Las Cyathostominae equinas pueden desarrollarse hasta larvas infecciosas de la tercera etapa

en camas de paja

Abstracto

Antecedentes: Los animales de pastoreo domesticados, incluidos los caballos y los burros, se
alojan frecuentemente utilizando sistemas de cama de lecho profundo, en los que
comnmente se supone que no existe riesgo de infeccin por los nematodos asociados con el
pastoreo en los pastos. Utilizamos dos enfoques diferentes para probar si equids podra
infectarse con cyathostomines de la ingestin de lecho de paja de cama profunda.

Mtodos: Se realizaron dos estudios de parcelas de horticultura en incubadoras hortcolas

configuradas para simular tres escenarios de lecho de paja y un control positivo de csped. Se
colocaron heces en 16 parcelas y se realizaron recuperaciones de larvas en muestras de
sustrato de paja / pasto en periodos de 2 a 3 semanas. Dentro de cada incubadora, se
estableci un termostato para mantener una temperatura ambiental de aproximadamente
10C a 20C. Para proporcionar una validacin adicional,

Se recogieron 24 muestras de lecho de paja durante un perodo de 8 semanas a partir de seis

graneros en los que un gran nmero de burros fueron alojados en un sistema de lecho de paja
de cama profunda. Estas muestras se recogieron de la cama superficial en 16 sitios a lo largo
de una "W" ruta a travs de cada granero.

Resultados: No se recuperaron larvas infecciosas de ninguna de las parcelas que contenan

paja seca. Sin embargo, larvas de cyathostomine infecciosas se detectaron por primera vez en
el da 8 de parcelas que contenan paja hmeda. En el estudio de lecho de paja, se detectaron
larvas de citiostoma en 18 de las 24 muestras. Adems, en los dos establos que fueron
muestreados en serie, el nivel de infectividad larvaria generalmente aument de una semana a
otra, excepto cuando se elimin y reemplaz la cama de paja.

Conclusiones: Hemos demostrado que las citiostominas equinas pueden desarrollarse hasta
larvas infectivas en lechos hmedos de paja. Por lo tanto, es posible que un caballo o burro
acostado en la paja de basura profunda se infecten por la ingestin de la paja contaminada.
Esto tiene implicaciones para el control de parsitos en quidos de establo y potencialmente
en rumiantes alojados, y se requiere ms investigacin para establecer la presin infecciosa
relativa de lecho de paja versus lecho de paja.

Palabras clave: paja, equid, burro, Strongyle, L3, infeccin

Fondo
Se ha establecido que el desarrollo y / o la
Viva de las etapas larvarias infecciosas de los strongyles equinos
Afectadas por la temperatura y la humedad en ambos labora-
Tory experimentos [1 - 3] y estudios de campo [4 - 13]. Estas

Climticas sobre el desarrollo larvario han sido

Rigurosamente revisado [14]. La presencia de estrona-

Gyles sobre materiales de cama de caballos alojados ha sido

Inform [15 - 17]. En estos estudios longitudinales, aunque

Mayor nmero de larvas infecciosas fueron generalmente

Durante los meses de verano, las larvas infecciosas
Encontrados en material de cama durante los 12 meses
Perodo de estudio [16, 17]. Nuestro objetivo era estudiar el

En las camas de paja.

Los resultados de tres estudios separados y complementarios
Se presentan en este trabajo con el fin de examinar y
Validar diferentes aspectos del mtodo de laboratorio y
recomendaciones. Se utiliz un estudio de sustrato para evaluar el efecto
Del sustrato de la incubadora en el desarrollo
Estudio de temperatura fue utilizado para evaluar el
Temperatura dentro de la incubadora, y una cama final
Se utiliz un estudio para comprobar si las larvas pueden reco-
De paja in vivo.

Mtodos
Diseo del estudio
El estudio de sustrato se realiz en junio y julio
2014 en West Central Scotland. Fecal separado del caballo
Pats se aadieron a tres parcelas dentro de cada incubadora.
La hierba / paja en cada parcela se muestre dos veces por semana
Por un perodo de 17 das.
El estudio de la temperatura se realiz en febrero y
Marzo de 2015 en West Central Scotland. Un burro fecal
Se aadi pat a una sola parcela dentro de cada una de las tres
Bators La paja en cada parcela se muestre tres veces
Por semana a intervalos regulares (lunes, mircoles y
Viernes) durante un perodo de 22 das.
El estudio del lecho se realiz durante 7 semanas
Perodo comprendido entre finales de enero y principios de marzo de 2015.
Se recogieron muestras semanales en un patrn de forma de "W"
Graneros de lechos de paja que cubren un gran
Nmero de asnos conocidos por tener catego-
Infecciones. Dos de los seis graneros disponibles fueron muestreados
Cada semana durante 7 semanas consecutivas, dos graneros fueron
Muestreados en cuatro ocasiones, y los dos graneros restantes
Fueron muestreados una vez. Los graneros estaban situados en proper-
En la misma ubicacin geogrfica en Sidmouth en
Devon, Inglaterra.

Incubadoras y equipos
Los incubadores utilizados en estos estudios son tpicamente
Firmado para uso en horticultura (Bio Green Jumbo Propa-
Gators, Chesterfield, Inglaterra). Un termostato electrnico
Y la estera de calefaccin controlaba la temperatura dentro de cada incubadora, y se utilizaba
una cubierta superior
Densificacin. Cada incubadora midi 60 x 130 cm y
La cubierta tena 50 cm de altura en el centro. Aluminio
Bandejas (dimensiones: 50,2 119,4 x 2,3 cm) se colocaron
Dentro de cada incubadora para proteger las esteras calefactoras. Sub-
Material fecal se coloc sobre el material plstico
Tainers (Van Ness Giant cat Litter Pans, Clifton, Nueva Jersey,
EE.UU.), formando parcelas con dimensiones 55,6 42,5
16,5 cm dentro de la incubadora. En el estudio de sustrato, el
Se ajust el termostato para mantener una temperatura de 20 C
Dentro de cada incubadora. En el estudio de temperatura, el
Los termostatos se fijaron a 10 C, 15 C y 20 C.

Incubadoras y parcelas individuales

Para el estudio de sustrato, se utilizaron cuatro incubadoras con
Sustratos de paja seca y limpia, paja de agua limpia,
Riega la paja contaminada y riega el csped. Incuba-
Tores con paja contaminada contenan una capa inferior
De lechos de paja de hojarasca recogidos de un establo de
Caballo sin la infeccin por cyathostomine patente. Cada uno de
Las cuatro incubadoras contenan tres parcelas separadas con
El mismo sustrato (12 cm de profundidad), pero utilizando diferentes
Palmaditas fecales La fecal pat utilizada para cada una de las primeras parcelas
Fue recogido de un caballo sin patente cyathosto-
Infeccin de las minas (para actuar como control), el segundo en cada
Incubadora contena heces de un caballo con un bajo fae-
La cuenta del huevo del gusano de cal (FWEC), y la tercera parcela en cada
Incubadora contena heces de un caballo con una
FWEC. Se estableci que cada incubadora
Temperatura constante de 20 C. Sustratos en todos los
(Excepto la paja seca) se regaron diariamente
Duracin del estudio.
Para el estudio de la temperatura, cada parcela
Y cada parcela fue regada diariamente a lo largo de
el estudio.
Riego durante la incubacin
Cada parcela de riego individual se le dio 100 ml de agua
por da. Las parcelas de csped en el estudio de sustrato se dieron
500 ml de agua por parcela por da durante los primeros 7 das, y
Esto se redujo gradualmente a 100 ml por parcela por da
Durante los ltimos 5 das del estudio. El agua estaba distribuida
Con una regadera.

Control de la temperatura y la humedad de la incubadora

La temperatura y la humedad relativa de cada in-
Bator se registraron cada 2 h durante la duracin de la
Estudio utilizando el 'HOBO UX100-011 Temp / RH de datos de registro-
Ger 'que proporciona lecturas con un 2,5% de precisin. Uno
Se coloc un registrador de datos dentro de cada incubadora. Los datos
Fueron ledas de cada registrador cada semana usando
HOBOware versin 3.6.2, y los promedios diarios fueron
Calculado a partir de la media de 12 2 temperatura por hora
Grabaciones.

Fuentes fecales

Se utilizaron heces recin desechadas de tres caballos adultos para hacer las placas fecales
utilizadas para el estudio de substrato. Un caballo de la fuente era un caballo del deporte del
gelding de 16 aos que no haba pastado en 7 aos y fue dosificado con la ivermectina en tres
ocasiones durante los primeros 12 meses de ser alojado permanentemente. Por lo tanto, se
consider improbable que este caballo estuviera infectado con para-sitios de strongyle. El
segundo caballo fuente era una yegua Thor-oughbred de 15 aos de edad que pastoreaba a
tiempo completo entre junio y octubre durante los 4 aos anteriores a este estudio, y se haba
dosificado con pamoato de pirantel 8 meses antes del estudio. El tercer caballo de origen era
una yegua de 20 aos de edad de caballo de montaa galesa, pasado pastoreo 20 meses antes
del estudio y dosificado con fenbendazol, a continuacin, moxidectina, 6 meses ms tarde.

Durante 3 semanas antes del comienzo del estudio de parcela, el FWEC de los caballos de
origen se controlaron diariamente. El primer caballo (probablemente no infectado) result
negativo en todas las ocasiones. El segundo caballo tena un FWEC que oscilaba entre 75-450
huevos por gramo (epg), con una media de 269 epg. El tercer caballo tena un FWEC que
oscilaba entre 500 epg y 1350 epg, con una media de 921 epg. El da 1 del estudio de sustrato,
el FWEC de los tres caballos fuente fue 0, 150 y 850 epg, respectivamente, segn se determin
a partir de las mismas placas fecales utilizadas para el estudio. Se utiliz una muestra
combinada de heces de burro con FWEC de 1.200 epg para crear las placas fecales para el
estudio de la temperatura.

En el estudio del lecho, se recogieron muestras semanales caminando en una ruta "W" a travs
de cada granero recogiendo pinzas de paja superficial de 16 sitios uniformemente distribuidos.
Los pellizcos de paja se recogieron en bolsas de polietileno separadas para cada granero. El
aire se expres manualmente a partir de las bolsas, que luego se sellaron y enviaron a la
Universidad de Glasgow para la recuperacin de larvas dentro de las 48 h de la recogida de
muestras. Las muestras fecales individuales tambin se obtuvieron intermitentemente de los
mismos grupos de animales. Estas muestras se procesaron individualmente usando un mtodo
McMaster modificado con una sensibilidad mnima de 25 epg, y los resultados se combinaron
posteriormente para dar el FWEC animal medio del grupo.

Golpes fecales

Las tiras fecales para todas las parcelas se obtuvieron mezclando 2 kg de fae-ces de cada una
de las fuentes (despus de la adicin de 400 ml de agua), luego haciendo 500 g de palmaditas
usando un contenedor de 750 ml 'Lock & Lock' 15 cm de dimetro. Despus se coloc cada
palmadita sobre un trozo de malla con un dimetro de 18,5 cm y un dimetro de poro de 2
mm. A continuacin, se colocaron la malla y la malla sobre el sustrato de la incubadora (paja o
csped).

Mtodos de muestreo y frecuencia

En el estudio de sustrato, cada parcela se dividi en ocho secciones triangulares iguales

utilizando un marco de madera y
cuerda. El marco restringi el rea de muestreo a 38 cm2. Cada parcela se muestre dos veces
por semana durante las primeras 2 semanas, dando como resultado dos secciones de cada
parcela que se muestreaban por semana. En la tercera semana, la quinta muestra se tom
como normal, luego las tres secciones restantes en cada parcela se recogieron juntas y se
agruparon para formar una sola muestra (da 17). Esto result en que las ocho secciones de las
parcelas fueron muestreadas durante 17 das. Las secciones a muestrear se seleccionaron
aleatoriamente sin sustitucin (es decir, excluyendo aquellas secciones que ya haban sido
muestreadas).

Las muestras de hierba fueron recolectadas cortando la hierba cerca del csped, sin incluir las
races. Las muestras de paja se recogieron levantando manualmente un puado pequeo de la
paja y recortando cualquier exceso. Las muestras se recogieron a travs del rea superficial de
la seccin triangular individual, es decir, de regiones tanto cercanas como distantes de la
porcin fecal. Las muestras de hierba y paja se almacenaron a temperatura ambiente en
bandejas de aluminio y se pesaron antes del lavado para la recuperacin de larvas. A
continuacin se volvieron a pesar las muestras despus de dejarlas secar al aire.

En el estudio de temperatura, la paja fue muestreada tres veces por semana (lunes, mircoles
y viernes) durante 22 das, y las secciones muestreadas fueron seleccionadas al azar con
reemplazo, de manera que algunas secciones fueron muestreadas en ms de una ocasin.
Recuperacin de larvas de hierba / ropa de cama

Las muestras se pusieron en una lavadora (Mini Lavadora XPB15-2318, Good Ideas, Tensor
Marketing Ltd. Darlington) con 2 l de agua tibia, y gir a travs de 100 revoluciones. El material
lavado se hizo pasar a travs de un tamiz de malla gruesa y se recogi en un recipiente,
despus se hizo pasar a travs de un tamiz de 38 m. Lo que qued en el tamiz se proces
entonces usando una tcnica de Baermann.

Cultura fecal

Al comienzo del estudio de sustrato, se colocaron 80 g de heces procedentes de cada uno de

los tres caballos fuente en un recipiente de poliestireno separado, cubierto con una tapa y se
dej a temperatura ambiente durante 21 das. Todas las larvas presentes se recuperaron
utilizando una tcnica de Baermann y se identificaron mediante mi-croscopia utilizando la llave
proporcionada por Soulsby [18].

Resultados

No se identificaron nematodos distintos de larvas de citiostomina y larvas de vida libre de las

muestras de los estudios. Las larvas de vida libre se detectaron en aproximadamente el 20% de
las parcelas de hojarasca y csped.

Estudio de substrato

El peso en seco de las muestras de paja recuperadas se situ entre 2,9 y 7,8 g, y las muestras
de gramneas pesaron desde 1,3 a las parcelas de control positivas en el estudio de sustrato, ni
de cualquier parcela de la incubadora en la que las parcelas contenan paja seca. S1). Las larvas
fueron detectadas por primera vez en el da 8, y esto fue de una parcela de paja hmeda a
aproximadamente 20 C ya una humedad relativa de 61-70% (Tabla 1). El desarrollo de las
larvas pareca ocurrir ms lentamente cuando la parcela era de paja o de csped.

De los cultivos fecales se recuperaron 0, 1.875 y 38.356 larvas. Las dos ltimas tasas de
recuperacin de larvas equivalan a 3 y 9% del total de huevos presentes a partir de 500 g de
parches fecales con FWEC de 150 epg y 850 epg. La proporcin de estas larvas potencialmente
viables recuperadas de las parcelas del estudio de sustrato oscil entre 0,021-0,535%.

Estudio de la temperatura

La deteccin ms temprana de las larvas de cyathostomine en el estudio de la temperatura era

en el da 13, ocurriendo en parcelas con la temperatura ms baja de 15 C y la humedad de
30-40% (Cuadro 1, el archivo adicional 2: La figura S2 ). El cultivo larvario de las heces de burro
usadas para crear las placas fecales fue infructuoso debido al error de laboratorio, por lo que
las tasas de recuperacin no se pudieron calcular para este estudio.

Estudio de cama

Se encontraron larvas infecciosas de cateostomina en muestras de lecho de paja de cada uno

de los seis establos de burros individuales en al menos una ocasin. Se recolectaron un total
de 24 muestras de lecho de paja, de las cuales 18 fueron positivas para larvas de citiostoma y
el recuento ms alto fue de 4.551,7 larvas por kg de lecho seco. El rango de los conteos de
huevos fecales promedio del grupo fue entre aproximadamente 700 y 1.400 epg.

En la Fig. 1 se muestran las cuentas medias de huevos de gusano fecal y la correspondiente

recuperacin de larvas de lecho de paja durante el perodo de 8 semanas. Los graneros C y D
se muestrearon en 7 semanas consecutivas, durante las cuales hubo un incremento general en
la infectividad de lecho de paja. La cama-ding se despej de Barn D despus de la semana 7 de
muestreo, y la muestra de la semana 8 fue negativo para larvas cyathostomine. Los conteos de
huevos de gusanos fecales en el grupo fueron relativamente consistentes y parecan no
mostrar una relacin obvia con los conteos de larvas.

Discusin

Hemos demostrado que cyathostominae equinos pueden desarrollarse hasta larvas infectantes
de la tercera etapa en lecho de paja tanto in vitro como in vivo, lo que indica que la
transmisin de larvas de cyathostomine es posible a travs de la gestin de la cama. Esto tiene
claras implicaciones para el manejo de la salud de los equinos alojados, y tiene implicaciones
potenciales para el manejo de otras especies de pastoreo. Se han informado de resultados
similares de la Repblica Checa y Ucrania [15-17].

Sin embargo, se emplearon algunas prcticas de manejo atpicas en las propiedades donde se
realiz el estudio de lecho de paja. En estas propiedades, los burros fueron manejados en
grupos muy grandes con un promedio de grupo relativamente alto FWEC. Esto es en contraste
con muchas propiedades equinas, donde slo una pequea proporcin de animales tienen
patentes cyathostomine infecciones [19, 20]. El FWEC de los burros en el estudio actual fueron
monitoreados con frecuencia, y se realiz la dosificacin anthelmintica dirigida usando
umbrales ms altos de FWEC que se aplicara tpicamente en las propiedades equinas. Se
registr una marcada reduccin en el conteo de larvas despus de la eliminacin de la paja en
este estudio. Despus de los resultados de este estudio, la instalacin donde se recogieron las
muestras del estudio de lecho adopt la prctica de renovar completamente la cama de paja
aproximadamente cada 2 semanas, como una medida preventiva de rutina.

Adems de los hallazgos relacionados con el manejo de animales alojados, este estudio
tambin ha demostrado un mtodo barato y eficaz de simular las condiciones de desarrollo in
vivo de huevos de nematodos a L3 infecciosa. Las incubadoras generalmente funcionaron bien,
creando una gama de temperaturas y humedades relativas. Como resultado, existe un margen
considerable para extender estos experimentos para cuantificar la media y la variabilidad de
las tasas de desarrollo de parsitos en diferentes condiciones atmosfricas y en substratos
variables. Estudios previos sobre cyathostomine desarrollo se han realizado en una variedad
de entornos en las parcelas al aire libre [6, 10, 12, 13]. Una ventaja de estudiar el desarrollo
larvario de los parsitos en condiciones de simulacin en interiores fue que los efectos no
previsibles de las condiciones climticas predominantes (como lluvia y / o desecacin) no
podan afectar la deteccin y / o recuperacin de las larvas. Aunque las incubadoras son
econmicas, con un diseo y una funcin sencillos, no representan una simulacin precisa de
las condiciones de manejo en las que factores como la contaminacin fecal en curso, la
alteracin mecnica del lecho y la contaminacin urinaria equina pueden afectar el desarrollo
larvario de las cateostominas. Una limitacin especfica del equipo usado en los estudios aqu
descritos fue la incapacidad para reducir la temperatura dentro de las incubadoras por debajo
de la temperatura ambiente. Esto puede plantear un problema potencial en el uso de estos
mtodos durante los meses de verano relativamente calurosos

El trabajo presentado aqu se pretende como una prueba de concepto en lugar de una
investigacin de la biologa cyathostomine per se, sin embargo, las observaciones sobre las
tasas de desarrollo apoyan la intencin de que las condiciones del estudio eran
representaciones realistas de las condiciones prcticas de gestin. Adems, los hallazgos del
estudio reporta- dos aqu compararon bien con estudios previos sobre el desarrollo de la
citiostoma con respecto a la duracin del desarrollo a las larvas infectantes de la tercera
etapa. A una temperatura de aproximadamente 20 C, ya una humedad relativa de
aproximadamente 60-80%, las larvas infecciosas estuvieron presentes en aproximadamente 1
semana. Se observ que el desarrollo de larvas era ligeramente ms lento en heces de burro,
pero debido al tamao limitado de la muestra ya la humedad variable entre el sustrato y los
estudios de temperatura, no fue posible determinar si esta diferencia se deba a los parsitos,
condiciones atmosfricas o Simplemente casualidad. Es interesante notar que no hubo
diferencia aparente entre la tasa de desarrollo de larvas mantenidas a 15 C y 20 C, aunque
es posible que la reduccin de la humedad a temperaturas ms altas contrarresta cualquier
aumento en la tasa de crecimiento debido a la Mayor temperatura. Tambin es interesante
que el nmero de larvas recuperadas del csped no sea cualitativamente mayor que el
recuperado de la paja, ya que se espera que el csped presente el hbitat ms natural (y por lo
tanto ms conveniente) para los parsitos. La explicacin ms probable es que el tamao de la
muestra relativamente pequeo y la alta variabilidad entre los recuentos larvales oscurecieron
la diferencia entre los sustratos, y que un estudio ms amplio mostrara un mayor nmero
promedio de larvas en el csped. Sin embargo, tambin es posible que el riego diario diera
lugar a que se lavaran ms larvas de la hierba comparadas con la paja o que una diferencia en
las densidades de los dos materiales diera como resultado un mayor volumen de paja que
daba el mismo peso seco Como un volumen ms pequeo de hierba. Por lo tanto, se requiere
un estudio adicional de estos factores potenciales antes de que se pueda considerar que el
mtodo de conteo larval produce resultados equivalentes a partir de sustratos dismiles.

A partir de los cultivos fecales, se estableci que la viabilidad de los huevos de strongyle en el
sustrato de estudio fae-cal parches estaba entre 3-9%. Estudios de parcela anterior sobre
cyathostomine desarrollo inform cyathostomine huevo viabilidad de 96% [10]. No hay una
explicacin clara de la viabilidad comparativamente baja de los huevos de catego- tomina en el
presente estudio, pero las tasas de recuperacin del orden del 0,3% observadas de la paja en
las condiciones ptimas sugieren que slo aproximadamente el 10% de las larvas
potencialmente viables son capaces de desarrollarse hasta L3 dentro del tiempo normal de
desarrollo de la paja.
Conclusiones

Hemos demostrado que cyathostominae equino puede desarrollar a las larvas infectivas en
lecho de paja hmedo. Por lo tanto, es posible que un caballo o burro acostado en una paja de
basura profunda se infecte al ingerir la paja contaminada. Esto tiene implicaciones para el
control de parsitos en quidos de establo y potencialmente en rumiantes alojados, y se
requiere ms investigacin para establecer la presin infecciosa relativa de lecho de paja
versus lecho de paja.

Archivos adicionales

Archivo adicional 1: Figura S1. El nmero de larvas infectantes de cyathostomine se recuper

de muestras seriadas tomadas durante un perodo de 17 das de cuatro diferentes incubadoras
de sustrato (paja de arena, paja seca, paja regada y csped). Dentro de cada una de las cuatro
incubadoras, se establecieron tres parcelas utilizando fuentes fecales de 0 epg, 150 epg y 850
epg, respectivamente. (PDF 5 kb)

Archivo adicional 2: Figura S2. El nmero de larvas infectantes de cyathostomine se recuper

de muestras seriadas tomadas durante un perodo de 22 das a partir de tres parcelas de lecho
de paja incubadas a 8-10 C, 15 C y 20-23 C, respectivamente. (PDF 5 kb)

Tabla 1 Resumen de los resultados del estudio de sustrato y temperatura

Substrate study Temperature study

Plot herbage Dry straw Moist straw Deep litter straw Grass turf Moist straw

Temperature (C) 2021 2021 2021 2021 810 15 2023

Humidity (%) 5658 6177 6176 6076 7085 5565 3040

FWEC (epg) of faecal source 0 150 850 0 150 850 0 150 850 0 150 850 1,200 1,200 1,200

Total no. of cyathostomine L3/kg recovered 0 0 0 0 977 7,594 0 0 9,996 0 2,500 8,000 0 25,644 21,644

Proportion of viable cyathostomine eggs recovered as larvae 0 0 0 0.480 0.182 0 0 0.156 0.535 0.021 na na na

No. of days to first larval detection 8 8 10 17 10 13 13

Abreviatura: na no disponible

En las incubadoras se colocaron parches fecales de huevos o de burro con conteo de huevos
de gusano fecal (FWEC) de 0, 150, 850 1.200 huevos por gramo (epg) durante
aproximadamente 3 semanas y se recolectaron muestras de forraje dos veces o tres veces
(Estudio de la temperatura) semanal

Fig. 1 Nmeros de larvas infecciosas de cyathostomine recuperadas de las muestras semanales

de la lechada de la paja (cruces) y de la cuenta media del huevo de gusano fecal de los
animales correspondientes (crculos) de seis graneros diferentes que contienen gran nmero
de burros en lecho profundo de la litera (Barn A, n = 70 asnos; Barn B, n = 48 asnos, Barn C, n =
140 asnos, Barn D, n = 95 asnos, Barn E, n = 38 asnos, Barn F, n = 43 asnos). El establo D se
despej y volvi a ponerse en cama en la semana 7 inmediatamente despus del muestreo, y
los establos E y F se despejaron y se rellenaron durante la semana 5 (mostrada como barras
grises en la figura)
Deteccin de Strongylus vulgaris en muestras fecales equinas mediante PCR en tiempo real y
cultivo larvario - comparacin de mtodos y evaluacin de la ocurrencia

Abstracto

Antecedentes: Strongylus vulgaris se ha convertido en un parsito raro en Alemania durante

los ltimos 50 aos debido a la prctica frecuente de terapia antihelmntica profilctica. Hasta
la fecha, el desarrollo emergente de resistencia en Cyathostominae y Parascaris spp. A
numerosos antihelmnticos equinos ha cambiado el manejo de la desparasitacin y la
frecuencia de uso de anthelminticos. En este sentido, es esencial la deteccin fiable de
infecciones parasitarias, especialmente de S. vulgaris altamente patgena. En el presente
estudio se compararon dos mtodos diagnsticos para la deteccin de infecciones con S.
vulgaris y se obtuvo informacin sobre la aparicin de este parsito en caballos alemanes. Para
este propsito, las muestras fecales de 501 caballos fueron examinados para S. vulgaris con
PCR en tiempo real y un cultivo larvario adicional se realiz en muestras de 278 caballos. Un
subgrupo de 26 caballos se someti a mltiples exmenes de seguimiento con ambos mtodos
con el fin de evaluar tanto la persistencia de infecciones por S. vulgaris como la
reproducibilidad de cada mtodo de diagnstico.

Resultados: La PCR en tiempo real revel el ADN de S. vulgaris en diez de 501 muestras de
equinos investigadas (1,9%). El cultivo larvario demostr larvas de S. vulgaris en tres de las 278
muestras (1,1%). Una comparacin directa de los dos mtodos fue posible en 321 muestras,
incluyendo 43 exmenes de seguimiento con el resultado de 11 muestras de S. vulgaris
positivo por PCR en tiempo real y 4 muestras de S. vulgaris positivo por cultivo larvario. La
prueba de McNemar (p-valor = 0,016) revel una diferencia significativa y los valores kappa
(0,525) mostraron un acuerdo moderado entre la PCR en tiempo real y el cultivo de larvas.

Conclusiones: La PCR en tiempo real detect una proporcin significativamente mayor de

positivos de S. vulgaris en comparacin con el cultivo de larvas, por lo que debe considerarse
como un mtodo de diagnstico de rutina para la deteccin de S. vulgaris en muestras de
equinos.

Fondo

La resistencia creciente de los pequeos grupos fuertes (Cyathosto-minae), Parascaris spp.

(Ascarididae) y Oxyuris equi (Oxyuridae) contra los medicamentos antihelmnticos [1 - 5]
requiere cambios importantes en el control de parsitos equinos. Durante los ltimos 50 aos,
los caballos fueron tratados principalmente profilcticamente varias veces al ao [6 - 11]. Este
enfoque se bas en las recomendaciones, dado principalmente con el fin de evitar las
infecciones con Strongylus vulgaris [12]. Debido a la resistencia emergente de Cyathostominae
a los medicamentos antihelmnticos disponibles, se ha implementado un enfoque alternativo
basado en la terapia antihelmntica selectiva (SAT) en algunas granjas de caballos [13, 14]. El
principio de SAT comprende un cambio importante en la frecuencia de aplicacin de
anthelmnticos con un espectro anti-strongyle basado en el tratamiento de caballos con un
conteo de huevos fecales (FEC) de huevos de strongilo por encima de cierto umbral,
determinado con una cantidad cuantitativa Mtodo de conteo de huevos fecales, como el
McMaster [3, 15-18]. Sin embargo, para la deteccin fiable de infecciones con otras especies
importantes de parsitos equinos como Anoplocephala perfoliata, O. equi y Strongylus spp.
(Strongyles grandes, Strongylinae) ms pruebas de diagnstico especficas deben aplicarse
[13].

El rgimen de tratamiento antihelmntico intensivo de las ltimas dcadas podra ser

responsable de la actual baja incidencia de S. vulgaris (0,2-1,3%) recientemente determinada
por el cultivo de larvas en caballos alemanes [10,19-21]. Sin embargo, un mtodo diagnstico
fiable para la diferenciacin de S. vulgaris de Cyathostominae es esencial debido a la patologa
significativa causada por la migracin de larvas de S. vulgaris en las arterias mesentricas. Los
efectos patognicos asociados como el infarto intestinal, la peritonitis, la arteritis verminosa, la
trombosis y la embolia pueden provocar sntomas como clico, cojera de la patas posteriores,
anomalas neurolgicas y lesiones en el corazn, el hgado o el rin que podran ser letales en
el peor de los casos [22 - 24].

En la actualidad, el mtodo estndar para la diferenciacin de Cyathostominae y Strongylinae

es la determinacin de las diferencias morfolgicas de las larvas de la tercera etapa (L3)
despus del cultivo larvario, ya que su morfologa del huevo es similar y, por tanto, imposible
de distinguir [25, 26]. Sin embargo, a pesar de que este mtodo tiene la ventaja de ser
rentable, tambin requiere mucho tiempo debido al perodo de desarrollo del huevo fuerte a
la L3 y la posterior diferenciacin morfolgica que debe ser realizada por personal calificado y
experimentado [ 29].

Hasta la fecha, la deteccin de S. vulgaris es posible con PCR convencionales y en tiempo real
en muestras fecales, as como un suero Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) [30 - 32].

Segn estudios realizados anteriormente, tanto la PCR convencional como la PCR en tiempo
real proporcionan alta especificidad y sensibilidad [30, 33-37]. Adems, Nielsen et al. [30]
afirm la PCR en tiempo real como un potencial mtodo estndar para una deteccin fiable de
S. vulgaris [30]. Por lo tanto, los objetivos del presente estudio fueron evaluar la deteccin de
S. vulgaris mediante PCR en tiempo real en comparacin con el mtodo de diagnstico
estndar (cultura larval) y aadir informacin sobre la ocurrencia de S. vulgaris En caballos
alemanes detectados por PCR en tiempo real y cultivo larvario.

Mtodos

Muestras fecales

En total, se recolectaron 1.455 muestras fecales equinas de 91 granjas alemanas entre marzo
de 2013 y mayo de 2014. Todas las muestras se obtuvieron del Centro de Diagnstico de la
Ctedra de Medicina Tropical Comparada y Parasitologa, LMU Munich, Alemania. Cada
muestra se analiz utilizando un mtodo McMaster modificado con un lmite de deteccin de
20 huevos por gramo de heces (EPG) y el mtodo combinado de sedimentacin-flotacin [17].
Se seleccionaron muestras con un mnimo de 20 EPG.

Suponiendo una poblacin de 1,1 millones de caballos alemanes [38] con una prevalencia de
infeccin con S. vulgaris de 1% [3, 10, 19-21], se tuvo que investigar un mnimo de 459
caballos, ya que en este caso la probabilidad de Detectar por lo menos un caballo infectado fue
superior al 99% [39]. Por lo tanto, se investigaron muestras de 501 de 1455 caballos (nivel de
caballo, 34,4%) por PCR en tiempo real para una infeccin con S. vulgaris (Fig. 1) en el presente
estudio.
Para 278 de los 501 caballos, una cantidad suficiente de material fecal estaba disponible para
la preparacin de un cultivo larvario con el fin de diferenciar las larvas.

En 26 de los 501 caballos investigados, los exmenes de seguimiento se realizaron 4-6 meses
despus del examen inicial. En este contexto, un total de 43 muestras de los 26 caballos de seis
granjas diferentes se analizaron mediante PCR en tiempo real y cultivo de larvas. Se realizaron
exmenes de seguimiento si el resultado en PCR en tiempo real fue positivo para S. vulgaris
(Tabla 1) o larvas no determinables estuvieron presentes en el primer examen de cultivo
larvario. En el caso de dos caballos que eran S. vulgaris positivos en el primer examen, el
conjunto de caballos se prob tambin para S. vulgaris. Con estos exmenes, la difusin de S.
vulgaris debe ser verificada en los caballos que viven en la misma explotacin.

Ninguno de los caballos que se sometieron a un examen de seguimiento se haba

desparasitado hasta la fecha de la nueva prueba. As, un total de 544 muestras fueron
analizadas por PCR en tiempo real y un total de 321 muestras fueron analizadas por cultivo
larvario (nivel de muestra, Fig. 1).

El conjunto de datos total se separ en dos conjuntos de datos para los diferentes anlisis, ya
sea en la muestra o en el caballo nivel (Figura 1]. Adems, los anlisis de prevalencia se
realizaron a caballo ya nivel de finca. Tan pronto como se prob un caballo con S. vulgaris-
positivo, su explotacin de origen se clasific como positiva a nivel de explotacin.

En la medida de lo posible, se recopil informacin sobre cada caballo investigado, a saber,

edad, raza, sexo y fecha del ltimo tratamiento antihelmntico.

Deteccin, concentracin y aislamiento de huevos

Gastrointestinal strongyle huevos fueron aislados de muestras fecales utilizando un combinado

de sedimentacin-flotacin tcnica [17]. Primero, se mezclaron 40 g de heces con 500 ml de
agua, luego se filtraron a travs de un tamiz de 300 m y se sedimentaron a 10 C durante 12
h. El sedimento se dividi y se transfiri a dos tubos centrfugos, uno con solucin saturada de
azcar (peso especfico / densidad de la solucin 1,27 +/- 0,01) y uno con solucin saturada de
sulfato de zinc (ZnSO4, peso especfico / densidad de la solucin 1,28 +/- 0,01, Carl Roth GmbH
y Co. KG, Karlsruhe, Alemania) y se centrifug durante 5 min a 635 g.
En el caso de un diagnstico microscpico positivo de vulos de strongilo, los huevos se
clasificaron como espordicos (0-300 huevos), numerosos (301-3000) o abundantes (> 3000).

Los huevos se enjuagaron del tapn con agua destilada, se vertieron en un vaso de
precipitados y se introdujeron en un tubo de centrifugacin

Tabla 1 Fechas de los exmenes iniciales y de seguimiento de cuatro caballos PCR-positivos en

tiempo real (forma cnica) que luego se centrifugaron a 635 g durante 10 min. El lquido
restante se retir por succin. El sedimento restante se transfiri a un tubo Eppendorf de 1,5
ml y luego se centrifug una vez ms a 10.621 g durante 3 min. El lquido restante se retir por
succin y el sedimento se congel en estado seco a -20C.

Identificacin larval

Los cultivos larvarios modificados despus de Roberts y O'Sullivan [40] se llevaron a cabo para
la determinacin morfolgica de las larvas de S. vulgaris. Se incubaron 10 gramos de heces a
temperatura ambiente durante 14 das. Durante estos 14 das, las muestras se ventilaron
diariamente durante 1 h y se humedecieron para evitar la desecacin de las heces. La tcnica
de Baermann-Wetzel se utiliz para aislar el L3 [17].

Despus del tiempo de migracin de 24 h a temperatura ambiente, se extrajeron 10 ml del

lquido del embudo de Baermann. Para la concentracin de las larvas, el lquido se almacen
en un tubo de centrfuga a 10 C durante otras 24 h. Posteriormente, el sobrenadante se
retir por succin y se dejaron 2 ml en el tubo. Se contaron todas las larvas contenidas en el
sedimento (L / 10 g = larvas por 10 g de heces) y se determinaron morfolgicamente mediante
microscopio. Para la immovilizacin de las larvas, se aadi una gota de yodo de Lugol a una
gota de la suspensin larvaria e investig inmediatamente. Los criterios morfolgicos se
determinaron segn Brger et al. [41] y Boch et al. [42].

Extraccin de ADN de huevos aislados

La extraccin se realiz de acuerdo con la instruccin del fabricante (QIAamp DNA Mini y
Blood Mini Handbook) de acuerdo con el protocolo de rotacin de sangre o fluido corporal
(Qiagen, Hilden, Alemania). Brevemente, antes de la extraccin, el sedimento que contiene los
huevos de strongilo se incub en un bao ultrasnico con 150 l de PBS (solucin salina
tamponada con fosfato) durante 4 min seguido de un paso de congelacin durante 20 minutos
a -20C y una repeticin de la etapa de incubacin. El ADN se eluy con 200 \ mu l de tampn
de elucin. La concentracin de ADN (ng / l) y la calidad de cada muestra se analizaron con el
espectrofotmetro Nano-Drop ND-1000 (PeqLab, Erlangen, Alemania). Las muestras se
almacenaron a -20C hasta que se usaron para anlisis de PCR.

Anlisis Molecular

PCR en tiempo real

Las muestras se examinaron para S. vulgaris por PCR en tiempo real usando el sistema de PCR
en tiempo real AB-7500 (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania). Secuencias de rDNA
dirigidas por PCR del segundo espaciador transcrito interno (ITS-2: 169 pb) de Cyathostominae
y Strongylus spp. Nema-todes. El cebador directo Sv-f (5'-GTATACATTAAA-
TAGTGTCCCCCATTCTAG-3 '), el cebador inverso Sv-r (5'-GCAAATATCATTAGATTTGATTCTTCCG-
3') y la sonda modificada Sv-p 5'-FAM-TGGATTTATTCT-CACTACTTAATTGTTTCGCGAC-BHQ1 -3
'se utilizaron como se describe anteriormente [30]. El volumen de reaccin de 25 l consisti
en 5 l de ADN molde, 2,25 l (0,9 M) de cada cebador (10 M), 0,5 l de la sonda (0,2 M) y
15 l de TaqMan Gene Expression Master Mix , Darmstadt, Alemania). Se aadieron un control
negativo y un control positivo a cada reaccin de PCR. El control positivo (ADN extrado de
gusanos adultos que fueron identificados morfolgicamente como S. vulgaris) fue
proporcionado por el Centro de Investigacin de M. H. Gluck Equine, Universidad de Kentucky,
EE.UU. Se utiliz el siguiente protocolo de PCR: una activacin inicial a 95C durante 10 min
seguido por un conjunto de 40 ciclos, cada uno consistente en 15 s a 95C y 60 s a 60C (AB
Systems Standard protocol, Applied Biosys- Darmstadt, Alemania).

Para verificar la eficiencia y la sensibilidad relativa de la PCR en tiempo real, se cre una curva
estndar de acuerdo con la instruccin del fabricante de AB Systems (Ap-plied Biosystems,
Darmstadt, Alemania) con diez pasos de dilucin del control positivo (triple preparacin). Se
realiz un anlisis hasta un paso de dilucin de 1: 100.000.

Los resultados se registraron como el nmero de ciclo PCR promedio en el que se haba
excedido el umbral de deteccin de fluorescencia (Ct). La lnea de umbral se estableci en el
punto ptimo en la fase lineal del grfico de amplificacin. La observacin de un aumento
exponencial hasta un Ct de 37,5 fue contada como positiva de acuerdo con los resultados de la
curva standar.

PCR convencional y secuenciacin

Para verificar los resultados de la PCR en tiempo real, se realiz una PCR convencional
adicional con secuenciacin subsiguiente de los productos de amplificacin con muestras PCR
positivas en tiempo real utilizando los mismos cebadores (100 M) (Eppendorf Mastercycler
MWG Biotech, Ebersberg, Alemania).

La mezcla de reaccin contena 5 l de ADN molde, 5 l (1x) de tampn 10x, 1 l (200 M) de

dNTPS, 0,5 l (1 M) de cada cebador (100 M), 0,25 l (1,25 U) de HotStar Taq DNA
Polymerase Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y agua ultra grado puro llenado hasta un volumen
total de 50 l. Se utiliz el siguiente protocolo: 5 min a 95C durante un ciclo, 95C durante 30
s, 49C durante 30 sy 72C durante 40 s durante 45 ciclos, seguido de 72C durante 5 min.

Los productos de PCR de la PCR convencional se analizaron en gel de agarosa al 2% teido con
tincin de cido nucleico Gel RedTM, 10.000 x en agua (ambos de Biotium, Hayward, EE.UU.).
El DNA Gene regla 100 bp Plus Escalera de ADN se utiliz para el tamao y la cuantificacin de
los productos de PCR. La visualizacin de las imgenes de gel se realiz con un sistema de
documentacin de gel (Peqlab, Erlangen, Alemania).
Los productos de PCR positivos se purificaron usando el QIA-quick PCR Purification Kit (Qiagen,
Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La secuenciacin directa e inversa fue
realizada por Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania). Las secuencias inversas se
invirtieron, se complementaron y se alinearon con las secuencias avanzadas utilizando
herramientas en lnea (Reverse Complement: http://www.bioinforma-
tics.org/sms/rev_comp.html, Clustal Omega: https://www.ebi.ac .uk / Herramientas / msa /
clustalo). Las bsquedas en bases de datos y las comparaciones de secuencias se realizaron
con BLAST proporcionado por el Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica (BLAST:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Anlisis estadstico

Los anlisis estadsticos se realizaron utilizando la versin 22.0 del software IBM SPSS (IBM
Corporation, Armonk, EUA) y Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, Seattle, EE.UU.).
Puesto que nuestros datos no satisfacan los supuestos de normalidad, se utilizaron mtodos
no paramtricos clsicos. La correlacin entre EPG y L / 10 g de heces se calcul utilizando el
coeficiente de correlacin de Spearman. Con el fin de determinar la diferencia estadstica de la
capacidad de la PCR en tiempo real y el cultivo de larvas para detectar una muestra positiva de
S. vulgaris, se realiz una prueba de McNemar para comparar las proporciones apareadas y se
calcularon los valores de Kappa para una evaluacin de Acuerdo entre las dos pruebas. Todos
los anlisis estadsticos se interpretaron como estadsticamente significativa hasta el p-valor
<0,05.

Resultados

Origen de la muestra

De las 1455 muestras, los conteos de huevos fecales de Strongyle (FEC) de 804 muestras
(55,3%) fueron positivos que oscilaron entre <20 y 11.080 EPG. Se registr una EPG> 200 en
348 muestras (23,9%).

De las 804 muestras positivas para el conteo de huevos fecales, se seleccionaron al azar 544
muestras (20-11.080 EPG, media: 482 EPG, mediana: 200 EPG) de 501 caballos para
investigacin adicional con PCR en tiempo real. El nmero de caballos investigados
procedentes de 91 granjas vari de 1 a 112 por explotacin.

La FEC de la PCR en tiempo real de S. vulgaris muestras positivas, oscil entre 20 y 1720 EPG.
La FEC de una muestra no se pudo determinar debido a la baja cantidad de materia fecal
disponible. Sin embargo, se incluy en el estudio debido a los numerosos huevos de strongyle
detectados en la flotacin de sedimentacin combinada.

De esos 501 animales, la edad era conocida por 374 y el sexo era conocido por 425 caballos.
La edad de los caballos oscil entre 1 y 35 aos con una edad media de 12 aos. Se
examinaron muestras de 174 yeguas (40,9%), 246 caballos (57,9%) y cinco sementales (1,2%).
En promedio, para 398 caballos, el ltimo tratamiento antihelmntico se haba realizado 11
meses (rango 2-196 meses) antes de la inscripcin en el presente estudio.

Cultura larval

El cultivo larvario se realiz y evalu a partir de 321 muestras fae-cal procedentes de 278
caballos (incluyendo exmenes de seguimiento). Se detect un total de 451.832 larvas de
Cyathostominae (L3) en 93.5% de los cultivos (100.0% de la finca). Entre 1 y 31,251 larvas por
10 g de heces fueron contadas. Las EPG y las heces L / 10 g correlacionaron con una
correlacin de rango de Spearman de 0.826 (p = 0.000).

Un total de 11 larvas de S. vulgaris se detectaron en un total de cuatro muestras (nivel de

muestra).

Con respecto al nivel del caballo, se encontr S. vulgaris en 3 de 278 caballos (1,1%). Los
caballos positivos de S. vulgaris se originaron en 3 de las 62 fincas investigadas (4,8%).

La presencia de diferentes estadios larvarios en un total de 321 larvas culturas se document

en detalle. Las larvas de Strongyli-nae en las primeras (L1) y segundas etapas (L2) se
encontraron en 52 muestras en un rango de espordico (mximo 4 larvas / muestra) y en
cuatro muestras en un rango de nu- merous (> 15 larvas ). Adems, se encontraron vainas
vacas de larvas Strongylinae en cinco de las 321 muestras (mximo 3 / muestra). Las larvas de
Triodontophorus sp. Se encontraron en nueve muestras, larvas de Trichostron-gylus axei en
tres muestras y larvas de nematodos de vida libre estuvieron presentes en 15 muestras.

PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real fue positiva en 13 de 544 muestras investigadas (2,4%, Tabla 2).

Con respecto al nivel de caballos de 501 caballos, la oc-currencia de S. vulgaris obtenida por
PCR en tiempo real fue del 1,9% (10/501). Los caballos positivos al S. vulgaris se originaron en
10 de 91 fincas investigadas (10,9%). En cada granja slo un caballo fue positivo para S.
vulgaris.

La curva estndar revel una eficiencia del 90,5% (pendiente -3,571; R2 0,996). Se realiz un
anlisis positivo con una dilucin de hasta 1: 10.000 (y-Inter 37.428) del control positivo con el
fin de estimar la sensibilidad relativa. Debido a una cantidad desconocida de ADN en el control
positivo, no se dispona de valor de referencia y no fue posible analizar un potencial
cuantitativo de la PCR en tiempo real. No hubo correlacin estadsticamente significativa entre
el nmero de larvas de S. vulgaris dentro de una muestra y el correspondiente valor Ct, ya que
la cantidad total de muestras era demasiado pequea. Una muestra PCR-positiva que contena
una sola larva de S. vulgaris tena un valor de Ct de 34,97, que es ms alto comparado con los
valores de Ct de 24,94 a 29,87 obtenidos por las otras tres muestras positivas a PCR que
contenan tres o cuatro larvas en la cultura.

Exmenes de seguimiento

Cuatro caballos inicialmente positivos a S. vulgaris fueron reexaminados en los exmenes de

seguimiento. Las muestras de seguimiento de dos caballos resultaron positivas diariamente. El
caballo 1 (Tabla 1) se prob positivo en el nico examen de seguimiento (Tabla 2) que se
realiz 4 meses despus del examen inicial. El examen de seguimiento del caballo 3 (Tabla 1)
se realiz 6 meses despus del examen inicial. En este contexto se tomaron muestras fecales y
se analizaron para S. vulgaris en 11 das consecutivos. Adems de la investigacin inicial, se
detect tambin S. vulgaris en las muestras fecales recogidas los das 1 y 4 (Tabla 2). Los otros
exmenes de seguimiento de todos los caballos que fueron reexaminados fueron negativos
para S. vulgaris. Sin embargo, el bajo nmero de caballos examinados de seguimiento en este
estudio no permiti un anlisis estadstico.

Comparacin de PCR en tiempo real y cultivo de larvas

Se pudo establecer una comparacin directa entre la PCR en tiempo real y el cultivo de larvas
para 321 muestras del nivel de muestra. Los resultados de los dos ltimos mtodos difieren
significativamente segn la prueba de McNemar (0,016) (Tabla 3). Esto est en lnea con el
kappa de Cohen, que muestra un valor de 0,525 indicando slo un acuerdo moderado.

PCR convencional y secuenciacin

Se obtuvieron resultados de secuenciacin interpretables de los 13 aislamientos. Dos de ellos

eran 100% homlogos con una secuencia de S. vulgaris de un caballo de Australia (GenBank
nmero de acceso X77863.1) [33]. Once secuencias mostraron un 99% de similitud con las
ltimas secuencias que contienen una sola sustitucin de nucletidos (C en lugar de G en bp
61).

Las secuencias determinadas en la regin ITS-2 en este trabajo se depositaron en GenBank

bajo los siguientes nmeros de accesin: KT250609 - KT250621

Discusin

S. vulgaris fue detectado en tres de 278 caballos investigados (1,1%) por cultivo larvario y en
10 de 501 caballos investigados (1,9%) por PCR en tiempo real. Esta baja ocurrencia de S.
vulgaris est en consonancia con los estudios previamente realizados que investigan muestras
fecales de caballos alemanes obtenidos por cultivo larvario con una prevalencia que oscila
entre 0,2 a 1,3% [10, 19-21]. Una prevalencia comparable tambin se ha informado en Suiza
[3].

Por el contrario, los estudios de otros pases revelaron una mayor prevalencia de S. vulgaris
tanto por cultivo de larvas como por PCR. En un estudio de Dinamarca, Nielsen et al. [36]
examinaron 663 caballos de 42 fincas mediante cultivo larvario y PCR en tiempo real con un
resultado de 113 caballos positivos de S. vulgaris (17,5%). En una investigacin de caballos de
Polonia por necropsia, los nematodos fueron aislados del intestino y diferenciados revelando
una prevalencia de 22,8% (165/725) para S. vulgaris [43]. Una prevalencia an mayor del
41,3% (19/46) se detect en caballos de Cerdea, Italia, a travs de cultivo larvario [44]. En
comparacin con los datos de Alemania, Bracken et al. [45] encontraron una mayor
prevalencia de infeccin con S. vulgaris en caballos daneses no slo a caballo con 13,6%
(45/331) sino tambin a nivel de finca con 72,2% (13/18). Un informe comparable sobre el
nivel de la finca fue reportado por Nielsen et al. Con una prevalencia del 64,3% (27/42)
determinada por la cultura larvaria [18].

En el presente estudio, se detect S. vulgaris en 10 de las 91 fincas investigadas (10,9%). Una

baja presencia de S. vulgaris en las granjas de Alemania fue demostrada adems por el hecho
de que tanto la PCR en tiempo real como el cultivo larvario revelaron un nico caballo positivo
de S. vulgaris por granja. Estos hallazgos estn de acuerdo con otra reciente encuesta de
prevalencia alemana, que report un nivel de finca de 1,04% (2/192) y detect solo un solo
caballo positivo de S. vulgaris por finca utilizando cultivo larvario [21].

El rgimen de tratamiento antihelmntico intensivo de las ltimas dcadas, as como el largo

perodo prepatente de seis a siete meses podra ser responsable de la actual baja incidencia de
S. vulgaris en Alemania [3, 46, 47]. Sobre la base de estos argumentos, una baja ocurrencia de
S. vulgaris menos del 5% fue informado por Hertzberg et al. [3] para los caballos que viven en
Suiza. A pesar del rgimen de tratamiento antihelmntico intensivo de las ltimas dcadas, la
aparicin de S. vulgaris todava persiste en un nivel bajo. Una posible razn para esta
persistencia podra ser una eficacia larvicida no completa de la ivermectina, como sugieren
Nielsen et al. Debido a sus resultados del estudio en 2014 [48].

Diferentes estudios han sealado que el nmero de larvas de Cyathostominae en los cultivos
de larvas es mayor comparado con el nmero de larvas de S. vulgaris [21, 23, 29, 49]. Por
ejemplo, Ogbourne y Duncan [23] se refieren a una amplia variedad de especies Strongyle en
muestras fecales de equinos Muestras que comprenden larvas de S. vulgaris en menos del
10%. Bellaw y Nielsen [29] informaron que aproximadamente el 1,0% de las larvas detectadas
eran L3 de S. vulgaris (1486 S. vulgaris vs. 142.725 larvas de Cyathostominae). En el presente
estudio, el 0,16% de todas las larvas en 13 muestras de S. vulgaris positivas fueron L3 de S.
vulgaris (11 larvas de S. vulgaris versus 6706 larvas de Cyathos-tominae). Tanto el nmero
marginal de larvas de S. vulgaris contadas en el cultivo de larvas como el hallazgo de solo un
caballo positivo de S. vulgaris por finca podran explicarse por una baja tasa de infeccin y por
un bajo desprendimiento de huevos de S. vulgaris Infectados.

Por consiguiente, pueden producirse falsos resultados negativos en muestras que comprenden
un nmero bajo de huevos de S. vulgaris. Por lo tanto, la dependencia de la presencia de
huevos en la muestra fecal investigada es la principal desventaja del diagnstico de S. vulgaris
con mtodos coprolgicos como la PCR en tiempo real y el cultivo de larvas [31, 32, 50].
Adems, el perodo de prepatencia relativamente largo, as como la dependencia del
desarrollo de la L3 infecciosa en las condiciones ambientales es responsable de la
estacionalidad de S. vulgaris, lo que puede conducir a falsos resultados negativos en ciertas
pocas del ao [23]. , 51]. Varios estudios fueron capaces de probar una fluctuacin estacional
de la eliminacin de huevos de S. vulgaris, con un pico en el verano y una depresin en el
invierno [52-55]. Sin embargo, el estudio actual no pudo confirmar tal influencia de la
estacionalidad en la deteccin de huevos de S. vulgaris debido a una coleccin no estacional de
muestras y un nmero bajo de muestras positivas. Sin embargo, el presente estudio revel una
tasa significativamente mejorada de deteccin de S. vulgaris por PCR en tiempo real en
comparacin con el mtodo estndar de cultivo larval estndar.

Mtodo molecular para la deteccin de Strongylus spp. Se describi por primera vez por
Campbell et al., En 1995. La especificidad de la PCR convencional que investiga el gen ITS-2 de
S. vulgaris ya se ha analizado mediante la deteccin de variaciones interespecficas en la
secuencia del gen ITS-2 entre S. vulgaris, S. edentatus y S. equi-nus va PCR convencional y
posterior secuenciacin [33]. La especificidad de la PCR en tiempo real fue confirmada por
Nielsen et al. [30] mediante pruebas de reaccin cruzada entre

S. vulgaris, S. edentatus, S. equinus y una mezcla de diferentes larvas de Cyathostominae. Por

lo tanto, no se esperaba una posible reaccin cruzada con el ADN de otros nema-todes de los
strongilidos equinos. Adems de la especificidad, la sensibilidad de la PCR en tiempo real
tambin ha sido analizada por Nielsen et al. Lo que resulta en un lmite de deteccin de 0,5
stron-gyle equivalente de huevo [30].

Debido al perodo de desarrollo de hasta 14 das para las larvas de fuertes, el cultivo de larvas
es un mtodo que consume mucho tiempo [29] aunque es rentable para la deteccin de S.
vulgaris. Una sensibilidad del 73% y una especificidad del 84% determinada por el cultivo de
larvas en comparacin con los datos de necropsia han sido reportadas por Nielsen et al. [28].
Sin embargo, este mtodo tambin depende de la presencia de huevos de S. vulgaris en las
muestras investigadas, al igual que la PCR en tiempo real.

Adems, el cultivo de larvas tiene la desventaja adicional de que pueden producirse falsos
resultados negativos debido a un desarrollo inhibido de L3 que puede ser causado por
fluctuaciones de temperatura, humedad, crecimiento de hongos y contaminacin con
nematodos de vida libre. En el presente estudio, el cultivo exitoso de larvas de Cyathostominae
se verific por la correlacin positiva entre el "nmero de larvas de Cyathostominae" y el "FEC"
de la muestra fecal. Cyathostominae lar-vae se cultivaron con xito en el 98% de las muestras
positivas al huevo de strongilida. Una posible explicacin para un desarrollo inhibido de las
larvas podra ser una congelacin parcial accidental de las muestras durante el transporte, que
se inform de 12 muestras FEC-positivas que re-vealed slo un nmero limitado de larvas en la
cultura larval. Ogbourne y Duncan [23], Hasslinger [56] y Enigk [51] han descrito ya el impacto
negativo de las bajas temperaturas en el desarrollo de larvas de fuertes. Adems, las etapas
del procedimiento despus del cultivo tales como la descarga del sobrenadante, la
purificacin, la sedimentacin y la pipeta tambin pueden conducir a una prdida de larvas. La
diferenciacin morfolgica de las larvas a travs de un examen microscpico debe ser llevada a
cabo por personal calificado y experimentado, ya que la deteccin de larvas de S. vulgaris es
difcil y lleva mucho tiempo [28]. Los resultados falsos negativos debidos a estos ltimos
aspectos podran ocurrir fcilmente, ya que las muestras positivas para S. vulgaris comprenden
a menudo slo un nmero limitado de larvas de S. vulgaris. El uso de un procedimiento
alcuota con el diseo para investigar 100-200 larvas con el fin de ahorrar tiempo tambin
podra contribuir a falsos resultados negativos.

Con la intencin de evitar este error, todas las larvas por 10 g / heces se identificaron en el
presente estudio.

Con el fin de mantener o incluso reducir la baja prevalencia de S. vulgaris en Alemania y

prevenir la introduccin de S. vulgaris dentro de las granjas y entre ellas, es crucial una
optimizacin apropiada de los procedimientos de diagnstico y de manejo [3].

Aplicacin de PCR en tiempo real para la deteccin de S. vulgaris como un mtodo de rutina es
posible en cualquier laboratorio con equipos adecuados para la PCR en tiempo real
procedimiento [45]. Los huevos de Strongyle recuperados por el mtodo combinado de
sedimentacin / flotacin combinada pueden usarse directamente para la extraccin de ADN y
posterior PCR en tiempo real. En el presente estudio, un FEC de 20 EPG fue suficiente para la
deteccin de S. vulgaris por PCR en tiempo real.

Dado que los exmenes de seguimiento en este estudio revelaron que no todos los exmenes
reproducen inicialmente un resultado positivo de S. vulgaris, la investigacin de muestras
fecales compuestas por caballo mediante PCR en tiempo real para una adecuada deteccin de
S. vulgaris podra ser til en los diagnsticos de rutina diaria. Por otra parte, todos los caballos
de un rebao o al menos "pacientes de alto riesgo", como los recin llegados y los caballos con
desconocida desparasitacin historia debe ser ex-amined individualmente [3]. Preliminares
para una integracin en una nueva granja, un examen exhaustivo de S. vulgaris es tambin
esencial para los caballos procedentes de pases con una alta prevalencia de S. vulgaris como
Dinamarca, una parte de Italia y Polonia [36, 43, 44].

Conclusin

De acuerdo con los resultados del presente estudio, la deteccin de infecciones por patentes
con S. vulgaris mediante PCR en tiempo real revela una mejora significativamente mejorada de
la velocidad de deteccin en comparacin con el mtodo estndar actual basado en el cultivo
larvario y la posterior diferenciacin morfolgica . Por lo tanto, la PCR en tiempo real podra
ser una opcin fiable para la deteccin de S. vulgaris en muestras fecales equinos en el
diagnstico de rutina y en el control integrado de parsitos equinos.

Abreviaturas
Ct: umbral de ciclo; ADN: cido desoxirribonucleico; ELISA: Ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas; EPG: Huevo por gramo de heces; FEC: Nmero de huevos fecales; ITS: espaciador
transcrito interno; L / 10 g: Larvas por 10 g de heces; L1: estadio larvario 1; L2: Etapa larvaria 2;
L3: estadio larvario 3; PBS: Solucin salina tamponada con fosfato; PCR: reaccin en cadena de
la polimerasa; SAT: Terapia antihelmntica selectiva; ZnSO4: Solucin de sulfato de zinc

Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer a todos los veterinarios equinos involucrados y propietarios de
caballos por apoyar el estudio. Tambin, apreciamos altamente la ayuda confiable de Elisabeth
Kiess, de Kathrin Simon, de Tim Tiedemann y de Andrea Mihalkov en trabajo de laboratorio.

Fig. 1 Visin general de la divisin de muestras de heces fecales y la correspondiente

motivacin .
 Tabla 1 Fechas de los exmenes iniciales y de seguimiento de cuatro caballos PCR-positivos
en tiempo real

Horse 1 2 3 4

Date of first examination 2013/05/27 2013/06/04 2013/08/06 2013/06/13

Date of follow-up 2013/09/16 2013/10/30 2014/02/11 2014/02/07

examinations
2013/10/31 2014/02/12 2014/02/08

2013/11/01 2014/02/13

2013/11/02 2014/02/14

2013/11/03 2014/02/15

2013/11/04 2014/02/16

2013/11/05 2014/02/17

2014/02/18

2014/02/19

2014/02/20

2014/02/21

Tabla 2 Resultados resumidos de muestras positivas en PCR en tiempo real (FEC,

combinacin-sedimentacin-flotacin, cultivo de larvas ** y valor de Ct)

Sample-No. FEC Combined- Larval culture Larval culture Ct

sedimentation- Cyathostominae** S. vulgaris **

flotation*

21 20 + 16 3 27.58

144a 20 + 5 4 24.94

235 1040 +++ 33.49

318 100 + 533 0 26.90

334 900 +++ 1256 0 35.81

355 ++ 27.67

375 40 + 28 0 35.99

412 1720 +++ 103 0 23.40

448b 20 + 34 0 36.95

451c 20 + 57 0 35.07

460 200 ++ 535 0 35.75

497 480 +++ 1111 3 29.87

520 680 +++ 3028 1 34.97

FEC = conteo de huevos fecales; Ct = umbral de ciclo

* + = Huevos espordicos; ++ = numeroso; Abundante

** Nmero de larvas de Cyathostominae o S. vulgaris / 10 g heces

- mtodo de diagnstico no realizado

Examen posterior de la muestra-No. 21, 2013/09/16 bsample-No. 375, 2014/02/12 y
Csample-No: 375, 2014/02 /15