabla (Anexo 3).
2. Determina la concentracin total bacterias aisladas en Unidades Formadoras de Colonia

(UF/ml), usando la frmula 1 (Anexo 2).
3. Con una pipeta colocar con cuidado 5 ml de solucin yodo sobre la caja Petri y agita
suavemente la caja hasta cubrir completamente la superficie de agar. Las zonas en las que an
quede la presencia de almidn se teirn de un color entre azul y negro. Si las bacterias han
degradado almidn, aparecern zonas de color claro alrededor de las colonias (Fig. 1.3).
4. Determinar el ndice de activad de cada aislamiento activo usando la frmula 2 (Anexo2), y

documntala usando de gua la siguiente tabla ejemplo.

16
Tabla ejemplo 1.1. ndice de actividad amiloltica por sustrato procesado
Tipo de sustrato ndice de actividad amiloltica
5. Una vez que observaste y tomes las evidencias fotogrficas, debes seguir con el cuadro de
disposicin de desecho y el diagrama ecolgico de cuadro a las normativas institucionales.
CUESTIONARIO
1. Qu otra tcnica se puede usar para recuperar bacteria con actividad amiloltica,
argumenta los fundamentos de las tcnicas seleccionadas?
2. Diserte sobre todas las posibles aplicaciones biotecnolgico que tienen las enzimas con
actividad amiloltica?
3. Documenta las fuentes ambientales donde puedes recuperar con mayor xito bacterias
con actividad amiloltica, y por qu (argumenta)?
PARAMETROS DE EVALUACIN
Las habilidades desarrolladas durante la prctica y los conocimientos adquiridos, te sern
evaluadas con el reporte de la prctica y la lista de cotejo. El reporte lo entregaras en la
siguiente sesin de clase despus de finalizadas las 3 sesiones de esta prctica. La lista de
cotejo ser validad y promediada con mi evaluacin.
Seguridad general 10%

Muestras y procesamientos 40%
Descripcin de los aislamiento y actividades biolgicas 10%
Lista de cotejo 10%
Entrega de reporte 30%
100%

17
LISTA DE COTEJO
ESTUDIANTE
1. Trajiste impresa la prctica?
2. Elaboraste tu diagrama de aislamiento de acuerdo a la muestra?
4. Realizaste de manera adecuada el procesamiento de la muestra?
1. Trajiste la tabla para llenar las descripciones morfolgicas de los aislamientos?
2. Realizaste la descripcin morfolgica de los aislamientos atendiendo la gua de la prctica?
3.
6. Realizaste las evidencias fotogrficas?
4.
3. Identificaste claramente los aislamientos con actividad amiloltica?
5. Identificaste que tipo de sustrato son mejores para la obtencin de aislamientos con mayor
activad amiloltica?
2. Cumpliste con la entrega de la hoja de cotejo en el tiempo indicado
2. Cumpliste con los requisitos de caratula, resultados, discusiones, cuestionario y bibliografa?
3. Mostraste las imgenes ms representativas de la actividad amiloltica?
bibliogrficas?
6.
CUADRO DE DISPOSICIN DE DESECHOS
Tipo de desecho Procedimiento Tipo de contenedor
Tubos con diluciones Esterilizar en autoclave y dejar enfriar Drenaje

(R1)
Cultivos Microbianos Depositar las cajas de Petri con los cultivos Bolsa destinada para descartas el
(R2) microbianos en bolsas de plstico, y esterilizar de material biolgico
acuerdo a las instrucciones de uso en la autoclave
Solucin de Iodo con Depositar en un contenedor de cristal con tapa, Drenaje

cultivo microbiano esterilizar
(R3)

18
DIAGRAMA ECOLGICO DE LA PRCTICA
Tubos con diluciones de los

diferentes sustratos
Placa con crecimiento microbiano

R1
Revelar con yodo Esterilizar a 120C a 15 libras de

presin por 20 min.
R2 R3
R1 y R2 = Drenaje
R3 = Bolsa destinada para el material biolgico
BIBLIOGRAFA UTILIZADA
Brock, T.D., & Madigan, M.T. (1993). Microbiologa. Sexta edicin. Prentice Hall
Hispanoamericana S.A.
Kilara, A., Desai, M., Branen, A.L., Davidson, P.M., Salminen, S.,& Thorngate, J.H. (2002).
Enzymes In: Food Additives. Third Ed. Marcel Dekker Inc., New York, USA. 661706.
Kuriki, T., Hondoh, H., & Matsuura, Y. (2005). The conclusive proof that supports the concept of
the -amylase family: structural similarity and common catalytic mechanism. Biologa,
Bratislava, 60(16), 13-16.
Montor Antonio Juan Jos (2013).Caracterizacin de amilasas producidas por bacterias de

suelos cultivados con caa de azcar. Tesis de Licenciatura Universidad a Papaloapan.
Nonaka, T., Fujihashi, M., Kita, A., Hagihara, H., Ozaki, K., Ito, S., & Miki, K. (2003). Crystal
structure of calcium-free -amylase from Bacillus sp. strain KSM-K38 (AmyK38) and its sodium
ion binding sites. Journal of Biological Chemistry, 278(27), 24818-24824.

19
Seeley, H.W., Jr., & VanDemark, P.J., Lee, J.J. (1991). Microbes in action: A Laboratory Manual
of Microbiology. W. H. Freeman and Company New York. Fourth Edition.
Sundarram, A., & Murthy, T.P.K. (2014). -Amylase Production and Applications: A
Review. Journal of Applied & Environmental Microbiology, 2(4), 166-175.
Vihinen, M., & Mantsiila, P. (1989). Microbial amylolytic enzyme. Critical reviews in
biochemistry and molecular biology, 24(4), 329-418.
PARA SABER MS
https://www.youtube.com/watch?v=cZyq4koUCNM
http://www.scielo.org.co/pdf/vitae/v12n2/v12n2a03
http://www.redalyc.org/pdf/1930/193017723014.pdf

20
PRCTICA 2
AISLAMIENTO DE BACTERIAS TERMOTOLERANTES
35 C
40 C
45 C
Imagen derecha: Microscopia electrnica de Escherichia coli

Tomada de: (http://academic.pgcc.edu/~kroberts/Lecture/Chapter%206/physical.html).
Imagen izquierda: Termotolerancia de Escherichia coli
Tomada de http://www.abc.es/
El profesional en formacin ser capaz de aislar bacterias termotolerantes, a partir de
muestras de diversos suelos y biopelculas de rocas calcreas.

21
Sers competente para determinar qu tipo de sustratos son los idneos para la recuperacin
de bacterias termotolerantes, cuando:
Lleves las muestras a solicitadas de acuerdo a las especificaciones de la prctica.

Realices el diseo de la metodologa para la recuperacin de bacterias termotolerantes.
Determines el nmero total de bacterias termotolerantes aisladas en trmino de UFC/ml.
Seas capaz de determinar el grado de termotolerancia de las bacterias aisladas.
Tomes las evidencias fotogrficas del grado de tolerancia.
Reconozcas que tipo de sustratos son potenciales en la recuperacin de bacterias
termotolerantes, considerando la cantidad y el grado de termotolerancia obtenido de
cada sustrato.
Integres la informacin obtenida en forma de grficas, para un mejor anlisis de los
resultados.
obtenidos.

Cajas con microorganismos termotolerantes
Reporte final de la prctica con evidencias fotogrficas que avalen el grado de tolerancia
de las bacterias termotolerantes, as como el cuestionario resuelto sustentado con al
menos 3 referencias bibliogrficas.



22
INTRODUCCIN
El trmino termfilo proviene de dos palabras

griegas: termo (calor) y fila (amor), de acuerdo a
estas races los microorganismos termfilos no
solo toleran altas temperaturas sino que
requieren altas temperaturas para sobrevivir
(Robb et al. 2008; Madigan et al., 2012; Mehta y
Satyanarayana, 2013), pero este concepto aun no
es muy claro en cuanto a la delimitacin entre
mesfilo, termotolerante y termfilo. Los Figura 2.1 Clasificacin de los microrganismos de acuerdo a
su respuestas de crecimiento a diferentes temperatura.
microorganismos termfilos por lo general crecen (Tomado de Madigan et al., 2012)
sobre 50C hasta 121C y se clasifican en dos
grupos: termfilos moderados o facultativos y termfilos obligatorios; ste ltimo grupo se
separa a su vez en termfilos extremos e hipertermfilos. Los termfilos facultativos no
requieren de muy altas temperatura para vivir y sus temperaturas ptimas de crecimiento se
encuentran entre 40- 60C, en el segundo grupo los termfilos extremos tienen temperaturas
de crecimiento de 60-85C y los hipertermfilos muestran temperaturas ptimas de
crecimiento mayores a 85C (Fig. 2.1), (Mehta y Satyanarayana, 20 13).
Los microorganismos termotolerantes y termfilos

se encuentran ampliamente distribuidos en
diversos hbitats, pero los lugares volcnicos,
geotrmicos (fumaloras, fuentes termales,
giseres), y profundos respiraderos hidrotermales
de los ocanos son los lugares donde se han
encontrado una variedad de cepas termfilas
pertenecientes a los gneros Brevibacillus,
Thermophilus aquiaticus (Fig. 2.2) Paenibacillus,
Cohnella, Anoxybacillus Moorella, Geobacillus, etc.,
con temperaturas ptimas de crecimiento desde 40
Figura 2.2 Microscopia electrnica de la Bacteria
Thermophilus aquaticus depositada en membrana
a 94C, aerbicos y/o anaerbicos, amplia diversidad
millipore. Imagen de Dianne Montpetit metablica y produccin de enzimas termoestable
(Tomado de Madigan et al., 2012)
(Mehta y Satyanarayana, 2013). Adems de enzimas
hidroltica en fuentes termales, entre ellas se reportan varias representantes del gnero
Bacillus.

23
METODOLOGA
RECURSOS MATERIALES
Muestra
Muestras de diferentes suelos y raspado de biopelcula de roca calcrea
Material
Agar nutritivo
Agar soya tripticasena
Agua destilada
Caldo nutritivo
Algodn
Gasas
Aluminio
Tubo de ensaye de 125 x 16mm
Esptulas
Probeta de 250 mL.
Cajas Petri
Asas de platino
Solucin salina 0.85% (NaCl)
Balanza
Autoclave
Bao Mara
Sonicador

24
TCNICA
PRIMERA SESIN
1. Prepara 500 ml de los siguientes medios de cultivo: Agar nutritivo (AN), Agar soya
tripticasena (AST), siguiendo las indicaciones del proveedor de acuerdo a la marca del medio
de cultivo (cantidad de agar y modo de preparacin), y calentar hasta que el agar cristalice,
coloca un tapn de algodn con gasa al matraz con medio y cubre con aluminio.
2. Prepara 250 ml caldo nutritivo (CN) de acuerdo a las indicaciones del proveedor, dispensa 7
ml del caldo nutritivo en 30 tubos de ensaye de 125x16mm.
3. Esterilizar los medios y los tubos en autoclave por 20 minutos a 120 C y 15 libra de presin.
4. Dejar enfriar hasta aproximadamente 50 C y verter el agar en cajas de Petri estriles de

manera cuidadosa evitando la formacin de burbujas. Dejar enfriar.
5. Una vez que las placas se han gelificado perfectamente, marca la caja de acuerdo al medio
agregado. Invierte las cajas y djalas por 24 horas a 37 C, junto con los tubos con CN, para que
pasen prueba de esterilidad.
SEGUNDA SESIN
1. Tomar 1 g de la muestras (Suelo o raspado de roca calcrea), y aadir a un tubo con 9 ml de

solucin salina al 0.85%, agitar vigorosamente por un minuto hasta obtener un solucin
homognea.
2. Toma 1ml de la primera dilucin y continuar

haciendo diluciones; tomando 1 ml de la dilucin
anterior y vertindola en el siguiente tubo con 9 ml de
solucin salina (dilucin =10-2), y as consecutivamente
hasta una dilucin 10-6.
3. Los tubos con las diluciones obtenidas sern calentados en bao Mara por 20 minutos una 50
C.

25
4. Transcurrido el tiempo, inocula 100 L de cada solucin en los

medios AN y AST, y con la asa de platino extiende las muestras,
usando la tcnica de extincin o mtodo del pentgono.
5. Incuba las placas en una estufa a 40 C, revisar diariamente, y

documentar el crecimiento microbiano.
6. Realiza la descripcin morfolgica de las colonias bacterianas acuerdo a sus caractersticas

macroscpicas, usando la gua del anexo 1, y documntala en forma de tabla (Anexo 3).
7. Determina la concentracin total por grupo microbiano aislado en Unidades Formadoras de

Colonia (UF/ml) usando la frmula 1 del anexo 2.
8. Toma las evidencias fotogrficas del crecimiento bacteriano en cada dilucin.
9. Para determinar el grado de tolerancia a la temperatura, los aislamientos sern incubadas a

diferentes temperaturas (40, 45 y 50 C) en CN. Por lo que seleccionaras 10 aislamientos y les
asignaras un nmero correlativo, la inicial del sustrato del cual fueron aislados, seguido de la
temperatura. Para cada aislamiento tendrs que inocular 3 los tubos con CN, los coloca los
tubos en una gradilla en estufas de incubacin de acuerdo a su temperatura correspondiente.
TERCERA SESIN
1. Observa la presencia o ausencia de crecimiento microbiano en los tubos incubados las

diferentes temperaturas, y documntalos en la tabla 2.1.
2. Toma las evidencias fotogrficas de grado de termotolerancia de los diferentes aislamientos.

26
Tabla 2.1 Grado de termotolerancia de bacterias aisladas
No de aislamiento Crecimiento (Si/No)

40 C 45 C 50 C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
CUESTIONARIO
1. Por qu se calientas las muestras para el aislamiento?
2. Cmo desmostaras experimentalmente si un microorganismo es extremfilos o

extremotolerante?
3. Cmo desmostaras experimentalmente si un microorganismo es poliextrermfilo?
4. Por qu realizaste los ensayos de tolerancia a las diferentes temperaturas, en medio lquido
y no en medio de cultivo?
5. Que aplicaciones biotecnolgicas pueden tener los microorganismos termotolerantes?

27

Lista de cotejo 10%
100%
LISTA DE COTEJO
ESTUDIANTE
4. Identificaste el grado de termotolerancia de los aislamientos?
5. Identificaste que tipo de sustrato son mejores para la obtencin de aislamientos con mayor
capacidad termotolerante?
3. Mostraste las imgenes ms representativas del grado de termotolerancia?
bibliogrficas?

28
Tubos con muestras Esterilizar en autoclave y dejar enfriar Drenaje

(R1)
Tubos con cultivos Esterilizar en autoclave y dejar enfriar Drenaje
Microbianos (R3)

Placa con crecimiento microbiano

R1
Tubos con crecimiento microbiano Esterilizar a 120C a 15 libras de

presin por 20 min.
R2
R3
R1 y R2 = Drenaje
R3 Bolsa destinada para el material biolgico
Brock, T.D., & Madigan, M.T. (2012). Microbiologa. Sexta edicin. Prentice Hall
Hispanoamericana S.A.

29
Mehta D.; Satyanarayana T. (2013) Diversity of Hot Environments and Thermophilic Microbes.
In: Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of
Thermophiles ed. Satyanarayana, T., Littlechild, J. and Kawarabayasi, Y. pp. 3-60. Dordrecht:
Springer.
Robb F.T; Antranikian G.; Grogan D.W.; Driessen A.J.M. (2008). Introducction. En
Thermophiles: biology and technology at high temperatures ed. Robb F. T; Antranikian G.;
Grogan D. W.; Driessen A. J. M. pp. 3-6 CRC Press.
Tamariz ngeles Carmen del Rosario (2014). Diversidad de bacterias termotolerantes

celulolticas y xilanolticas aisladas de fuentes termales del Callejn de Huaylas. Tesis de
Licenciatura Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Per
PARA SABER MS
https://www.youtube.com/watch?v=wWpLnPcBhw0
https://www.youtube.com/watch?v=f7L2GkepVQw

30
PRCTICA 3
AISLAMIENTO DE HONGOS DEGRADADORES DE CELULOSA
Degradacin de carboximetilcelulosa por diversos hongos epilticos, revelados con rojo Congo.
Cortesa: Edward Cazn-DEMAB
El profesional en formacin ser capaz de aislar hongos con actividad celuloltica, a partir de
muestras de diverso sustratos.

31

Sers competente para la recuperacin de hongos celulolticos de diferentes sustratos, cuando:

Realices el diseo de la metodologa para la recuperacin selectiva de hongos con
actividad celuloltica.
Determines el nmero total de los hongos celulolticos en trmino de UFC/ml.
Seas capaz de determinar el ndice de actividad celuloltica de los hongos aislados.
Tomes las evidencias fotogrficas de la actividad y el ndice celuloltico de los hongos
aislados.
Reconozcas que tipo de sustratos son potenciales en la recuperacin de hongos
celuloltico, considerando la cantidad y el grado de termotolerancia obtenido de cada
sustrato.
resultados.
obtenidos.
Visualices el potencial que pueden tener los hongos celuloltico en la aplicacin industrial.

Cajas con hongos celulolticos.
Reporte final de la prctica con evidencias fotogrficas que avalen el grado de tolerancia
de las bacterias termotolerantes, as como el cuestionario resuelto sustentado con al
menos 3 referencias bibliogrficas.


32
INTRODUCCIN
La celulosa es el compuesto orgnico ms abundante

en el planeta (Fig. 3.1), un gran nmero de
microorganismos son capaces de degradar la
celulosa, pero slo algunos producen cantidades
significativas de celulasas para hidrolizarla
completamente. El mecanismo ampliamente
aceptado para explicar la hidrlisis enzimtica de la
celulosa involucra la accin de tres enzimas la endo -
1,4 glucanasa (-1,4 glucano gluconohidrolasa), la
endo -1,4 celobiohidrolsa y la -1,4 glucosidasa Figura 3.1 Estructura de la celulosa
(Lymar, et el 1995, Zhang et al., 2006).
Particularmente, las endoglucanasas actan al azar sobre los enlaces -1,4 glucosdicos y se
puede medir fcilmente su actividad, usando medios con celulosa soluble con alta grado de
polimerizacin como es la carboximetilcelulosa (CMC). La reaccin se hace evidente gracias a la
adiccin de colorantes como el Rojo Congo, debido a que estos son absorbido solo por la
cadenas largas de polisacridos (Moreno el al., 2011).
Los microorganismos degradadores de celulosa incluyen bacterias, pero sobre todo hongos que
habitan una gran variedad de hbitat, pero son los intestino de temitas una de las fuente de
eleccin para la bsqueda de estos degradadores de celulosa. Entre los hongos celulolticos
(Fig. 3.2) destacan Trichoderma reesei, Trichoderma koningii Phanerochaete chrysosporium,
Fusarium solani, Penicillium funiculosum (Lynd at al., 2002). Los hongos son por excelencia
agentes de descomposicin de sustratos celulsicos, este atributo es altamente apreciado en la
industria, de los alimentos, bebidas, textiles,
ropa, papel, tratamiento de aguas
residuales, formulacin para una gran
variedad de detergentes, bioconversin de
la biomasa fngica lignocelulosica en
biocombustibles entre otros. Los hongos
epilticos se encuentran adheridos a
diversos sustratos rocosos y son capaces de
soportar condiciones ambientales
extremas, por lo son tambin una buena
Figura 3.2 Hongos degradadores de celulosa (Tomado de Vera et al., opcin en la bsqueda de hongos con
2012)
potencial celuloltico (Cazn et al., 2014).

33
METODOLOGA
RECURSOS MATERIALES
Muestra
Suelo caeros, estircol de rumiantes, termitas, .raspado de biopelculas de rocas

calcreas.
Material
Agua destilada
Solucin salina (0.85% de NaCl)
Carboximetil celulosa
Agar bacteriolgico
(NH4)2 SO4
NaNO3
K2HPO4
MgSO4.7H2O
KCl
CaCl2
FeSO4.7H2O
CuSO4
MnSO4.4H2O
Rojo Congo
ZnSO4.7H2O
Solucin salina
Almidn
Algodn
Gasas
Papel Aluminio
Tubos de ensaye de 125 x 16 mm
Marcador indeleble
Esptula
Charola de pesado
Asa de platino

34
Balanza
Autoclave
Sonicador
TCNICA
PRIMERA SESIN
1. Preparar 500 ml de medio Carboximetilcelulosa (ACMC) (Formulacin 1 del Anexo 4), agrega
la carboximetil-celulosa (CMC) primero disuelve poco a poco y muy lentamente, agrega el resto
de reactivos, y al final el antibitico (cloranfenicol) disuelve y calienta hasta que el agar
cristalice.
2. Coloca un tapn de algodn con gasa al matraz con medio y cbrelo con papel aluminio, y
esteriliza los matraces por 20 minutos a 120 C y 15 libra de presin.
3. Deja enfriar el matraz hasta una temperatura de aproximadamente 50 C y vierte el agar en

las cajas de Petri estriles de manera cuidadosa. Deja enfriar sin mover las cajas para permitir
que el agar se gelifique perfectamente, invierte las cajas y djalas por 24 horas a 37 C, para que
las placas pasen prueba de esterilidad.
SEGUNDA SESIN
1. Toma las diferentes muestras, y prepara por separado

con cada una dilucin 1:10 con solucin salina (pesa 1
gramos de la muestra y depostalo en un tubo con 9 ml de
solucin salina al 0.85%) y agita vigorosamente por un
minuto, hasta obtener un solucin homognea.
2. Toma 1 ml. de la primera dilucin y continua haciendo diluciones; toma 1 ml de la dilucin

anterior y vierte en el siguiente tubo de ensayo que ya contiene 9 ml de solucin salina (dilucin
=10-2), y as consecutivamente hasta una dilucin 10-6.

35
3. Inocula 100 L de cada dilucin en las placas de Petri con ACMC con
antibitico, este bajara al mnimo las bacterias presentes en las
muestras. Con una asa extiende el inoculo por el mtodo del pentgono.
4. Incuba las cajas a una temperatura de 25-28 C y checa el crecimiento

fngico cada 24 horas.
TERCERA SESIN

macroscpicas como color, tamao y pigmentacin ver gua (Anexo1) y documntala en forma
de tabla (Anexo 3).
2. Determina la concentracin total de hongos aislados en Unidades Formadoras de Colonia

(UF/ml) usando la frmula 1 del Anexo 2
3. Con una pipeta colocar con cuidado 3 ml de solucin de Rojo Congo sobre cada caja Petri y
agita suavemente la caja hasta cubrir completamente la superficie de agar, deja por 15 minuto,
retira el exceso y adiciona 5 ml solucin salina (0.85%), y deja reposar por 15 min, retira toda la
solucin, observa documenta y fotografa la actividad. Las zonas en las que an quede la
presencia de CMC se teirn de un color rojo. Si las bacterias han degradado la CMC,
aparecern zonas de color claro alrededor de las colonias (portada prctica).
4. Determinar el ndice de activad para degradar la CMC usando la siguiente frmula 2 del
anexo 2, y documntala en la siguiente tabla.
Tabla ejemplo 1.2. ndice de actividad amiloltica por sustrato procesado
Tipo de sustrato ndice de actividad celuloltica

36
CUESTIONARIO
1. Qu otros sustratos puedes usarse para demostrar la presencia de hongos con actividad
celuloltica?
2. Qu ensayo extra utilizaras para demostrar que cada uno los hongos aislados presentan
actividad celuloltica?
3. De qu manare se pueda cuantificar la actividad celuloltica de un hongo?
4. Documenta un proceso biotecnolgico donde se puedan aplicar la capacidad celuloltica

de un hongo?

Lista de cotejo 10%
100%
LISTA DE COTEJO
ESTUDIANTE

37

4. Determinaste el ndice de actividad celuloltica de los aislamientos?
5. Identificaste que tipo de sustrato son mejores para la obtencin de aislamientos con actividad
celuloltica?
bibliogrficas?
Tubos con diluciones Esterilizar en autoclave y dejar enfriar Drenaje

(R1)
Solucin de rojo Depositar en un contenedor de cristal con tapa, Drenaje

Congo con cultivo esterilizar
microbiano (R3)

R1 Placa con crecimiento microbiano
Revelar con Rojo Esterilizar a 120C a 15 libras de

Congo presin por 20 min.
R1 y R2 = Drenaje R2
R3 = Bolsa destinada para el material biolgico R3

38
Edward M. Cazn-Noz, Sergio A. Gmez-Cornelio, Susana C. De la Rosa-Garca, Benjamn Otto

Ortega-Morales Actividad Celuloltica (2014). De Hongos Aislados de Roca Calcrea. VIII
Congreso Latinoamericano de Micologa.
Lymar, E. S., Li, B., & Renganathan, V. (1995). Purification and Characterization of a Cellulose-
Binding (beta)-Glucosidase from Cellulose-Degrading Cultures of Phanerochaete
chrysosporium. Applied and environmental microbiology, 61(8), 2976-2980.
Lynd, L. R., Weimer, P. J., Van Zyl, W. H., & Pretorius, I. S. (2002). Microbial cellulose
utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiology and molecular biology reviews,
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Moreno, M. L. O., & Uribe-Vlez, D. (2011). Nuevo mtodo para la cuantificacin de la actividad
endoglucanasa basado en el complejo celulosa-rojo Congo. Orinoquia, 15(1), 7-15.
Vera, X. C., Escobar, J. P., Montoya, M. M., & Prez, M. D. S. Y. (2012). Hongos Nativos con
Potencial Degradador de Tintes Industriales en el Valle de Aburr, Colombia. Rev. Fac. Nal. Agr.
Medelln, 65(2), 6811-6821.
PARA SABER MS
https://www.youtube.com/watch?v=wWpLnPcBhw0

39
PRCTICA 4
AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEGRADADORES DE
PETRLEO
Imagen derecha: Microscopa electrnica de Pseudomonas usadas en la degradacin de hidrocarburos.

Tomada por Nancy Lpez, y copyright 2007 Environmental Microbiology Laboratory, Inc.
Imagen izquierda Derrame petrolero en el golfo de Mxico
Tomada de: http://elblogverde.com/
El profesional en formacin ser capaz de aislar bacterianas degradadoras de petrleo de
muestras contaminadas con petrleo usando medios que contienen hidrocarburos como nica
fuente de carbono.

40
Sers competente para la recuperacin de bacterias degradadoras de hidrocarburos, cuando:

Realices el diseo de la metodologa para la recuperacin selectiva de bacterias
degradadoras de hidrocarburos
Determines el nmero total de bacterias degradadoras de hidrocarburos trmino de
UFC/ml.
Analices y determines que cepas son las mejores para degradar los diferentes
hidrocarburos.
Tomes las evidencias fotogrficas de la capacidad degradadora de hidrocarburos.
resultados.
obtenidos.
Visualices las diversas aplicaciones de las bacterias degradadoras de hidrocarburos en la
industrial.

Cajas con bacterias degradadoras de petrleo.
Reporte final de la prctica con evidencias fotogrficas que avalen el aislamiento de
bacterias que crecer en medios que tienen como nica fuente de carbono hidrocarburos,
as como el cuestionario resuelto sustentado con al menos 3 referencias bibliogrficas.


41
INTRODUCCIN
La industria petroqumica es importante en la

sociedad moderna, no obstante la falta de
programas de proteccin al ambiente, hace
que el medio ambiente se contamine al
producirse derrames de petrleo (Fig. 4.1),
principalmente por el deterioro de los
oleoductos, descargas de efluentes
contaminados, a la produccin, transporte y
almacenamiento de este recurso natural
(Shanidul y Tanaka, 2004). Los hidrocarburos de
petrleo pueden ser divididos en cuatro clases:
los saturados, los aromticos, los asfaltenos Figura 4.1 derrame petrolero en Coatzacoalcos
Foto: Cortesa Greenpeace/Prometeo Lucero).
(fenoles, cidos grasos, cetonas, esteres y
porfirinas) y las resinas (piridinas, quinolonas, carbazoles, sulfxidos y amidas).
En general al capacidad de degradacin por los microorganismos es mayor para los

hidrocarburos saturados, le siguen los aromticos ligeros, y finalmente los ms difciles de
degradar que son los aromticos de alto peso molecular y los compuestos polares. Los
hidrocarburos se han clasificado en un orden de susceptibilidad al ataque microbiano en forma
decreciente as: n-alcanos, alcanos ramificados, aromticos de bajo peso molecular y alcanos
cclicos (Leahy y Colwell, 1990). Los gnero ms
utilizado son las Pseudomonas (Van Hamme et al.,
2003). Esta puede degradar grupos aromticos
mediante la conversin del ncleo aromtico en
catecol mediante la accin de dioxigenasas., y
luego la conversin acetaldehdo y piruvato va
rompimiento orto o meta del catecol,y
Figura 4.2 Hidrocarburos aromticos policclicos
finalmente formando acetil-CoA, los cuales son
incorporados en el ciclo del cido ctrico. En el metabolismo de hidrocarburos han identificado
que los genes implicados en la degradacin estn codificados en su mayora en plsmidos.
Bacterias, cianobacterias, algas y hongos, son capaces de degradar hidrocarburos policclicos
de bajo (dos o tres anillos), (Fig.4.2) o alto peso molecular (cuatro o ms anillos) como
naftaleno, acenafteno, antraceno, fluoranteno, pireno y criseno y usarlos como nica fuente de
carbono (Leahy y Collwel, 1990; Van Hamme et al., 2003).

42
METODOLOGA
RECURSOS MATERIALES
Muestra
100 gramos de suelo contaminado con petrleo.
Material
Agua destilada
Agar bacteriolgico
(Tubos de ensaye de 125 x 16 mm
NH4)2 SO4
NaNO3
K2HPO4
MgSO4.7H2O
KCl
CaCl2
FeSO4.7H2O
CuSO4
Cajas de Petri de cristal
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
Hexano
Heptano
N-octano
Bolsa de polietileno
Algodn
Gasas
Papel Aluminio
Marcador indeleble
Esptula
Charola de pesado
Asa de platino

43
Balanza
Autoclave
Sonicador
TCNICA
PRIMERA SESIN
1. Prepara 750 ml de Medio Bsico (Formulacin 2 en el Anexo 4).
2. Toma 600 ml y agregar 9 g de agar bacteriolgico, calentar hasta que el medio cristalice,
separa volumen en tres matraces colocando de 200 ml en cada uno.
3. Agrega a un matraz 4 ml de hexano, a otro 4 ml de hexano y otro con 4 ml de heptano.
4. Toma los 150 ml de medio bsico que quedo y reprtelo en 6 matraces en volmenes de 25
ml y agregar a dos matraces 0.5 ml de hexano, a otros dos 0.5 ml heptano y otros dos con 0.5
ml n-octano (medio lquido de pre-enriquecimiento).
5. Prepara 25 ml de solucin salina al 0.85% (pesa 0.2125 g de NaCl y disulvela en 25 ml de

agua destilada)
6. Coloca un tapn de algodn con gasa cada matraz con medio y cbrelo con papel aluminio, y
esterilzalos por 20 minutos a 120 C y 15 libra de presin.
7. Deja enfriar el matraz hasta una temperatura de aproximadamente 50 C y vierte el agar en

las cajas de Petri estriles de manera cuidadosa. Deja enfriar sin mover las cajas para permitir
que el agar se gelifique perfectamente, invierte las cajas y djalas por 24 horas a 37 C, para que
las placas pasen prueba de esterilidad.
8. Toma 5 gramos de muestra de suelo y depostalo en el matraz de 250 ml con 50 ml de

solucin) mezcla perfectamente.

44
9. Deposita 2 ml de la suspensin a cada uno de los medios lquidos de pre-enriquecimiento

(Medio bsico suplementado con los hidrocarburos de hexano, heptano y n-octano) y deja
incubar a 30C con agitacin constante a 150 rpm hasta la prxima seccin.
SEGUNDA SESIN
1. Toma 100 l de cada pre-cultivo y depositar sobre las cajas de medio

bsico suplementado con los diferentes hidrocarburos: hexano,
heptano y n-octadecano). Extiende las muestras por el mtodo del
extincin o pentgono con ayuda de un asa de platino.
2. Incuba las cajas a una temperatura de 25-28 C y checa el crecimiento fngico cada 24 horas.
TERCERA SESIN

macroscpicas como color, tamao y pigmentacin siguiendo la gua del Anexo 1 y
documntala en forma de tabla (Anexo3).
2. Determina la concentracin de Unidades Formadoras de Colonia (UF/ml), recuperado por

hidrocarburo, usa la frmula 1 del anexo 2.
3. documenta los aislamientos recuperados por hidrocarburo, en la siguiente tabla.
Tabla ejemplo 4.1 Aislamiento por fuente de hidrocarburo.
Morfologa colonial Fuente de carbono (Crecimiento)

Descripcin Hexano heptano n-octadecano
Numero de aislamientos

45
CUESTIONARIO
1. Qu tipo de gneros bacterianos pueden crecer en medio con hidrocarburos como nica
fuente de carbono?
2. Qu tcnica otra tcnica se puede utilizar para el aislamiento de bacterias degradadoras de

petrleo?
3. Qu estrategia metodolgica seguiras para la recuperacin de bacterias degradadoras de

hidrocarburos de una ambiente marino?

Lista de cotejo 10%
100%
LISTA DE COTEJO
ESTUDIANTE
4. Describiste la morfologa colonial de los aislamientos de acuerdo al hidrocarburo usado?
5. Identificaste que tipo de hidrocarburo es mejor para la obtencin de aislamientos con
actividad?

46

bibliogrficas?
Pre-cultivo con Esterilizar en autoclave y dejar enfriar Contendedor para desechos de

hidrocarburos (R1) hidrocarburos
con hidrocarburos microbianos en bolsas de plstico, y esterilizar de material biolgico
(R2) acuerdo a las instrucciones de uso en la autoclave
Matraces concultivo
microbiano y hidrocarburos
Placa con crecimiento microbiano con

R1 hidrocarburos
Esterilizar a 120C a 15 libras de

presin por 20 min.
R2
R1 = Contenedor para reactivos inflamables

R3 = Bolsa destinada para el material biolgico

47
Leahy, J., y Colwell, R., 1990. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment.
Microbiol Rev, 54:305-315.
Habib Fernando Yanine (2010) Evaluacin de la diversidad de bacterias degradadoras de

hidrocarburos aisladas de suelos de las cuencas de los ros Otn y la Vieja. Tesis de Maestra
Universidad Nacional De Colombia, Bogot.
Van Hamme, J.; Singh, A. y Ward, O. Recent advances in petroleum microbiology. Microbiol.
Mol Biol Rev, 2003; 67:503549.
PARA SABER MS
dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/2986556.pdf

48
PRCTICA 5
ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE BACTERIAS
DEGRADADORES DE PETRLEO
Imagen: Diversidad de la actividad emulsificante del hexadecano por bacterias marinas.

Cortesa: Tomas Lpez Gutirrez
El profesional en formacin ser capaz de determinar la capacidad emulsificante de diferentes
tipos de aceites, incluso de motor de bacterianas degradadoras con potencial para degradar
hidrocarburos.

49
Sers competente para la determinar la capacidad emulsificantes de bacterias degradadoras de

hidrocarburos, cuando:

Determines correctamente el ndice de emulsificacin de cada bacteria.
Analices y determines que aislamientos son los mejores para emulsificar a ms de un
aceite o hidrocarburo con respeto a un control de emulsificacin.
Tomes las evidencias fotogrficas de la capacidad degradadora de hidrocarburos.
resultados.
obtenidos.
Visualices las diversas aplicaciones de las bacterias degradadoras de hidrocarburos en la
industrial.

ndice de emulsificacin frente a diferentes aceites y hidrocarburos de las bacterias
degradadoras de hidrocarburos.
Reporte final de la prctica con evidencias fotogrficas que avalen las mejores cepas con
actividad emulsificante frente a diferentes aceites e hidrocarburos, as como el
cuestionario resuelto sustentado con al menos 3 referencias bibliogrficas.


50
INTRODUCCIN
Los biosurfactantes (BS) son compuestos con una porcin hidroflicas y otra hidrofbicas que
son producidos principalmente por hongos y bacterias. Estas molculas tienen propiedades
emulsificantes y dispersantes, por lo que, disminuyen la tensin superficial del agua. Los
microorganismos tienden a sintetizan BS cuando su fuente de carbono es parcialmente soluble
o insoluble en agua, ya que as se ven obligados a sintetizar estas molculas con propiedades
tensoactivas que favorecen la biodegradacin de los muchos sustratos que insolubles (Supaphol
et al., 2011). Por sta razn, los sitio contaminados con residuos de baja solubilidad, son lugares
excelentes para el aislamiento de microorganismos
con capacidad BS, transcienden en los procesos de
biorremediacin de sitios contaminados con metales
pesados, plaguicidas organofosforados, hidrocarburos
totales del petrleo y aceites sintticos, ya los BS
juegan papeles importantes al incrementan la
biodisponibilidad y biodegradabilidad (Fig. 5.1), (Banat
et al., 2000; Yaez-Ocampo et al., 2011). Adicionalmente
los BS son apreciados en la industria gracias a su
Figura 5.1 Emulsificacin del keroseno por
amplia variedad de aplicaciones en procesos Pseudomonas aeruginosa. Tomado de: da Silva (2011).
alimenticios, industriales, cosmticos entre otros (Singh
et al., 2007).
Los BS microbianos mejor estudiados

son los glucolpidos (ramnolpidos,
trehalolpidos y soforolpidos);
A
particularmente bacterias del gnero
B
Pseudomonas sp. (Yaez-Ocampo y Wong
et al., 2013). La efectividad de un BS se
C puede establecerse en base a distintos
parmetros, pero el ms importantes
Figura 5.2 Estructura de A) Ramnolipidos, B)Trehalolpidos, C)Soforolpidos
Tomado de http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/rhamno/index.html es la Concentracin Micelar Critica
(CMC), y la disminucin de la tensin
superficial (TS) e interfacial (TI). La CMC es la concentracin mnima de un agente
biosurfactante capaz de formar micelas (Fig. 5.2). Estas micelas se producen cuando la parte
hidrofbica del BS al ser incapaz de formar puentes de hidrgeno con las molculas de agua,
produce un aumento de la energa libre del sistema. Una manera de aliviar este aumento, es
aislar la regin hidrofbica interaccionando con otras superficies, asocindose a otros
compuestos hidrofbicos o formando vesculas (micelas) en las que la regin lipoflica se sita

51
en el centro y la hidroflica hacia fuera, formando los puentes de hidrgeno con las molculas
de agua. Cuanto menor sea la CMC, ms eficiente es el surfactante en cuestin. La formacin
de micelas mixtas entre surfactantes y otros compuestos hidrofbicos como los hidrocarburos
favorecen la dispersin del mismo en medio acuoso aumentando la biodisponibilidad y por
consiguiente la posibilidad de degradacin (Raiger-Lustman y Lpez, 2009).
METODOLOGA
RECURSOS MATERIALES
Muestra
Bacterias degradadoras de petrleo de la prctica no 4.
Material
Agua destilada
Agar bacteriolgico
(Tubos de ensaye de 125 x 16 mm
NH4)2 SO4
NaNO3
K2HPO4
MgSO4.7H2O
KCl
CaCl2
FeSO4.7H2O
CuSO4
Cajas de Petri de cristal
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
Hexano
Heptano
N-octano
Petrleo crudo
Aceite de motor quemado
Aceite de girasol
Dodecil sulfato de sodio (SDS)
Tritn 100
Bolsa de polietileno

52
Algodn
Gasas
Papel Aluminio
Marcador indeleble
Esptula
Charola de pesado
Asa de platino
Balanza
Autoclave
Centrifuga refrigerada
Sonicador
TCNICA
PRIMERA SESIN
1. Prepara 500 ml de Medio Bsico (Formulacin 2 en el Anexo 4), y adicionar 25 ml. de hexano.
2. Prepara 10 matraces de 150 ml con 50 ml de medio bsico-hexano y colcale todos los

matraces, tapones de algodn con gasa y cbrelos con aluminio. Esteriliza en autoclave por 20
minutos a 120 C a 15 libra de presin.
3. Inocula los matraces con una asada de las 5 aislamientos con 5 de las mejor cepas capacidad
degradadoras de petrleo, en base a los resultados de la prctica 4.
4. Incuba los matraces a 28 C en agitacin y luz contante a 120 rpm por 72 a 96 hrs.

53
SEGUNDA SESIN
1. Selecciona los matraces que presente buen crecimiento microbiano, el contenido de los
matraces, depostalos en tubos cnicos de 50 ml. y centrifugar a 10, 000 rpm por 20 minutos, en
una centrifuga refrigerada.
2. Por cada bacteria, toma el sobrenadante cuidadosamente (24 ml) sin mover el paquete
celular y distribuya 4 ml en 6 tubos de ensaye rotular con una clave que simbolice el nmero de
la bacteria utilizada y el sustrato a probar (HE=hexano, HP =Heptadecano, OC=n-octadecano,
PC=petrleo crudo, AM=aceite de motor quemado, AG=aceite de girasol.
3. Depositar 4 ml para cada tubo, de los sustratos. HE, HP, OC, PC, AM, y AG. Repite este
mismo procedimiento para los otros 4 sobrenadantes obtenidos de las diferentes cepas.
4. Agitar vigorosamente cada tubo, hasta formar una emulsin homognea y deja reposar por
24 hrs. al abrigo al abrigo de la luz.
5. Preparar los controles positivos de emulsificacin colocando por duplicado tubos con 4 mL
de hexano, petrleo crudo, aceite de motor y aceite de girasol. A la mitad de los tubos agrgale
4 ml de solucin de SDS al 1%, y a la otra mitad Tritn 100 al 1%, agita vigorosamente cada
tubo hasta formar una emulsin.
6. Prepara lo controles negativos de emulsificacin colocando por duplicado tubos 4 mL de

hexano, petrleo crudo, aceite de motor y aceite de girasol. A la mitad de los tubos agrgale 4
ml de medio de cultivo sin inocular y agita vigorosamente cada tubo hasta formar una
emulsin.
7. depositar todo tubos en una gradilla y guardar una caja de cartn para dejarlos reposar por
24 hrs. al abrigo de la luz.
TERCERA SESIN
1. Medir con una regla la distancia de emulsificacin presente en cada muestra y los controles,
realizar los clculos correspondientes, para determinar el valor del ndice de emulsificacin
(Frmula 3 Anexo 2), para los hidrocarburos y aceites, y los controles positivos y negativos.
2. Documenta los resultados en la tabla siguiente.

54
Tabla 4.1 ndice de emulsificacin de bacterias degradadoras de petrleo
Sobrenadante ndice de emulsificacin (%) AM

Aislamiento no. HE HP OC PC AM AG
1
2
3
4
5
Control (+) SDS
Control (+) Tritn 100
Control (-)
medio sin inocular
HE=hexano, HP =Heptadecano, OC=n-octadecano, PC=petrleo crudo, AM=aceite de motor quemado, AG=aceite de girasol,
SDS= dodecilsulfato de sodio.
CUESTIONARIO
1. Por qu existen diferencias entre los ndice de emulsificacin de la misma aislamiento en los
diferentes fuentes de hidrocarburos?
2. Qu otras tcnicas se pueden usar para permite determinar la capacidad emulsificantes de

microorganismo?
3. Por qu? los tubos se tiene que dejar reposar por 24 hrs. Al abrigo de la luz.

55

Obtencin del ndice de emulsificacin 10%
Lista de cotejo 10%
100%
LISTA DE COTEJO
ESTUDIANTE
2. Elegiste de manara correcta los aislamientos para los ensayos de emulsificacin?
3. Obtuviste de manera correcta el sobrenadante de cultivo obtenido?
4. Obtuviste la emulsificacin adecuada para cada muestra procesada?
1. Realizaste de manera correcta las mediciones de emulsificacin para cada tubo?
2. Completaste de manera correcta las tablas de registro con los ndices de emulsificacin?

4. Realizaste de manera correcta los clculos para determinar el ndice de emulsificacin?
5. Identificaste que aislamiento tiene la mayor capacidad emulsificante en relacin a su

capacidad de emulsificar a ms de hidrocarburo y aceite?
3. Mostraste las imgenes ms representativas de la capacidad emulsificantes?
bibliogrficas?

56
Cultivo con hidrocarburos Esterilizar en autoclave y dejar enfriar Contendedor para desechos de
(R1) hidrocarburos
Tubos con hidrocarburos Esterilizar en autoclave y dejar enfriar Contendedor para desechos de
emulsificados (R2) hidrocarburos
Matraces con cultivo

microbiano e hidrocarburos
Tubos con hidrocarburos

R1 emulsificados
Esterilizar a 120C a 15 libras de

presin por 20 min.
R2
R1 y R2 = Contenedor para desechos de hidrocarburos
Banat, I.M., Makkar, R.S., Cameotra, S.S. (2000). Potential commercial applications of
microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology, 53(5): 495-508
.
da Silva, Lima., T.M. (2011). Oil recovery from fuel oil storage tank sludge using biosurfactants.
Journal of Bioremediation and Biodegradation.
Giraldo, J.D., Gutirrez, S., Merino, F. (2014). Actividad emulsificante y de remocin de metales
pesados del ramnolpido producido por Pseudomonas aeruginosa PB 25. Revista de la Sociedad
Qumica del Per, 80(1), 35-44.

57
Raiger-Lustman, L.J., Lpez, N.I. (2009) Los biosurfactantes y la industria petrolera. Qumica
Viva 8(3): 1-6.
Singh, A., Van Hamme, J.D., Ward, O.P. (2007). Surfactants in microbiology and biotechnology:
Part 2. Application Aspects Biotechnology Advances, 25(1): 99-121.
Supaphol, S., Jenkins, S.N., Intomo, P., Waite, I.S., ODonnell, A.G. (2011). Microbial
community dynamics in mesophilic anaerobic co-digestion of mixed waste. Bioresource
Technology, 102(5): 4021-4027.
Yez-Ocampo, G., Snchez-Salinas, E., Ortiz-Hernndez, M.L. (2011). Removal of methyl

parathion and tetrachlorvinphos by a bacterial consortium immobilized on tezontle-packed up-
flow reactor. Biodegradation, 22(6):1203-1213.
Yez-Ocampo, G., Wong-Villarreal, A. (2013). Biosurfactantes microbianos, produccin

potencial con residuos agroindustriales de Chiapas, 17(3):12-28.
PARA SABER MS
ww.europapress.es/euskadi/noticia-gaiker-ik4-ab-laboratorios-guserbiot-desarrollan
detergentes-origen-microbiano-respetuosos-medio-ambiente-20140709203400.html
Toribio-Jimnez, J., Aradillas, J. C. V., Ramrez, Y. R., Barrera, M. . R., Gonzlez, J. D. C., Luna,
J. G., Noyola, J. L. A. (2014). Pseudomonas sp productoras de biosurfactantes.
http://posgradoeinvestigacion.uagro.mx/tlamati/t52/t529.pdf
Gonzlez Garca, Y., Contreras, M., Carlos, J., Gonzlez Reynoso, O., Crdova Lpez, J. A.
(2013). Sntesis y biodegradacin de polihidroxialcanoatos: plsticos de origen microbiano.
Revista Internacional de Contaminacin Ambiental, 29(1): 77-115.
http://www.scielo.org.mx/pdf/rica/v29n1/v29n1a7.pdf

58
ANEXO 1 (Guas descripcin colonial)
Gua para la descripcin de la morfologa colonial macroscpica de las colonias
Tomada de: Benson H.J. 2002. Microbiological Applications Laboratory Manual in General Microbiology. McGraw
Hill, Boston

59
ANEXO 2 (Frmulas)
FRMULA 1
No. de colonias
/ = (volumen inoculado) 1000
Dilucin
FRMULA 2
Dimetro externo (halo)

() =
Dimetro colonia
FRMULA 3
Altura de la capa de emulsin

() = 100
Altura total

60
ANEXO 3 (Tablas ejemplo)
Tabla ejemplo 1.1. Para la descripcin morfolgica de todos los aislamientos
Tipo de Temperatura Actividad

Tamao Color Pigmentacin Elevacin Borde Forma
sustrato 50/70 C Si/No

61
ANEXO 4 (Composicin de Medios de cultivos)
Formulacin 1. Agar Carboximetilcelulosa con antibitico
Carboximetil-celulosa 10 g. KCl 0.5 g

Extracto de levadura 0.5 g CaCl2 50 mg
(NH4)2 SO4 1.0 g FeSO4.7H2O 10 mg
NaNO3 2.0 g CuSO4 10 mg
K2HPO4 1.0 g MnSO4.4H2O 5.0 mg
MgSO4.7H2O 0.5 g ZnSO4.7H2O 1.0 mg
Cloranfenicol 200 mg Agar 15 g
Agua 1,000 ml
Formulacin 2. Medio bsico

Extracto de levadura 0.5 g KCl 0.5 g
(NH4)2 SO4 1.0 g CaCl2. 50 mg
NaNO3 2.0 g FeSO4.7H2O 10 mg
K2HPO4 1.0 g CuSO4 10 mg
MgSO4.7H2O 0.5 g MnSO4.4H2O 5.0 mg
Agar 15 g ZnSO4.7H2O 1.0 mg
Agua 1,000 ml

62
ANEXO 5 (Portada reporte prctica)
UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS
Reporte de Prctica de Laboratorio
Prctica: Nmero y ttulo de la Prctica
Docente: Dra. Susana del Carmen De la Rosa Garca
Alumnos: ________________________________________________
_________________________________________________
_________________________________________________
_________________________________________________
_________________________________________________
____________________________________________
Fecha de entrega del Reporte: _______________

63
ANEXO 5 (Contenido del reporte de la prctica)
RESULTADOS Y DISCUSIN: Describir los resultados, agregar la tabla

realizadas de acuerdo al formato de tablas ejemplo, elaborar la grficas que
muestren de manera elocuente los resultados, agregar las evidencias fotogrficas
ms representativas, las discusin se realizar en base con al menos tres
referencia consultadas).
CONCLUSIONES: Colocar de manera sucinta, las conclusiones ms relevantes

obtenidas de cada resultado.
CUESTIONARIO: Copiar las preguntas del cuestionario y responder de manera

desarrollada, con al menos dos referencias bibliogrficas que avalen la respuesta
BIBLIOGRAFA: Agregar las referencias bibliogrficas (estilo APA) que se cit en

el cuestionario)

64

Manual de Prácticas - Biotecnologia Ambiental - Perfecto

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Ingeniero Bioqumico Ambiental

Modelo Basado en Competencias

De la Rosa-Garca SC 2014. Manual de prcticas de laboratorio de Biotecnologa Ambiental Facultad de

Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas

Ingeniero Bioqumico Ambiental

Manual de Prcticas de Laboratorio

Dra. Susana del Carmen De la Rosa Garca

Aprobado por Academia de IBA-LCTA.

Validado por Consejo Tcnico.

Lic. Gerardo Montero Prez

Lic. Manuel Sarmiento Morales

Mtra. Anglica Soto Martnez

Mtra. Mara Guadalupe Maldonado Velzquez.

M. en C. Primavera Garca Prez

M en C. Jos Eduardo Martn Pool Gmez

Dra. Susana del Carmen De la Rosa Garca

1. ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRCTICAS ...................................................................... 1

1. ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRCTICAS

La biotecnologa consiste en un gradiente de tecnologas que van desde las tcnicas de la

QBA. Susana del Carmen De la Rosa Garca PhD

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE INGENIERO BIOQUMICO AMBIENTAL

1.2 COMPETENCIA A LAS QUE CONTRIBUYE

Las competencias que se pretenden desarrollar en los estudiantes y que se consideran

Competencia Genrica: Habilidad de investigacin, capacidad metodolgica, capacidad

Competencia del rea de conocimiento: Disear, desarrollar y adaptar tecnologas ambientales

Competencia de la Unidad de Aprendizaje: Identificar y modificar los procesos microbianos

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE INGENIERO BIOQUMICO AMBIENTAL

1.3 COMPETENCIA UBICADA DENTRO DEL MAPA CURRICULAR

La materia de Biotecnologa Ambiental es una materia obligatoria que se oferta en el octavo

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE INGENIERO BIOQUMICO AMBIENTAL

1.4 NIVEL DEL DESEMPEO

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE INGENIERO BIOQUMICO AMBIENTAL

2. PROGRAMA DEL SISTEMA DE PRCTICAS

Subcompetencia Nombre de la prctica Objetivo de la prctica mbito el Programacin Nivel de

Aislamiento de hongos Uso de diferentes tcnicas de aislamiento Laboratorio 3 6 3

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE INGENIERO BIOQUMICO AMBIENTAL

3. PRCTICAS GENERALES DE SEGURIDAD

3.1 RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE

Las prcticas de laboratorio aqu diseada, requieren de la manipulacin de muestras

1- Durante cada prctica, de manera obligatoria debes portar la bata de laboratorio de

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE INGENIERO BIOQUMICO AMBIENTAL

NOTA: Es de suma importancia leer y cumplir con el reglamento de laboratorio vigente en la

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CAMPECHE INGENIERO BIOQUMICO AMBIENTAL

Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el

Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se manejen,

NOM-025-STPS-2008 Condiciones de iluminacin en los centros de trabajo.

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