Anlisis molecular de los genes de virulencia y los

tipos de reguladores gnicos accesorios (agr) entre

cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la
meticilina (MRSA).
Cheraghi S 1 , Pourgholi L 1 , Shafaati M 1 , Fesharaki SH 1 , Jalali A 2 , Nosrati
R 3 , Boroumand M 4 .
Informacin del autor
1
Departamento de Patologa Molecular, Centro del Corazn de Tehern, Universidad
Tehern de Ciencias Mdicas, Tehern, Irn.
2
Departamento de investigacin clnica cardiovascular, Tehran Heart Center, Tehern
Universidad de Ciencias Mdicas, Tehern, Irn.
3
Departamento de Biotecnologa Farmacutica, Escuela de Farmacia, Universidad Mashhad
de Ciencias Mdicas, Mashhad, Irn.
4
Departamento de Patologa y Medicina de Laboratorio, Centro del Corazn de Tehern,
Universidad de Tehern de Ciencias Mdicas, Tehern, Irn. Direccin electrnica:
maboroumand@yahoo.com.
Abstracto
OBJETIVOS:
Las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) son una causa principal de
infecciones adquiridas en el hospital y se consideran un grave problema de salud pblica. Los
aislamientos de MRSA tienen muchos factores de virulencia, que son la base de su
patogenicidad. El control y la coordinacin de la expresin de estos genes son realizados por
el gen accesorio regulador (agr). El objetivo de este estudio fue determinar la tasa de algunos
genes de virulencia que codifican la enterotoxina, los genes de la toxina exfoliativa (eta), los
genes de adhesina y la identificacin de grupos de especificidad agr en los aislamientos de
MRSA.

MTODOS:
Este estudio descriptivo se realiz entre un total de 296 cepas de MRSA aisladas de muestras
clnicas. Despus de la extraccin de ADN, los ensayos basados en PCR se utilizaron para
evaluar la presencia de algunos genes de virulencia en estos aislamientos. SPSS paquete de
software versin 21 se utiliz para realizar pruebas estadsticas.

RESULTADOS:
Los resultados indicaron que los genes de toxinas ms frecuentes fueron el gen see (en 120
aislamientos, el 40,5%) seguido por el sea en 79 (26,7%) aislamientos y los otros genes
fueron codificados con menor frecuencia. La presencia de seb y seh no se encontraron en los
aislamientos. Por otra parte, los genes de adhesinas mas frecuentes fueron spa, cna, map /
eap y bbp en 281, 275, 265 y 264 aislamientos, respectivamente. La mayora de los
aislamientos pertenecieron al grupo agr I (53%), seguido del grupo agr III (1,4%). Ninguno de
los aislamientos muestra agr grupo II.

CONCLUSIONES:
La frecuencia relativamente alta de algunos genes de virulencia en este estudio sugiere la
aparicin y potencial patognico de los aislados que contienen estos genes en Irn.

INTRODUCCION:

Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) es uno de los principales patgenos

resistentes a los antibiticos[1, 2]. MRSA se identifica como patgenos nosocomiales y es una
causa importante de infeccin hospitalaria (HAMRSA), la infeccin adquirida en la comunidad (CA-
MRSA) y, ms recientemente, la infeccin asociada al ganado (LAMRSA)en todo el mundo [3 - 6].
En instalaciones mdicas, pueden causar una variedad de infecciones graves a menudo difcil de
controlar [7]. En MRSA, la expresin de una protena de unin a penicilina modificada (PBP2a) que
es codificada por el gen mecA causa resistencia contra casi todos los compuestos beta-lactmicos
en el uso clnico [8, 9]. La aparicin de cepas resistentes a la meticilina plantea un serio problema
para la prevencin , el control y el tratamiento antibitico de la infeccin y se ha convertido en
una preocupacin importante, especialmente debido a la creciente prevalencia de resistencia a
varios antibiticos (resistencia a mltiples frmacos) [5, 10].

Las cepas de S. aureus causan un espectro verstil de enfermedades, desde infecciones cutneas
leves a infecciones profundas y graves, incluyendo endocarditis, osteomielitis, neumona, y
sndromes bacteremicos [5], y una alta proporcion de estas son causados por MRSA [1, 6]. De
hecho, estas bacterias tienen abundantes factores de virulencia, que son la base de su
patogenicidad. Componentes de superficie celular (por ejemplo, protena A, protena de unin a
fibronectina, protena de unin a colageno y factor de agregacin) y exoprotenas (por ejemplo,
enterotoxinas, exfoliatinas, toxina del sndrome de choque txico, coagulasa y leucocidina Panton-
Valentine [PVL]) son importantes factores de virulencia de S. aureus [11, 12]. Una lista actualizada
de las caractersticas de los factores de virulencia conocidos revisado por Zecconi y Scalibut [13].
Las diferentes combinaciones de estos factores les dieron una gran capacidad de adhesin a las
superficies, invasin y evasin de las defensas inmunitarias del husped y causar efectos nocivos
al husped.

La base molecular de la patogenicidad de S. aureus es multifactorial, dependiendo de la expresin

de una amplia gama de productos genticos accesorios que se compone de la pared celular y las
protenas extracelulares [14]. Por lo tanto, los genes codificantes de los factores de virulencia, las
exotoxinas secretoras y la hemlisis desempean un papel vital en la virulencia y la resistencia
antimicrobiana en S. aureus. La expresin de estos genes es controlada por el locus del gen
accesorio regulador (agr) [14,15]. Los factores genticos y la disposicin de las funciones
especficas de genoma de MRSA son reas clave de la investigacin actual [6]. La amplificacin del
gen MRSA se ha considerado un mtodo simple y preciso para el aislamiento del MRSA de
distintas fuentes.

El propsito de este estudio fue doble. En primer lugar, fue detectar la presencia y frecuencia de
los principales genes de virulencia entre los Staphylococcus aureus resistentes a meticilina de
diferentes fuentes por amplificacin por PCR.

En segundo lugar, se trat de investigar una posible relacin entre estos genes y diversos tipos de
enfermedades estafiloccicas.

2. MATERIALES Y METODOS

2.1. Aislamientos bacterianos

Un total de 296 aislamientos de S. aureus fueron recolectados del Centro del Corazn de Tehern
en Tehern, Irn entre octubre de 2004 Y marzo de 2013. Se aislaron de diferentes casos clnicos
de diferentes edades con infecciones por S. aureus , respiratorias (80), IVD (8), fluido corporal
estril (7), tracto urinario (10), herida (136), tejido (2) y sangre (53)), y fueron posteriormente re-
identificados a travs de pruebas de confirmacin tales como la produccin de catalasa, DNasa y
ureasa, actividad hemoltica en medio de agar sangre, crecimiento en medio de agar de sal de
manitol, resistencia a novobiocina, su capacidad para coagular citrato de plasma de conejo y
fermentacin de sacarosa y xilosa [16]. Para cepas de MRSA, las cepas en medio liquido de 0.5 de
concentracin estndar de McFarland, fueron cultivadas en agar medio de Muller Hinton y
discos antibiticos con 30ucg de cefoxitina(Mast Group Ltd, UK) y se incubaron durante 18 horas a
37 C. A continuacin, el dimetro de la zona clara alrededor de los discos se midi por los
estndares de Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) y las cepas MRSA fueron identificadas
(dimetro de la zona de inhibicin 21 indic MRSA) [17]. Para anlisis adicionales, los aislados se
cultivaron en medio de caldo Luria Bertani (LB) y se incubaron a 35 C durante 18-24 horas y su
cultivo se conserv a -70 C, suplementado con 20% de glicerol.

2.2. Extraccin de ADN

El mtodo de ebullicin se emple para la extraccin de ADN estafiloccico con algunas

modificaciones descritas por Sepehriseresht et al. [18]. En resumen, la nica colonia estafiloccica
se seleccion de medio agar Luria Bertani de 24 horas y lavado dos veces con tampn TE (Tris 10
mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). El sedimento final se resuspendi en 200 l de agua destilada estril y
se hirvi durante 10 min en agua a 100C antes de ser centrifugado durante 3 min a 8.000 x g para
precipitar los restos bacterianos. El sobrenadante se transfiri a un nuevo tubo estril libre de
DNasa, libre de RNasa. Tres Microlitros del sobrenadante se utiliz como molde para la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR).
2.3. Identificacin de cepas de MRSA por PCR

El gen mecA se amplific mediante PCR utilizando dos pares de oligonucleotdicos especficos:
cebador directo 5'-GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A-3 ' y cebador inverso 5'-CCA ATT CCA
CAT TGT TTCGGT CTA A - 3 ', descrito por Geha et al. [19]. La mezcla para la amplificacin de este
gen consisti en 2,5mcg de tampn de PCR 10X (Tris - HCl 10 mM pH 9, KCl 50 mM y Triton X - 100
al 0,1%), 1,25 mM MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP, 1 M de cada cebador, 1,25 U de ADN
polimerasa Taq y 3 l de plantilla de ADN, en un volumen final de 25 l. La amplificacin se realiz
utilizando un sistema de PCR BioRad MJ MiniTM. La amplificacin consisti en una etapa de
desnaturalizacin inicial a 94 C durante 4 min, 35 ciclos de 94 C durante 45 s, 50 C durante 45
s, y 72 C durante 1 min y una extensin final a 72 C durante 2 min. Un tubo que contiene todas
las mezclas de reaccin de PCR y el ADN humano como molde se us un control negativo. Un S.
aureus aislado que era una cepa resistente a meticilina caracterizada previamente en nuestro
laboratorio se utiliz como un control positivo.

2.4. Deteccin por PCR de genes con factor de virulencia especficos

La existencia de un grupo de alelo I, II y III del gen regulador accesorio y 30 genes con factor de
virulencia estafilococica (incluyendo 14 toxinas, 10 Adhesinas, y 6 los otros genes) fueron aislados
y se evaluaron mediante ensayos de PCR.

Para las enterotoxinas, las secuencias especficas de sea-e, seg-j, sem-o, lukS-PV-lukF-PV, eta, hla,
hlg y edin, que codifican SEA-E; SEG - J; SEM-O; Componentes PVL S y F; ETA; Las hemolisinas alfa,
gamma; Y EDIN, respectivamente, fueron detectados mediante el uso de cebadores y el protocolo
de PCR descritos anteriormente por Jarraud et al. [14]. La presencia de genes para las adhesinas
(clfA, clfB, cna, spa, sdrC, sdrD, sdrE, sdrH, bbp y mapa / eap), agr grupos I a III, y otros genes de
virulencia (chp, efb, icaA, coaT y rad C) fueron determinados de acuerdo con los parmetros de
Cebadores delanteros y traseros y las condiciones utilizadas para amplificar los genes de inters
[20]. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis de gel de agarosa al 1%. Se
incluyeron un control positivo y un control negativo en cada prueba de PCR.

2.5. Anlisis estadstico

Los resultados se expresaron como frecuencias y porcentajes absolutos. Para los anlisis
estadsticos, se utiliz el software estadstico SPSS versin 21.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago,
IL). Las curvas se trazaron usando Excel versin de software 2010 (Microsoft Corporation, EE.UU.).

Resultados
A Se recogieron 296 aislamientos de S. aureus de varias infecciones de los
pacientes en el Teharn Heart Center en Tehern, Irn entre octubre de 2004 y
marzo de 2013. Entre los MRSA aislados en este estudio, la mayor proporcin
perteneca a las muestras de heridas con una tasa Del 69,5% (139 pacientes),
mientras que las muestras de tejido tenan tasas muy bajas de slo el 1% (2
pacientes). Como presunto MRSA, se caracterizaron adems por herramientas
moleculares con el fin de determinar cules de ellos pertenece al aislado de MRSA
y si son portadores de genes mecA . Todos los aislados ensayados (n = 296)
basados en el gen mecA y las pruebas de sensibilidad a los antibiticos
pertenecan al grupo MRSA. La presencia de mecA Fue concordante con los
resultados obtenidos mediante la prueba de difusin en disco con meticilina.

3.1. Presencia, frecuencia y distribucin de los genes de la toxina

La Tabla 1 muestra los resultados de las pruebas moleculares para la deteccin
de genes que codifican las toxinas SEA, SEB, SEC, SEE, SEG, SEH, SEI, SEM,
SEN y SEO. De los 296 aislados de S. aureus probados, en general, 294 (99,3%)
aislamientos resultaron ser positivos para uno o ms genes de enterotoxinas. Dos
de los aislamientos no portaban ninguno de los 13 genes de la toxina. Como se
muestra en la Fig. 1 , la mayor frecuencia de enterotoxinas se observ en
muestras clnicas que se aislaron del tracto urinario (100%) seguido de sangre
(94,34%). Entre los genes que codifican las enterotoxinas clsicas (SEA-SEE), el
gen ms frecuente fue ver , fue fundado en 120 aislamientos (40,5%) seguido
de Sea en 79 (26,7%) aislamientos. Respecto a las otras enterotoxinas, seoFue el
ms frecuentemente observado (13 aislamientos, 4,4%). Sin
embargo, eta , seg , seg , sei , sem , sen y seo fueron codificados con menos
frecuencia, y seb , y seh estaban ausentes en el conjunto de los aislamientos. En
las muestras clnicas que se aislaron de la herida, respiratoria, IVD, sangre y fluido
corporal estril, ver fue el ms frecuente y este gen no se observaron en muestras
de tejido; Sin embargo, la frecuencia ms alta de genes de la toxina en el tracto
urinario era el mar . El gen eta se detect en 1 S. aureusAislado (0,3%) aislado de
la sangre. Los genes PVL que codifican la toxina de leucocidina Panton-Valentine
no se encontraron en la mayora de los aislamientos ensayados. Un total de 296
aislamientos de S. aureus fue probado para la presencia de los genes PVL por
PCR, y 1 (0,3%) fue positivo y se asoci con infecciones de tejido y en otras
infecciones estuvo ausente ( Tabla 1 ). Dado que todos los aislamientos MRSA se
obtuvieron a partir de diferentes infecciones, se detect el gen alfa-hemolisina
( hla ) en 201 (67,9%) aislamientos.

3.2. Presencia, frecuencia y distribucin de adhesina

La distribucin de genes adhesina se proporciona en la Tabla 2 . Como se
muestra en la Tabla 2 y la Figura 1 , todos los aislamientos de MRSA tenan uno o
ms genes de adhesina. Entre los genes que codifican la adhesina, el ms
frecuentemente de los genes es el clfA, Spa, cna, map / eap y bbp en 281
(94,9%), 275 (92,9), 265 (90,2), 265 (89,5) y 264 ) Aislados, respectivamente. Sin
embargo, la menor frecuencia de genes fue sdrH que se identific en 32
aislamientos (10,8%).

Presencia, frecuencia y distribucin de grupos agr y otros genes de virulencia

El grupo agr de todos los aislamientos se analiz por amplificacin y
secuenciacin. Todos los aislamientos se clasificaron como parte de uno de los
tres grupos agr ( Tabla 3 ). Los resultados de la tipificacin del locus agr indicaron
que la mayora de los aislamientos pertenecan al grupo agr I (53%), seguido
del grupo agr III (1,4%). Ninguno de los aislamientos muestra agr grupo II. La
frecuencia ms alta de la agr grupo I se observ en muestras clnicas que aisladas
de tracto urinario (90%), seguido de las vas respiratorias (53,8%), mientras que,
los aislados perteneca a AGRGrupo III se obtuvieron de respiratorio (3,8%) y
sangre (1,9%), respectivamente. Con respecto a otros factores de virulencia , se
identificaron los genes coaT , efb , chp , edin y radC

Discusin
La posesin de las diferentes combinaciones de genes que codifican los factores
de virulencia en los aislados de MRSA son la base de su patogenicidad [13] . En la
investigacin existente, utilizamos una coleccin de cepas de Staphylococcus
aureusresistente a la meticilina (MRSA) clnicamente bien caracterizadas para
evaluar los principales genes de virulencia en pacientes con diferentes tipos de
infecciones. Nuestra investigacin en este documento proporciona pruebas
detalladas sobre la presencia y la distribucin de la toxina de S. aureus , adhesina
y otros genes de virulencia especficos, as como agr grupo. En el presente
estudio, las cepas de MRSA que causan varios tipos de infecciones de manera
significativa contenan una variedad de toxinas o genes de adhesina.
La mayora de las enfermedades de S. aureus son causadas por toxinas
especficas cuyos genes son conocidos por ser frecuentemente contenidos en
elementos genticos mviles tales como islas de patogenicidad ( seb, sec, seg,
seh, sei, sek, sel, sem, sen, seo y seq ), plsmidos ( ETB , seb , sed, etc.), o fagos
( mar, ver y septiembre ) [2] ; [14] . Las enterotoxinas estafiloccicas clsicas
(SEA a SEE) son tradicionalmente conocidas como causas comunes de la
enfermedad humana [21]Y se ha atribuido un porcentaje relativamente pequeo
de casos a las nuevas enterotoxinas. Nuestros hallazgos fueron consistentes con
este principio. Los genes de enterotoxinas ms frecuentes encontradas en los
aislamientos fueron ver y el mar y el porcentaje de cepas con nuevos genes
enterotoxgenos fue considerablemente bajo. Numerosos estudios se han
realizado sobre los genes txicos de MRSA en todo el mundo; La frecuencia de
los genes se inform en el amplio rango. En el presente estudio, el mar se detect
en 79 (26,7%) de los aislamientos ( Tabla 1 ), lo que se aproxima a los resultados
de estudios relacionados (27,39%) realizados en Irn por Hosseini alfatemi et
al. [17] . Esta prevalencia fue relativamente menor que (58%) reportada por
Saadati et al.[22] . En este estudio, se encontr que la mayor frecuencia entre los
genes productores de toxina perteneca a losgenes hla . Observaciones similares
han sido reportadas por Hosseini et al. [17] . Ellos fundaron hlagen en el que el
93,15% de lascepas de S. aureus aislados. La presencia de eta en nuestros
aislados de MRSA fue baja. Similar a nuestros resultados, las tasas de frecuencia
degenes eta en Shiraz (Irn) tambin fue de 0,68% [17] . Esto indica que nuestras
cepas de MRSA no causaron la toxina exfoliativa general.
Ms del 99% de los aislados de MRSA en esta investigacin no containe
el gen pvl . Aunque, varios estudios han informado de una alta prevalencia
del gen pvl entre las cepas de MRSA causando infecciones [23] ; [24] ; [25] , su
prevalencia en el presente estudio (0,3%) fue menor de lo que se inform
anteriormente. Entre los MRSA probados en el presente estudio, el gen pvl que se
fund slo en muestras de tejidos y este gen no se observ en el MRSA aislado
de otras muestras ( Tabla 1 ]. Hay dos descripciones posibles para esta
observacin. En primer lugar, nuestros hallazgos han demostrado que nuestros
pacientes exclusivamente infectados con cepas de HA-MRSA no contienen este
gen yPvlno fue un factor de virulencia importante en los aislados de MRSA
recogidos en el hospital[26] . PVL debido a los dos genes que lo codifican ( lukS-
PV y lukF-PV ) desempea un papel crtico en la patognesis de la comunidad
asociada MRSA (CA-MRSA) y se asoci con la comunidad de infecciones
adquiridas de S aureus [4] ; [5] . En segundo lugar, el suministro de pruebas
epidemiolgicas adicionales que asocian la presencia de este gen y la aparicin
de infecciones de los tejidos [23] ; [27] y en la que pvl ha sido menos frecuente
en otros sitios de infeccin.
Se cree que la capacidad de adherencia a diferentes sustratos del husped es
crtica para la colonizacin y el establecimiento de infecciones de S.
aureus [13] ; [28] . El anlisis PCR de los genes de adhesina revel los
genes clfA, Spa, can, map / eap y bbp en 281, 275, 265 y 264 aislamientos,
respectivamente, de las 296 cepas investigadas, lo que sugiere un papel
importante de estos elementos en la patogenia del MRSA . Nuestros hallazgos son
consistentes con estudios previos. Por ejemplo, Peacock y colegas encontraron
que siete genes, as como CNA , SDRE , y ica fueron significativamente ms
comn en S. aureusAislados asociados con la infeccin invasiva que en los
aislados de transporte nasal [29] . Las buenas asociaciones entre la presencia de
genes putativos de adhesina ( fnbA , ClfA , ClfB , CNA , spa,
SDRC , SDRD , SDRE, BBP y mapa / EAP ) y el resultado clnico reportados por
Bae et al. [27] .
Hemos investigado una posible relacin entre el gen accesorio
regulador (agr)especificidad grupos en cepas resistentes a la meticilina
Staphylococcus aureus y sus tipos de muestras clnicas. Nuestras observaciones
no estaban de acuerdo con otros estudios que encontraron que las cepas que
causan enfermedades mediadas por toxinas pertenecieron al agr grupo I o
II [14] . Los resultados indicaron que la mayora de los aislamientos pertenecieron
al grupo agr I o III y el grupo agr II no se observ en ninguno de los
aislamientos. En el presente estudio, el grupo agr I fue predominante en las cepas
resistentes a meticilina aisladas de pacientes. Estos hallazgos confirman
que agr Grupo I desempear un papel ms importante en el control y la
coordinacin de la expresin de muchos genes que codifican los factores de
virulencia, exotoxinas secretoras y hemlisis en los aislados de MRSA.