Guia de microbiologia UE

UNIVERSIDADE
DE VORA
DEPARTAMENTO DE BIOL OGIA
MICROBIOLOGIA
Textos de apoio e Manual prtico
Carlos Sinogas, Lus Alho, Isabel Brito

2003 / 2004
www.dbio.uevora.pt
NDICE
Comportamentos em laboratrio de microbiologia .............................................................................3

Nvel de segurana 1 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------3
Registos e relatrios .....................................................................................................................6
Tcnicas laboratoriais bsicas em microbiologia................................................................................7
Meios de cultura-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------7
Esterilizao ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------8
Tubos de cultura e placas de Petri -----------------------------------------------------------------------------------------------8
Instrumentos para transferncia de culturas ----------------------------------------------------------------------------------9
Cmaras de cultura-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------9
Frigorfico -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------9
Mtodos de esterilizao ............................................................................................................. 10
Esterilizao pelo calor ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 10
Esterilizao por gases ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
Radiaes------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 12
Filtrao estril---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
O Microscpio............................................................................................................................ 13
Componentes principais do microscpio-------------------------------------------------------------------------------------- 13
Princpios tericos ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 14
Observao ao Microscpio------------------------------------------------------------------------------------------------------- 15
Morfologia das bactrias.............................................................................................................. 16
Corantes ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 16
Meios de cultura ........................................................................................................................ 18
Tipos de meio ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 18
Preparao ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 19
Contagens de microrganismos....................................................................................................... 20
Avaliao directa -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 20
Contagem de viveis --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 21
Isolamento de colnias em meio slido .......................................................................................... 22
Sementeira por espalhamento--------------------------------------------------------------------------------------------------- 22
Sementeira por riscado ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 22
Condies ambientais de crescimento dos microrganismos................................................................. 24
Oxignio ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24
pH do meio ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 25
Temperatura-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 25
PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS....................................................................................................... 27
P1. MICRORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE------------------------------------------------------------------------------ 27
P2. OBSERVAO COMPARADA DE BACTRIAS, FUNGOS E PROTOZORIOS ------------------------------------ 30
P3. PIPETAGENS E DILUIES----------------------------------------------------------------------------------------------- 33
P4. MEIOS DE CULTURA ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 36
P5. CULTURAS PURAS--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 38
P6. COLORAO DE BACTRIAS. MORFOLOGIA E ASSOCIAO ---------------------------------------------------- 40
P7. QUANTIFICAO DE MICRORGANISMOS----------------------------------------------------------------------------- 43
P8. CADEIA DE TRANSMISSO ----------------------------------------------------------------------------------------------- 47
P9. TESTE DO PAPEL HIGINICO ------------------------------------------------------------------------------------------- 49
P10. CONDIES AMBIENTAIS DE CRESCIMENTO MICROBIANO ------------------------------------------------------- 51
P11. ANTIBITICOS------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55
P12. ANTI-SPTICOS E DESINFECTANTES---------------------------------------------------------------------------------- 57
P13. MICROBIOLOGIA DAS GUAS ------------------------------------------------------------------------------------------- 59
P14. ANLISE MICROBIOLGICA DO LEITE -------------------------------------------------------------------------------- 62
P15. PREPARAO DE UM IOGURTE ---------------------------------------------------------------------------------------- 66
P16. ISOLAMENTO DE RHIZOBIUM. Observao de ndulos e bacteroides --------------------------------------- 68
P17. BACTERIFAGO DE E. COLI -------------------------------------------------------------------------------------------- 77
P18. ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)-------------------------------------------------------------------- 80
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COMPORTAMENTOS EM LABORATRIO DE MICROBIOLO GIA
Os laboratrios de Microbiologia so locais especiais, ambientes por vezes nicos, capazes de
promover a disseminao de agentes causadores de doenas infecciosas nas pessoas que neles
trabalham ou com quem estas contactam.
Qualquer microrganismo, por mais incuo que seja, interage com o meio e com as outras formas
de vida que o envolvem. Porque esta interaco pode ser indesejvel ou mesmo perigosa, h que
observar algumas regras durante as operaes laboratoriais com microrganismo s.
As regras e comportamentos que se determinam pretendem tambm contribuir para evitar a
propagao de contaminaes cruzadas, susceptveis de perturbar o sucesso das experincias
laboratoriais dos prprios e de terceiros.
N VEL DE SEGURANA 1
O nvel do risco associado ao contacto depender do microrganismo propriamente dito, seu tipo,
forma e quantidades, das formas de vida e do tipo de contacto que estabelecido e da durao
desse contacto.
Tendo em conta principalmente a segurana dos operadores, consideram-se geralmente quatro
nveis de segurana biolgica ("Biohazard") dependentes da perigosidade para o homem ou para o
ambiente dos microrganismo s que a so manipulados. Esto tipificados os graus de conteno
requeridos para os diferentes nveis de segurana biolgica.
Nos trabalhos que se desenvolvero no laboratrio durante a execuo das prticas aplicar-se-
um nvel de segurana 1, adequado para ensino e treino para graduao universitria. Este nvel
de segurana biolgica no requer mais que a pele do prprio operador como barreira de
conteno, porque os microrganismo s utilizados no representam risco especial para o homem,
quando manipulados de acordo com boas prticas laboratoriais, nem para o ambiente.
Um microrganismo nor malmente no associado a doenas humanas poder, contudo, ser lesivo
em situaes particulares, como a imunodeficincia ou outras.
Regras
Para alm do risco para o operador, associado manipulao de microrganismo s, as experincias
que se realizaro so c ertamente novidade para alguns dos estudantes, com experincia
laboratorial limitada e rotinas de boas prticas laboratoriais no estabelecidas. Importa, por
isso, prevenir. preciso proteger a sade do prprio experimentador e de terceiros, que tambm
podero ser alvo de prticas menos adequadas. O sucesso das experincias depender do grau de
rigor com que as mesmas forem executadas e dos baixos nveis de contaminaes cruzadas que
for possvel manter.
boa prtica observar, cumprir e fazer cumprir as regras, procedimentos e comportamentos que
se indicam:
Acesso
O acesso ao laboratrio de microbiologia restrito s pessoas qualificadas para o efeito, que
incluem os estudantes / formandos apenas durante os perodos de aulas previstos.
Bata
O uso de uma bata comprida, limpa e devidamente ajustada ao corpo indispensvel sempre
que se opere em laboratrio. A bata protege o operador e o seu vesturio de eventuais
acidentes. Idealmente a bata dever ser usada apenas no laboratrio de microbiologia, sendo
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vestida entrada e despida sada. Desta forma, alm de proteger o experimentador, a bata
minimiza o transporte de microrganismos exteriores para o laboratrio, permitindo a
manuteno de uma baixa carga contaminante e evita a propagao indesejvel no exterior dos
microrganismos manipulados no laboratrio.
Cabelos
Os cabelos compridos devero sempre ser atados e no permitido o uso de peas de vesturio
soltas, como batas desabotoadas, lenos de pescoo ou gravatas soltas. Alm da movimentao
excessiva de ar que provocam, a sua eventual inflamao nos bicos de gs poder ter
consequncias desastrosas.
Mos
entrada e sada do laboratrio preciso lavar bem as mos com abundante gua e sabo,
tambm para minimizar as contaminaes cruzadas. Dependente do tipo de microrganismo a
manipular, o uso de luvas impermeveis, mscaras ou outras proteces, poder ser exigvel.
Mesmo quando normalmente no recomendado, o uso de luvas poder ser necessrio em
situaes de soluo de continuidade na pele das mos do operador.
Comer e beber
expressamente proibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto ou aplicar
cosmticos durante a execuo de experincias laboratoriais. Usar sempre pipetas mecnicas,
nunca pipetar com a boca. aconselhvel adquirir o hbito de manter as mos longe da boca.
Bancada de trabalho
O local de trabalho dever estar sempre devidamente limpo, para o que se impe proceder
desinfeco da bancada antes de iniciados os trabalhos, para no permitir a contaminao das
prprias experincias com microrganismos de sesses anteriores, e depois das manipulaes
terminadas para minimizar a propagao dos microrganismo s com que se operou.
Livros e cadernos
S permitido levar para a bancada o material de apoio estritamente indispensvel execuo
do trabalho, como o protocolo experimental, um bloco de notas ou um caderno e um lpis. Todos
os restantes pertences do operador, como pastas, casacos ou sacos devero ser acondicionados
em local prprio, antes de iniciada a experimentao.
Materiais
Todo o equipamento e material de laboratrio amovvel, utilizado durante a experimentao,
dever ser reposto no local indicado depois de concluda a sua utilizao. Particularmente as
placas e tubos contaminados para rejeitar devero ser desinfectados ou colocados em local
prprio para descontaminao.
Acidentes
Qualquer acidente dever ser de imediato reportado ao responsvel pela sesso de trabalho.
Lquidos ou outro material infectado, inadvertidamente transferidos para fora dos contentores a
que se destinam devero ser de imediato desinfectados com o apoio do responsvel.
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Planeamento
No iniciar qualquer experincia sem o conveniente planeamento. O conhecimento e
compreenso prvios dos procedimentos experimentais, grelhas adequadas para registo dos
resultados e a efectiva disponibilidade de todos os recursos materiais necessrios constituem
elementos importantes para o sucesso das experincias. O tempo "perdido" num planeamento
inicial largamente compensado pelo nvel da aprendizagem conseguido e pela preveno da
necessidade de repetio de experincias eventualmente bloqueadas.
Procedimentos gerais
Todos os procedimentos devero ser efectuados tendo em mente a minimizao da
contaminao do material em uso e a formao de aerossis ou respingos. A manipulao de
microrganismos viveis ou de meios de cultura em placas ou tubos no fechados dever se
efectuada nas proximidades da chama, onde o ambiente menos propcio contaminao com
outros agentes areos. Correntes de ar ou insectos voadores devero ser evitados, quanto
possvel. Tambm no mesmo sentido devero ser evitadas movimentaes ou conversas
desnecessrias durante a execuo dos procedimentos laboratoriais.
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REGISTOS E RELATRIOS
conveniente usar um bloco ou caderno para registo de todas as ocorrncias e dos resultados da
experimentao. Sugere-se o uso de caderno de laboratrio, de preferncia com folhas no
amovveis, por forma a que no sejam eliminadas notas ou registos considerados irrelevantes na
altura, como sucede com frequncia quando se passam os apontamentos "a limpo", mas de
grande utilidade para consulta futura para eventual repetio da experincia. O rigor e
pormenor dos registos efectuados facilitaro a aprendizagem, a interpretao dos resultados
obtidos e a redaco posterior do relatrio do trabalho.
Um qualquer relatrio de uma experincia laboratorial dever documentar de forma to
completa quanto possvel o procedimento executado e os resultados obtidos. Para alm disso
dever ser tambm objectivo do relator redigir um documento compreensvel para o leitor e
susceptvel de apoiar a eventual repetio da mesma experincia em idnticas condies.
Para a elaborao dos relatrios sugerem-se, como orientao, as seguintes seces:
Ttulo - Identificador do contedo do relatrio.
Resumo - Pequeno texto de que constem os objectivos almejados e as concluses obtidas.
Objectivo - Razo de ser do trabalho realizado.
Introduo - Dados conhecidos que justificam a realizao da experincia relatada.
Palavras chave - Termos directamente relacionados com o trabalho.
Material e reagentes - Listagem exaustiva do equipamento, reagentes e outro material usado
Protocolo experimental - Marcha geral dos procedimentos aplicados. Devero ser relatados os
procedimentos concretos executados, com referncia a eventuais desvios relativamente ao
procedimento recomendado / descrito.
Resultados - Registo das observaes efectuadas e dos dados recolhidos.
Discusso - Comentrio crtico aos resultados obtidos.
Concluso - Descrio do cumprimento ou incumprimento do objectivo, decorrente dos
resultados obtidos.
Nota crtica - Comentrio globalidade da experincia, com recomendaes para a sua
repetio.
Bibliografia - Referncias consultadas ou utilizadas para a realizao do trabalho.
Dependente do tipo do trabalho executado e da forma do relatrio, algumas das seces
descritas podero ser fundidas, como "Resultados e discusso" ou "Discusso e concluses", por
exemplo.
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TCNICAS LABORATORIA IS BSICAS EM MICROBIOLOGIA
Os microrganismo s so ubquos. Podem encontrar -se no solo, no ar, na gua, na comida, nos
esgotos e nas superfcies corporais, entre outros locais. Ou seja, existem por todo o lado nossa
volta, o nosso ambiente est repleto de microrganismos. A microbiologia separa estas populaes
mistas em espcies individuais para efeitos do seu estudo. Uma cultura que contenha uma nica
espcie de clulas designada por cultura pura. Para isolar e estudar os microrganismos em
cultura pura, o microbiologista necessita de equipamentos laboratoriais bsicos e da aplicao
de tcnicas especficas usando materiais particulares:
Equipamento Autoclave
Esterilizao
Ansas e agulhas. Pipetas
Transferncia de culturas
Banhos de gua e estufas
Cmaras de cultura
Frigorficos
Materiais Meios de cultura
Caldo nutritivo
Semi-slido
Slido
Agar em rampa
Agar profundo
Placas de agar
Tubos para cultura, Placas de Petri
Tcnicas Espalhamento
Riscado
Incorporao / diluio
M EIOS DE CULTURA
A sobrevivncia e o suporte de vida dos microrganismos depende do fornecimento adequado de
nutrientes e convenientes condies para o seu crescimento. Quanto aos nutrientes, grande
parte dos microrganismos apenas necessitam de substncia solveis de baixo peso molecular,
usualmente originadas pela degradao enzimtica de outros nutrientes mais complexos. Uma
soluo contendo estes nutrientes designada como meio de cultura. Em geral, os meios de
cultura so lquidos, semi-slidos ou slidos. Um meio lquido sem agente solidificante
designado por caldo nutritivo. Um caldo nutritivo suplementado com um agente solidificante,
usualmente o agar, origina um meio slido ou semi-slido. O agar um extracto de algas
marinhas, um carbo-hidrato complexo que contem maioritariamente galactose e possui muito
pouco valor nutritivo. O agar muito adequado como agente solidificante porque se liquefaz a
100C e solidifica a 40C. Devido a estas propriedades, os microrganismos, em especial os
patognicos, podem ser cultivados a temperaturas da ordem dos 37C sem receios de liquefaco
do meio solidificado. Um meio de cultura bem solidificado exige uma concentrao de agar da
ordem dos 1,5 a 1,8%. Uma concentrao inferior a 1% resulta num meio semi-slido. A grande
vantagem e utilidade do meio slido reside no facto da existncia de uma superfcie dura, em
que os microrganismos podem crescer, adequada utilizao de tcnicas especiais para o
isolamento de colnias separadas. Cada colnia formada por um conjunto de clulas
resultantes da multiplicao de uma nica clula e representa o crescimento de uma espcie
microbiana nica. Uma colnia bem definida e isolada constitui uma cultura pura. Alem disso, o
agar quando ainda slido a temperatura elevada, pode ser distribudo por tubos de ensaio que,
depois de arrefecidos e solidificado o meio servem para a cultura em profundidade, para teste
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da produo de gs, ou em meio inclinado para cultura em rampa, para teste de caractersticas
ou preservao de culturas.
Para alm das necessidades nutritivas, vrios outros factores ambientais precisam de ser
controlados para o sucesso da cultura dos microrganismos, como sejam o pH, a temperatura, o
ambiente gasoso ou a presso osmtica.
E STERILIZAO
A esterilizao ponto-chave para o sucesso do trabalho em microbiologia. Para trabalhar em
condies de esterilidade fundamental o uso de material estril e a aplicao de tcnicas
adequadas. A esterilizao processo pelo qual todas as formas de vida so eliminadas de
qualquer meio ou material. As principais tcnicas para a esterilizao de rotina no laboratrio de
microbiologia so as seguintes:
Calor Calor seco (ar quente)

160C a 180C durante hora a 3 horas
Material de vidro em vazio
Calor hmido (vapor)
Circulao de vapor a 100C. Esterilizao intermitente
(solues termo -lbeis)
Autoclave. Vapor sob presso, temperaturas acima dos 100C
(meios de cultura, solues termo -estveis)
Filtrao Membranas filtrantes com poros de 0,05 m a 0.8 m
Remoo de microrganismo s de solues termo-lbeis por
filtrao
Produtos xido de etile no
qumicos Material de plstico
Beta-propiolactona
Tecidos vivos, materiais biolgicos
T UBOS DE CULTURA E PLACAS DE P ETRI

Tubos de ensaio em vidro e placas de Petri em vidro e plstico constituem os principais suportes
para o desenvolvimento das culturas de microrganismos. Um meio nutritivo adequado na forma
de caldo nutritivo ou de agar usado em tubos de ensaio, enquanto nas placas de Petri apenas
se usa meio slido. Um ambiente estril preservado nos tubos de cultura por vrios tipos de
tampas. Historicamente o rolho de algodo hidrfobo, desenvolvido por Schroeder e von
Dusch no sculo dezanove. Hoje em dia, a maior parte dos laboratrios usam tampas em forma
de manga, em metal ou plstico resistente ao calor. A vantagem destas tampas reside no facto
de no exigirem tanto trabalho na sua preparao e serem mais facilmente removidas e
reintroduzidas nos tubos.
As placas de Petri disponibilizam uma maior superfcie para cultura e crescimento dos
microrganismos. So compostas por uma base circular inferior, onde colocado o meio e por
uma tampa do mesmo formato e ligeiramente maior que se encaixa na base. Existem placas de
Petri de vrias dimenses para diferentes exigncias laboratoriais. Na rotina so usadas placas de
aproximadamente 15 cm de dimetro. O meio nutritivo estril, contendo agar, num volume de
15 a 20 ml vertido nas placas quando ainda quente aps fuso do agar e deixado arrefecer a
temperatura inferior a 40C. Depois de inoculadas com os microrganismos as placas so
incubadas em posio invertida para evitar que as gotas de condensao, formadas na tampa
durante o arrefecimento do agar, caiam sobre a superfcie do agar.
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INSTRUMENTOS PARA TRANSFERNCIA DE CULTUR AS
Existe a necessidade de transferir os microrganismos de um meio de cultura para outros, desde
culturas de armazenamento e manuteno para culturas de anlise, para o isolamento de
culturas puras ou para a expanso da massa de microrganismos. o processo de subcultura que
tem de necessariamente ser efectuado com tcnica estril para e vitar potenciais contaminaes
das subculturas.
As ansas e agulhas, usualmente fabricadas com metais inertes como a platina e inseridas em
cabos prprios para a manipulao, so instrumentos muito durveis de fcil utilizao. So
facilmente esterilizveis no momento da sua utilizao por incinerao chama, numa posio
quase vertical at o metal ficar ao rubro. Importar depois deixar arrefecer entre 10 a 20
segundos, fora da chama, mas na sua proximidade, onde a carga de microrganismo s ambientais
viveis inferior. Depois de arrefecidos, para no inactivar os microrganismo s a transferir,
podem ser usadas para "picar" uma cultura slida ou lquida e inocular outro meio. Uma vez
esterilizada, a ansa dever ser de imediato utilizada antes de ser de novo colocada na bancada.
As pipetas so outros dos instrumentos de transferncia de culturas de uso muito generalizado.
So calibradas e permitem a transferncia de quantidades de culturas lquidas preestabelecidas.
So de vidro ou plstico, com uma extremidade afilada e outra para a aspirao e expulso do
lquido que contenham. Podem ser esterilizadas por calor seco ou hmido, conforme o tipo de
material de que so constitudas. Apesar de tradicionalmente serem instrumentos para "pipetar
boca" proibido usar a boca para aspirar microrganismos. Existem auxiliares mecnicos
disponveis para o efeito, como peras de borracha ou corpos de seringa que se adaptam na
extremidade larga da pipeta.
C MARAS DE CULTURA
Das condies para crescimento dos microrganismos, uma das mais relevantes a sua
temperatura ptima de crescimento. As estufas so usadas para a manuteno da temperatura
ptima dos microrganismo s em crescimento durante o perodo de cultura. So cmaras em que a
temperatura ambiente interior controlada por termstato, para que a mesma seja mantida
dentro de limites apropriados para o crescimento celular. Usam em geral um sistema de
circulao de ar aquecido e, para evitar a desidratao dos meios em incubao, devero conter
tambm uma fonte de vapor de gua (um copo com gua no seu interior, por exemplo).
Os banhos de gua (banho -maria) com gua a temperatura controlada por termstato constituem
outro dos instrumentos frequentemente empregues para a criao das condies de temperatura
ptima de crescimento dos microrganismo s. O ntimo contacto da gua a temperatura controlada
com o recipiente onde crescem os microrganismo s apresenta a vantagem de permitir uma mais
rpida e eficaz transferncia do calor. Alm disso, os banhos com agitao facilitam tambm o
arejamento das culturas, de grande importncia para o crescimento dos microrganismo s
aerbios. A desvantagem do banho de gua reside no facto de s poder ser usado para as culturas
em meio lquido, ao contrrio das estufas de ar, que servem tanto para culturas em meio lquido
como em meio slido.
F RIGORFICO
O frigorfico outra das peas fundamentais em laboratrio de microbiologia. O ambiente de
baixa temperatura que disponibiliza da maior relevncia para a manuteno e armazenamento
das culturas em fase de no crescimento entre os perodos de subcultura, e para a conservao
dos meios esterilizados e outros reagentes. Tambm as solues e compostos termo-lbeis tm
perodos de conservao mais alargados quando armazenados a baixas temperaturas.
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MTOD OS DE ESTERILIZAO
Esterilizao um processo que elimina todos os organismos vivos que se encontrem superfcie
ou no interior de um material, podendo ser alcanado pela exposio do material a agentes
letais fsicos ou qumicos ou, no caso dos lquidos, pela separao mecnica dos organismos
atravs de filtraes. Existem muitas formas de esterilizar materiais e meios, e a sua escolha
depende da natureza dos materiais a serem esterilizados bem como da disponibilidade de meios
de trabalho.
A noo de esterilidade (estril = infecundo) encontra-se frequentemente associada a duas
outras: a de assepsia (ausncia de sepsis = putrefaco) e a de desinfeco (livrar da infeco).
Estes significados literais correspondem, de facto, s noes tcnicas destas terminologias. Em
microbiologia referimo -nos a esterilizao quando se pretende impedir a propagao de
microrganismos; a assepsia quando se pretende trabalhar em ambiente desprovido de
microrganismos e a desinfeco quando se aplicam tcnicas destinadas a eliminar
microrganismos potencialmente patognicos para o operador.
Destas noes, a adquirir no exerccio da experimentao que se desenvolver na disciplina,
importa considerar em particular as tcnicas que se utilizam em microbiologia para a eliminao
de microrganismo s viveis: a esterilizao.
E STERILIZAO PELO CALOR
A. Calor Hmido
O aparelho mais usado para esterilizar materiais e meios de cultura a autoclave. As autoclaves
trabalham semelhana de panelas de presso domsticas. As autoclaves de laboratrio operam
normalmente sob uma presso de 1,02 Bar a uma temperatura de 121C. A autoclave esteriliza a
maioria dos materiais em 15-30 minutos, sendo a variao do tempo de esterilizao devida
relao superfcie/volume dos materiais a serem esterilizados.
Aspectos da esterilizao por vapor-presso
Temperatura
Os endoesporos das bactrias so as formas de vida mais resistentes ao calor, e a sua destruio
pode ser conseguida se for aplicado vapor sobre presso. Uma temperatura de 121C oferece
uma boa margem de segurana se for mantida durante um espao de tempo apropriado.
Humidade
A coagulao do protoplasma bacteriano em temperaturas moderadas requer humidade e h

medida que esta removida a temperatura necessria para haver coagulao aumenta
rapidamente. Se o vapor for sobreaquecido ficar mais "seco" o que ocasiona um aumento da
temperatura e do tempo de exposio para a esterilizao, que na situao extrema de
esterilizao em calor seco ser de 170C durante uma hora. Em concluso, vapor
excessivamente quente perde alguma da sua eficcia como agente letal para alm de poder ser
lesivo para os materiais a serem tratados.
Presso
A presso, nos valores usados na autoclave, por si s no exerce qualquer efeito na esterilizao,
sendo til para elevar a temperatura do vapor acima dos 100C.
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Tempo
O tempo necessrio para que o vapor penetre e aquea os materiais a serem esterilizados.
Mesmo quando as temperaturas de esterilizao so atingidas, os esporos ( e as clulas
vegetativas) no so todo s mortos de uma vez. A velocidade de morte uma constante a uma
dada temperatura e por cada unidade de tempo de exposio ao agente letal, uma proporo
constante de uma dada populao morta. Normalmente demora 11 a 12 minutos a 121C (calor
hmido) par a matar os endoesporos das bactrias termoflicas.
Purga
O ar relativamente frio na cmara de esterilizao muito mais pesado que o vapor

temperatura de esterilizao. Se no for permitida a sada do ar cria-se uma estratificao na
autoclave que condu z a uma falta de uniformizao das temperaturas desenvolvidas. Uma vez
que o ar e o vapor so lentos a misturarem-se, as diferenas de temperatura entre camadas pode
ser muito grande, por isso a necessidade de se substituir todo o ar por vapor (purga).
N atureza do carregamento
Geralmente, os materiais mais volumosos requerem um maior tempo de esterilizao, sendo

prefervel esterilizar pequenos volumes de cada vez, por exemplo prefervel esterilizar 5
bales de litro de cada vez do que esterilizar apenas um balo com cinco litros. Os frascos
devem ser tapados com algodo ou papel. Se for necessrio usar rolhas roscadas, devem ir pouco
apertadas para a autoclave de modo a permitirem a sada de ar e entrada de vapor, evitando-se
assim o rebentamento de frascos na autoclave.
Procedimento para operao da autoclave

Verificar as tampas dos frascos (no apertadas, para permitir a troca de gases com o exterior).
Introduzir na autoclave o material a esterilizar.
Fechar a autoclave e apertar a tampa seguindo os cuidados adequados recomendados.
Abrir a torneira de sada de vapor para permitir a purga do ar no interior.
Ligar a corrente elctrica e colocar o termstato para a posio mxima.
Aguardar que a corrente de vapor que sai pela torneira seja bastante intensa. (Completa
substituio do ar no interior por vapor de gua)
Fechar a torneira de sada do vapor.
Aguardar que o termmetro atinja a temperatura de esterilizao desejada (121C), ou que o
indicador de presso marque 1,02 Bar.
Reduzir a potncia do termstato de modo a manter constante a temperatura.
Atingida a temperatura de esterilizao, iniciar a contagem do tempo (por exemplo 20
minutos).
Desligar a autoclave.
Aguardar at o indicador de presso indicar 0.
Abrir a torneira de purga (pode ainda haver presso e o ar estar muito quente).
Abrir a autoclave. Remover os materiais esterilizados,
(ATENO: os materiais esterilizados podem estar muito quentes)
Depois do arrefecimento conveniente fechar os frascos mal roscados
B. Calor seco
O calor seco usado para esterilizar material de vidro, outros materiais slidos termoestveis e
alguns componentes de meios ou alimentos que ficariam imprprios se expostos ao vapor. Trata-
se tambm de um dos mtodos de esterilizao mais usados e de muito fcil aplicao. O
equipamento indispensvel apenas uma estufa de alta temperatura (160 - 200C). Para alm de
ter de ser tida em conta a resistncia trmica dos materiais a esterilizar por esta tcnica, a
11
outra precauo a considerar prende -se com a minimizao da possibilidade de contaminar esses
materiais depois da esterilizao.
E STERILIZAO POR GASES

O recente incremento do uso de material de plstico de utilizao nica ("disposable") como
seringas, caixas de Petri, tubos de cultura, filtros, etc., levou ao desenvo lvimento de uma nova
forma de esterilizao que usa gases txicos para a eliminao dos microrganismo s de materiais
termo-sensveis. A aplicao desta tcnica requer a utilizao de equipamentos prprios que
forcem a circulao do gs txico atravs de todas as superfcies dos materiais, o que a torna de
difcil utilizao em laboratrios de tipo no industrial.
O xido de etileno o gs usado com maior frequncia neste tipo de esterilizaes. Este gs, ao
contrrio de muitos produtos qumicos txicos, pouco corrosivo e no altera os materiais a
serem esterilizados, sendo facilmente removido por arejamento. As suas desvantagens incluem a
necessidade de longos perodos de exposio para se obter a esterilizao (vrias horas), a
reactividade com componentes dos meios e certos tipos de plsticos e a necessidade de
equipamentos prprios e disponibilidade do gs, como se referiu.
R ADIAES
Alguns processos comerciais usam as radiaes para a esterilizao a frio de certos materiais
como produtos farmacuticos, por exemplo. A irradiao o uso de radiaes ionizantes de alta
energia que incluem raios gama produzidos a partir de cobalto-60 ou csio -139 e de raios
catdicos produzidos em geradores e aceleradores de electres.
A irradiao com luz ultravioleta no uma forma muito satisfatria de esterilizao dada a sua
fraca capacidade de penetrao nos materiais e produtos a esterilizar. , contudo, de utilizao
frequente na diminuio do nvel de contaminao de espaos confinados, como salas estreis ou
pequ enos ambientes.
FILTRAO ESTRIL
O principal mtodo para a esterilizao de lquidos que contenham componentes termo -sensveis
tais como vitaminas, protenas sricas e antibiticos, por exemplo, a filtrao.
Tradicionalmente os microbiologistas esterilizavam estes produtos recorrendo a filtros feitos a
partir de terra de diatomceas e fibras de asbesto, previamente esterilizados em autoclave.
Presentemente estes filtros foram substitudos por filtros de acetato de celulose ou
policarbonatos nos quais os tipos de poros desenvolvidos permitem filtraes com elevados graus
de preciso. Existem actualmente disponveis no mercado filtros esterilizantes de vrios poros e
capacidades filtrantes. Os mais frequentes e, por isso, mais acessveis so filtros de poros de
0,45 m ou 0,2 m de dimetro, que retm os microrganismos presentes nas solues.
Para esterilizar uma soluo por filtrao, no h mais que passar essa soluo atravs de um
destes filtros pela aplicao de uma presso positiva no lquido a filtrar (filtros de seringa, por
exemplo) ou na rarefaco do ar no contentor que recebe o filtrado. Em qualquer dos casos esta
tcnica requer a recolha do filtrado em condies de assepsia para impedir a contaminao do
lquido esterilizado.
12
O MICROSCPIO
A Microbiologia , por definio, uma cincia que estuda os organismos vivos demasiado
pequenos para poderem ser vistos a olho nu. Necessrio ser, por isso, usar microscpios para
poder observar os microrganismos. Se bem que existam vrios tipos de microscpios, todos eles
so basicamente constitudos por dois sistemas de lentes, uma fonte de luz e mecanismos
mecnicos de ajuste das distncias focais.
C OMPONENTES PRINCIPAI S DO MICROSCPIO
Platina
A platina do microscpio uma
plataforma com uma abertura central para
permitir a passagem da luz, abaixo dos
sistemas de lentes. Esta plataforma
constitui a superfcie de suporte para
colocao das amostras. Em geral as
amostras de microrganismos so colocadas
em lminas de vidro transparente sobre a
abertura central da platina. A maior parte
dos microscpios tm tambm
mecanismos mecnicos que permitem a
movimentao das lminas na horizontal
para posicionamento da amostra.
Fonte luminosa
A fonte de luz encontra-se por baixo da amostra. A iluminao pode ser exterior ao microscpio,
natural ou artificial, conduzida para a amostra por espelhos que a concentram ou ser
proveniente de uma fonte prpria directamente dirigida por lentes.
Condensador
Este componente encontra-se imediatamente abaixo da platina e constitudo por lentes que
permitem a concentrao da luz nos sistemas das lentes de amplificao, depois de passar pela
amostra a ser observada. Usualmente tem tambm acoplado um diafragma para regulao do
nvel de luminosidade adequado observao.
Lentes
O corpo do microscpio constitudo por um tubo onde esto alojados os dois sistemas de lentes
para ampliao. No cimo do tubo existem as oculares, por onde se observa, e no extremidade
inferior as objectivas que recolhem a luz proveniente da fonte de iluminao depois de passar
pela amostra. Um sistema mecnico permite aproximar e afastar a objectiva do objecto de
acordo com a ampliao a usar e para focagem.
13
P RINCPIOS TERICOS
Para a utilizao eficiente do microscpio convir compreender os princpios bsicos do
microscpio, que a seguir se indicam.
Ampliao
A capacidade de ampliao depende dos conjuntos de lentes instaladas no tubo do microscpio:
a ocular e a objectiva. A objectiva, na parte inferior do tubo, produz uma imagem real
projectada no plano fo cal, imagem essa depois ampliada pela ocular para a produo da imagem
final observvel. Os microscpios mais frequentes so equipados com um tambor que contem
vrias objectivas com diferentes capacidades de ampliao. A ampliao total da amostra resulta
do produto da capacidade de ampliao da objectiva pela capacidade de ampliao da ocular:
Ampliao Ampliao final

(Objectiva X
(Objectiva) (Ocular)
ocular)
4X 10 X 40 X
10 X 10 X 100 X
45 X 10 X 450 X
100 X 10 X 1000 X
Resoluo
Apesar da ampliao ser importante, deve notar-se que no ilimitada pelo simples aumento da
capacidade de ampliao das lentes oculares e objectivas. A capacidade de ampliao das lentes
est limitada pelo seu poder de resoluo. O poder de resoluo definido pela capacidade da
lente em permitir a identificao de dois objectos adjacentes como entidades discretas. Quando
a discriminao deixa de ser possvel, isto , quando dois objectos se confundem num s, a lente
perdeu a sua capacidade de resoluo. Maiores ampliaes no corrigem esta perda, apenas
permitem a observao de imagens dos objectos cada vez mais difusas. O poder de resoluo de
uma lente depende do comprimento de onda da luz, da abertura numrica, caracterstica de
cada lente e dependente do seu dimetro e da relao deste com a distncia focal e do ndice de
refraco do material da lente.
Iluminao
Para uma boa observao necessrio que a quantidade de luz seja apropriada ampliao. A
iluminao regulada pelo condensador e pelo diafragma que permitem uma concentrao da
luz na amostra em quantidades apropriadas. Demasiada luz obscurece o objecto, por falta de
contraste e luz insuficiente no permite a observao. A intensidade da luz para a observao
depende tambm do tipo de amostra a ob servar, do nvel da sua transparncia e/ou
concentrao.
14
Com regra, quando a ampliao das lentes aumenta, diminui a distncia de trabalho (entre a
objectiva e o objecto) e aumenta a abertura numrica (exige mais luz). As relaes prticas
aproximadas entre as distncias de trabalho e as objectivas so:
Objectiva Distncia de trabalho Objectiva Distncia de trabalho

4X 9 - 10 mm 45 X 0,5 - 0,7 mm
10 X 5 - 8 mm 100 X 0,13 - 0,18 mm
O BSERVAO AO M ICROSCPIO
Os passos que se indicam devero ser cumpr idos para uma correcta e eficiente utilizao do
microscpio.
Afastar a objectiva da platina
Colocar a lmina na platina de forma a centrar o objecto da observao
Rodar o tambor das objectivas posicionando a de menor ampliao
Aproximar a objectiva da lmina a uma distncia inferior prevista (ver tabela acima). Nunca
movimentar o tubo observando pela ocular.
Afastar a objectiva da lmina, observando pela ocular, at obteno de uma imagem ntida
Regular a intensidade luminosa e focagem usando o diafragma (ou regulador da fonte de
iluminao) e o condensador
Centrar no campo visual o microrganismo a observar
Muitos microscpios uma vez focados com a objectiva de menor ampliao ficam focados para as
restantes
Rodar o tambor das objectivas para a ampliao pretendida (a observao com objectiva de 100
requer o uso de leo de imerso entre a lente e a lmina)
Acertar a focagem com o parafuso micromtrico
Observar e registar observao, movimentando a lmina na horizontal, se necessrio
Remover a amostra. Limpar a platina e a lente. Posicionar a objectiva de menor ampliao.
Descer o tubo ocular.
15
MORFOLOGIA DAS BACTRIAS
A morfologia dos microrganismo s s pode ser observada ao microscpio. Mas devido ao seu
reduzido tamanho e ao seu ndice de refraco, muito prximo do ndice de refraco da gua,
no fcil a observao microscpica de microrganismos em geral e de bactrias em particular.
Sendo tambm, em geral, no pigmentadas, a observao microscpica s se torna acessvel
aumentando o contraste entre o meio envolvente e o contedo celular. Para permitir o estudo
das propriedades das bactrias e classific-las em grupos para efeitos de diagnstico, vrias
coloraes biolgicas e procedimentos especficos foram desenvolvidos.
C ORANTES
Quimicamente um corante pode ser definido como um composto orgnico que contem um ncleo
benznico ligado a um cromforo e a um grupo auxocrmico:
Benzeno Solvente orgnico incolor

+ Cromognio:
Cromforo Grupo qumico que introduz c or no anel Composto corado (no corante)
Corante
+ benznico
Grupo qumico ligado ao cromognio e que
Auxocromo
pode ligar-se s estruturas celulares
Um dos corantes frequentemente usados para contrastar o meio citoplasmtico de bactrias e
clulas o azul-de-metileno . Quando em soluo ioniza-se, originando um cromognio
positivamente carregado, e reage reversivelmente com os componentes celulares de carga
negativa. A imagem documenta as trs partes constituintes do corante: ncleos benznicos,
Cromforo (anis aromticos com duplas ligaes) e o auxocromo (io cloreto):
Quanto s suas caractersticas inicas, os corantes podem ser bsicos ou catinicos (como o azul
de metileno) e cidos ou aninicos que se ionizam em cromognios de carga negativa e se ligam
s estruturas celulares de cargas positivas.
As tcnicas de colorao podem subdividir-se em tcnicas simples para visualizao directa da
morfologia, como exemplo o azul-d e-metileno, ou diferenciais, que possibilitam a
discriminao entre tipos morfolgicos diferentes de bactrias ou determinadas estruturas
subcelulares.
Tipos de Colorao do meio envolvente das Nigrosina

Colorao negativa
coloraes bactrias Tinta da china
(Morfologia - cocos, bacilos, etc. - e cidos
Colorao simples associaes entre bactrias - pares, Bsicos
cadeias, cachos, etc.) Indiferenciados
Colorao diferencial Gram
Separao entre grupos
cido-resistente
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Flagelos
Cpsulas
Visualizao de estruturas
Esporos
Ncleos
Colorao de Gram
A colorao de Gram, desenvolvida em 1884, a colorao diferencial mais utilizada em
microbiologia e permite classificar as bactrias em dois grupos: as Gram negativas e as Gram
positivas.
Parede rgida Parede externa

Peptidoglicano + +
Acido Teicoico +
Polisacridos +
Protena +
Lipopo lisac ridos +
Lipoprotena + ou +
cido resistentes nunca so podem ser
Sensibilidade a:
Sulfamidas pouco sensveis muito sensveis
Penicilina pouco sensveis muito sensveis
Azida de sdio pouco resistentes resistentes
O processo da colorao baseia-se na capacidade que certos microrganismos possuem em reter a

colorao do cristal violeta por descolorao com lcool, so as Gram positivas. As que se
deixam descorar, as Gram negativas, so depois contrastadas com um corante de cor diferente.
A capacidade de reter a colorao inicial, nas condies do procedimento, devida diferente
estrutura da parede celular (ver imagem e tabela de caractersticas). Em particular as vrias
camadas do peptidoglicano existente nas bactrias Gram positivas so responsveis por impedir a
remoo dos complexos, que se formam entre o cristal violeta e o mordente (substncia que
aumenta a afinidade entre a clula e o corante), no passo da lavagem com lcool.
Basicamente a colorao de Gram consta de uma exposio inicial da bactria ao cristal violeta,
aps o que adicionada uma soluo de iodo. O iodo penetra com facilidade na clula e forma
complexos insolveis com o cristal violeta. A adio do lcool no passo seguinte permite a
eliminao dos complexos por pas sagem atravs da fina camada de peptidoglicano das Gram
negativas, mas insuficiente para os fazer passar atravs da grossa camada das gram positivas.
Depois da lavagem com o lcool, as Gram negativas, que ficaram descoradas, so contrastadas
com um segundo corante, de cor diferente e menos intenso que o primeiro. O passo crtico a
remoo dos complexos do cristal violeta - iodo pelo lcool. Um tratamento excessivo pode
descorar as bactrias Gram positivas e um tratamento insuficiente no remover a cor violeta
das bactrias gram negativas.
17
MEIOS DE CULTURA
T IPOS DE MEIO
Existem vrios tipos de meios em que as bactrias podem crescer. Os meios podem ser definidos
ou complexos.
Nos meios quimicamente definidos, quantidades determinadas de reagentes qumicos puros so
misturados para a preparao do meio de cultura. Contm, em geral, sais inorgnicos que
incluem fontes de carbono e de azoto. Outros componentes indispensveis ao crescimento
bacteriano so necessrios em to pequenas quantidades que as pequenas contaminaes dos
reagentes qumicos usados na preparao do meio so suficientes.
Meios complexos, que contm todos os ingredientes necessrios ao crescimento do
microrganismo, so compostos por misturas de protenas e outros extractos de origem biolgica,
em que as quantidades precisas de cada aminocido ou glcido, por exemplo, no so
conhecidas. Alguns dos componentes dos meios complexos so resultantes de digestes
preliminares de produtos biolgicos. Estas digestes permitem uma melhor acessibilidade do
microrganismo aos materiais plsticos de que necessita. Peptonas e triptonas, hidrolizados
enzimticos de protena animal e de levedura, respectivamente, so dois frequentes
constituintes dos meios complexos.
Um exemplo de cada um destes dois tipos de meio:
Meio definido Meio complexo

NaNO 2 0.1 g/l Triptona 5,0 g/l
K2HPO 4 0.5 g/l Extracto de levedura 2,5 g/l
CaCO 3 5.0 g/l Glucose 1,0 g/l
MgSO 4 . 7 H2O 0.2 g/l Agar 15,0g/l
FeSO 4 . 7 H 2O 0.005 g/l
NaCl 0.5 g/l
Para alm de definidos ou complexos, os meios de cultura poderem tambm ser classificados de
outras forma, Nomeadamente:
Meios Enriquecidos - Quando contm tambm alguns importantes factores de crescimento como
vitaminas, aminocidos ou componentes do sangue. So meios necessr ios para fazer crescer
microrganismos mais exigentes;
Meios Selectivos - A utilizao deste tipo de meios permite a seleco de um microrganismo
particular de entre uma populao em que os restantes microrganismo s presentes no
conseguem crescer. Os aditivos para tornar estes meios selectivos so os antibiticos ou outros
compostos txicos;
Meios Diferenciais - Como o nome indica, este tipo de meio permite a separao de
microrganismos de diferentes caractersticas, como a colorao das colnias ou da regio
envolvente do meio de cultura.
Meios Salinos Mnimos - So meios quimicamente definidos que contm apenas os sais inorgnicos
indispensveis ao crescimento bacteriano (o exemplo de meio definido atrs um meio salino
mnimo). Uma determinada fonte de carbono pode ser adicionada, dependendo do tipo de
microrganismo a fazer crescer no meio.
18
Alguns meios podem ser considerados, em simultneo, englobados em mais de uma das
categorias indicadas. Um agar salino de manitol, por exemplo, um meio complexo, dife rencial
e selectivo.
P REPARAO
A preparao prtica de um meio de cultura relativamente simples e pode ser conseguida com
sucesso se as regras seguintes forem devidamente aplicadas:
Usar sempre material de vidro bem lavado e enxaguado com gua destilad a, para evitar
contaminaes com detergentes ou outros qumicos;
Usar sempre esptulas limpas na pesagem dos componentes;
Os rtulos dos meios desidratados contem instrues para a sua preparao e referncia s
quantidades de gua para a sua dissoluo;
O s componentes devem ser pesados individualmente para receptculos individuais. Nunca
devolver ao frasco original quaisquer quantidades do componente removidas em excesso;
prefervel adicionar os componentes a gua previamente colocada no vaso para a dissoluo. O
contrrio pode originar a formao de agregados colados ao fundo do frasco de difcil dissoluo;
Se o meio contem muitos componentes prefervel dissolv-los individualmente antes de
efectuar a mistura. A adio de agar dever ocorrer no fim da preparao e s depois dos
restantes componentes j se encontrarem dissolvidos;
No preparar nenhum meio se no for possvel esteriliz-lo de imediato;
Nunca autoclavar um meio em frasco que esteja a mais de meio. As rolhas ou tampas no
devero estar apertadas durante a autoclavagem.
19
CONTAGENS DE MICRORGANISMOS
Os estudos em microbiologia obrigam com frequncia determinao do nmero de
microrganismos num determinado volume, para caracterizao da populao presente numa
certa amostra, ou para avaliao do crescimento do microrganismo em considerao. Vrios
mtodos podem ser usados para o efeito, dependendo do tipo de microrganismo , dos recursos
laboratoriais disponveis e do objectivo do estudo, nomeadamente:
MTODOS DIRECTOS
Cmaras de contagem microscpica (manual)
Turbidimetria
"Coulter counter" (electrnica)
Peso seco ou pasta mole
MTODOS QUMICOS
Avaliao de DNA / protenas
Parmetros metablicos
(consumo Oxignio, produo de dixido de carbono)
CONTAGEM DE VIVEIS
Incorporao de diluio em agar
Diluio limite
Filtrao estril e cultura de filtrado
A VALIAO DIRECTA
O mtodo por ventura mais simples e rpido executado por diluio da amostra e contagem
directa dos microrganismo s ao microscpio.
Dada uma populao de microrganismo s a quantificar, h que dilui-la de forma apropriada e
contar o nmero total de microrganismos num determinado volume da diluio. Existem lminas
de microscpio que contm cmaras de contagem de volumes conhecidos. Estas cmaras
permitem a determinao da conc entrao de microrganismos na amostra de partida por
clculos efectuados a partir do nmero de microrganismos observados na superfcie delimitada.
Sendo um processo prtico, no , contudo, aplicvel a fungos ou bolores, por exemplo, onde
difcil identificar clulas individuais ao microscpio. Para estas situaes, outras medidas
indirectas so aplicveis. A pesagem da matria seca (aps eliminao do meio de cultura ou
solvente) constitui um indicador da massa presente na amostra, por exemplo.
A avaliao da capacidade de uma suspenso de microrganismo s em dispersar e absorver a luz
incidente , dentro de certos limites, proporcional concentrao da matria insolvel em
suspenso. Utilizando espectrofotmetros apropriados possvel construir curvas de absoro, de
disperso ou reflexo da luz em funo da concentrao de determinado microrganismo em
suspenso. Dada uma amostra problema, o seu comportamento face a um raio de luz incidente
permite posicionar o resultado observado na curva padro e assim determinar a sua
concentrao relativa.
Quaisquer destes mtodos permitem determinar o nmero de microrganismos numa unidade de
volume da amostra em estudo, mas no fornece indicaes sobre as concentraes de
microrganismos viveis ou cultivveis.
20
C ONTAGEM DE VIVEIS
Os mtodos de contagem aps crescimento permitem a avaliao das populaes de
microrganismos viveis e baseiam-se na capacidade de desenvolvimento de uma cultura (ou
colnia), a partir de uma nica clula. A partir da amostra em estudo procede-se a diluies
sucessivas, inoculao de meios de cultura apropriados e avaliao do nmero de microrganismos
cultivveis.
Quando se pretende determinar o nmero de microrganismo s presentes em amostras de leite ou
gua, por exemplo, usa-se a chamada tcnica de contagem em placa. Estas contagens so
efectuadas por incorporao de um volume conhecido da amostra (frequentemente diluda), em
agar nutritivo adequado e conveniente incubao. Da mesma forma o espalhamento uniforme de
um volume conhecido da amostra na superfcie de um agar slido origina a formao de colnias
discretas, cada uma delas proveniente de um microrganismo que se posicionou nesse local. A
concentrao de microrganismos presentes na amostra inicial calculada a partir do nmero
total de colnias que se desenvolveu na placa, das diluies efectuadas e do volume de diluio
incorporado ou espalhado sobre o agar.
Quando a concentrao de microrganismo s na amostra em estudo baixa as contagens de
microrganismos so efectuadas aps conveniente concentrao da amostra. Para o efeito regra
proceder-se filtrao de um volume conhecido da amostra por filtros esterilizantes (que retm
as bactrias presentes) e inoculao do filtro sobre superfcie de agar nutritivo. Nos locais do
filtro em que foram retidas bactrias haver o desenvolvimento de uma colnia e o nmero total
de colnias corresponder ao nmero de bactrias cultivveis presentes no volume de amostra
filtrado.
As contagens podem tambm ser efectuadas por crescimento microbiolgico em meio lquido.
Para tanto h que proceder a mltiplas diluies sequenciais da amostra em estudo, at para
alm da probabilidade de existncia de um s microrganismo no volume de diluio a inocular no
meio de cultura. Aps conveniente incubao de todos os meios inoculados, observar -se- o
crescimento at uma certa diluio e ausncia de crescimento nas maiores diluies
subsequentes. Tendo em conta a primeira diluio em que se no observa crescimento e a ltima
em que ainda existe esse crescimento (correspondente inoculao de, pelo menos, uma
bactria), o nmero de rplicas efectuadas e as diluies sequenciais, determina-se o nmero
mais provvel de microrganismos presentes na amostra inicial, de acordo com procedimentos
estandardizados e tabelas estatsticas apropriadas.
21
ISOLAMENTO DE COLNIAS EM MEIO SLIDO
SEMENTEIRA POR ESPALHAMENTO

Se aplicarmos uma algota de cultura bacteriana lquida ou suspenso de bactrias sobre a
superfcie de um meio com agar numa caixa de Petri, e se a espalharmos uniformemente com
uma vareta de vidro dobrada (semeador de vidro) ou com o auxlio de pequenas esferas de vidro
esterilizadas, de tal maneira que as clulas bacterianas presentes fiquem uniformemente
afastadas umas das outras, aps incubao obteremos colnias individualizadas.
Para o sucesso no isolamento de colnias pela tcnica do espalhamento necessrio que o

nmero de bactrias viveis presentes seja discreto e no muito elevado. Para uma placa de
Petri de 10 cm de dimetro adequado utilizar um nmero de bactrias da ordem da centena.
Se o nmero de bactrias total da suspenso a usar no conhecido, devero efectuar -se
diluies prvias do incuo.
SEMENTEIRA POR RISCADO

A tcnica conhecida como riscado das mais frequentemente empregues em microbiologia para
o isolamento de colnias, dada a facilidade da sua execuo.
Existem vrias tcnicas de riscado, todas elas dando excelentes resultados se executadas
correctamente. O objectivo do riscado o de produzir colnias bem separadas umas das outras a
22
partir de uma suspenso de clulas concentrada. As clulas ficam muito juntas no incio do
riscado, dando colnias confluentes, mas medida que o riscado continua cada vez menos
clulas permanecem na ansa ocasionando a que se depositem cada vez mais afastadas umas das
outras no meio de cultura, formando colnias cada vez mais separadas (Ver Figura). Uma boa
placa de riscado resulta de vrios movimentos contnuos ou descontnuos (com esterilizao
chama e arrefecimento) da ansa ou semeador ao longo da placa.
Antes de executar os seus riscados em placa atente na demonstrao feita, dando especial
ateno esterilizao da ansa entre cada srie de riscos, bem como ao seu arrefecimento
subsequente (para no inactivar as clulas a que vai tocar a seguir ).
Procedimento geral
Utilize placas de Petri com LB/agar/amp. Com a ansa de inoculao, risque cuidadosamente uma
cultura mista sobre as placas utilizando uma das tcnicas ilustradas na figura. Preste ateno
fora com que aplica a ansa na superfcie do agar, de forma a no a rasgar.
Coloque as placas, em posio invertida, na estufa de incubao a 37C. No esquecer de
identificar convenientemente as placas com o seu nome, data e contedo.
Aps incubao, estude o crescimento bacteriano das nas placas. Observe as diferenas em
termos de forma, tamanho e aparncia das colnias formadas. Avalie se a tcnica de riscado foi
aplicada correctamente para o isolamento de colnias.
23
CONDIES AMBIENTAIS DE CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS
Para alm dos nutrientes para a sntese dos seus componentes vitais e da energia qumica
necessria ao seu metabolismo, outras condies ambientais so necessrias para um adequado
crescimento microbiano no laboratrio. Entre os parmetros a controlar merecem especial
destaque as concentraes relativas de oxignio, os valores do pH no meio e a temperatura para
o seu crescimento.
O XIGNIO
Entre os microrganismos existe uma grande variao quanto s suas necessidades em oxignio.
Os aerbios estritos (ou obrigatrios) crescem apenas na presena de oxignio. Encontram-se
normalmente superfcie de plantas, nas camadas superficiais do solo e em suspenso nas
poeiras. Estes organismos possuem apenas metabolismo respiratrio e usam o oxignio como
nico aceitador final na sua cadeia transportadora de electres.
Os anaerbios estritos (ou obrigatrios) no necessitam de oxignio para o seu crescimento, o
oxignio de facto txico para este tipo de microrganismos. Encontram-se geralmente em zonas
pantanosas, no estmago dos ruminantes, no interior do intestino humano e de outros animais
no ruminantes ou alojados nos tecidos de feridas profundas, o metabolismo deste tipo de
microrganismos normalmente fermentativo.
Os microrganismos com metabolismo fermentativo, e que portanto no usam o xignio no seu
metabolismo, mas que a sua presena no tem efeitos txicos designam-se por anaerbios
aerotolerantes.
Para alm destes podem ainda considerar -se outros grupos de microrganismos atendendo s suas
necessidades em oxignio, assim tem-se ainda os microaeroflicos que requerem oxignio livre
para o seu crescimento mas numa concentrao muito baixa (2 a 10%).
A maioria dos microrganismos conhecidos encontra-se algures entre os dois extremos dos
aerbios estritos e dos anaerbios aerotolerantes. So os anaerbios facultativos que crescem
tanto na presena como na ausncia de oxignio. Estes organismos respiram quando dispem de
oxignio e fazem metabolismo fermentativo quando este se esgota. Atendendo a que obtm mais
energia quando respiram estes organismos crescem mais depressa em condies aerbicas do que
em condies de anaerobiose.
Se um microrganismo anaerbio facultativo for inoculado em meio de cultura apropriado e
incubado, as clulas vo respirar at todo o oxignio ser consumida a partir dessa altura o seu
metabolismo passa a fermentativo, o seu crescimento continua mas mais lentamente. Esta
situao acontece frequentemente em ambientes aquticos onde se d a deposio de detritos
animais e vegetais e em processos de fermentao controlados para a obteno de determinados
alimentos e bebidas.
O conhecimento do modo como o oxignio afecta o metabolismo de determinado microrganismo
deve sugerir a melhor maneira de o estabelecer em cultura (fazer crescer) e de o classificar.
Para alm de aceitador final na cadeia transportadora de electres na respirao o oxignio
altera o potencial de oxidao - reduo das clulas. Muitos sistemas enzimticos das bactrias
exigem condies extremamente reduzidas, ou seja um potencial de oxidao - reduo baixo
para que possam funcionar e vice-versa.
O tipo de crescimento microbiano ao longo de um tubo de ensaio reflecte a sua necessidade
relativa de oxignio. Os aerbios estritos cresceram apenas superfcie do meio no tubo, os
anaerbios facultativos deve m crescer ao longo de todo o tubo, os aerotolerantes anaerbios
cresceram tambm ao longo de todo o tubo mas provavelmente cresceram melhor junto ao
fundo. O crescimento dos anaerbios estritos depende de at que ponto o oxignio se consegue
24
difundir no me io de cultura e da sensibilidade das clulas em questo s formas txicas de
oxignio. Anaerbios que sejam muito sensveis a ambientes que contenham oxignio podem
nunca conseguir crescer, mas outros crescero desde o fundo at ao topo do tubo.
PH DO MEIO
O pH constitui outro dos factores que influncia o crescimento microbiano. Cada espcie cresce
numa gama definida de pH e tem um pH ptimo para o seu desenvolvimento. Os microrganismos
acidfilos tm o seu ptimo de crescimento entre 0 e 5,5. Os neutrfilos entre 5,5 e 8 e os
alcalfilos entre 8,5 e 11,5. Os alcalfilos extremos tm o seu ptimo de crescimento a valores
de pH superiores a 10. De um modo geral cada tipo de microrganismos tem preferncia por uma
gama caracterstica de pH. A maioria das bactrias e protozorios so neutrfilos. A maioria dos
fungos prefere ambientes ligeiramente cidos, entre pH 4 e 6. As algas tambm parecem preferir
condies ligeiramente cidas.
Embora os microrganismos, de um modo geral, possam crescer numa gama relativamente grande
de pH existem limites para a sua tolerncia. Variaes drsticas no pH podem causar o
rompimento da membrana celular ou inibir a actividade enzimtica ou os transportadores
membranares de protenas.
Apesar das possveis variaes de pH no habitat, o pH interno da maioria dos microrganismos
situa-se prximo da neutralidade (5 a 5,5). Vrios mecanismos tm sido apontados como
responsveis por esta situao. A membrana plasmtica pode ser relativamente impermevel aos
protes. Os neutfilos aparentemente trocam potssio por protes recorrendo a um sistema de
transporte activo. Os alcalfilos extremos mantm o seu pH interno prximo da neutralidade
trocando ies sdio internos por protes externos. Para alm disso existe uma certa capacidade
tampo a nvel interno que contribui para esta homeostasia do pH.
Os microrganismos frequentemente alteram o pH do seu habitat atravs da produo de produtos
do seu metabolismo de carcter cido ou bsico, por esta razo so normalmente includos nos
meios de cultura tampes cuja finalidade evitar que os metabolitos excretados alterem o pH
de tal forma que seja inibitrio para o crescimento.
T EMPERATURA
A temperatura constitui outro factor que influencia profundamente o crescimento microbiano,
tal como acontece para todos os outros organismos. Os microrganismos so particularmente
sensveis temperatura uma vez que so geralmente unicelulares e poiquilotrmicos (a sua
temperatura varia com a temperatura externa). A temperatura influencia de forma decisiva o
crescimento microbiano uma vez que interfere na velocidade das reaces enzimticas. A taxa
de cada reaco aumenta medida que aumenta a temperatura, deste modo o metabolismo
como um todo mais activo a altas temperaturas e o microrganismo cresce mais depressa. A
partir de determinados valores o crescimento acaba por ser menor, e temperaturas demasiado
altas podem mesmo ser letais. Estas temperaturas provocam a desnaturao das enzimas, dos
transportadores de membrana e outras protenas. Temperaturas muito elevadas provocam a
rotura das membranas celulares uma vez que a dupla camada lipdica se altera por aco do
calor. Assim e embora em termos funcionais as enzimas operem mais rapidamente a
temperaturas elevadas, o crescimento microbiano acaba por sofrer decrscimo s na medida em
que os estragos causados por estas temperaturas no podem ser reparados de forma adequada.
25
Definem-se 5 classes de microrganismos de acordo com a sua gama de temperatura de
crescimento:
Classe Temperatura
(C)
Psicrfilos 0 - 15
Psicrotrficos 0 - 35
Mesfilos 15 - 45
Termfilos 45 - 80
Hipertermfilos 65 - 110
Os psicrfilos crescem bem a 0C e a sua temperatura ptima de crescimento situa-se nos 15C
ou abaixo disso. As membranas celulares destes microrganismos tm nveis elevados de cidos
gordos insaturados que permanecem num estado semi-fluido a baixas temperaturas e os seus
sistemas enzimticos, de transporte e sntese proteica esto adaptados a estas condies. A
temperatura mxima que toleram 20C, a partir deste valor as me mbranas celulares sofrem
disrupo e a clula perde o seu contedo. Estes microrganismos vivem nas zonas do rctico e
Antrctico.
Os psicotrficos ou psicrfilos facultativos podem crescer a 0C, embora a sua temperatura
ptima de crescimento se situe entr e os 20 e 30C. A temperatura mxima que toleram 35C.
Estes microrganismos, normalmente bactrias e fungos, so a principal causa de deteriorao de
alimentos refrigerados.
Os mesfilos tm uma temperatura ptima de crescimento entre 20 e 45C e toleram
temperaturas mnimas de 15 a 20C e mximas de 45C. A maioria dos microrganismos pertence a
esta classe. Quase todos os agentes causadores de doenas no Homem so mesfilos.
Os temfilos podem crescer a temperaturas de 55C ou superiores, o mnimo que toleram 45C
e a sua temperatura ptima de crescimento situa-se entre os 55 e 65C. Na sua grande maioria
so bactrias que proliferam em silagens, compostos ou linhas de gua sobreaquecidas. Os seus
sistemas enzimticos e protenas so mais estveis que os dos mesfilos e os lipidos de
membrana so mais saturados.
Os hipertermfilos tm a sua temperatura ptima de crescimento entre 80 e 110C,
normalmente no crescem bem a temperaturas inferiores a 65C. Foram encontrados alguns
microrganismos deste tipo a crescer a grandes profundidades no mar, em zonas muito quentes.
26
PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
P1. MICRORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE
Introduo
O nosso meio ambiente est repleto de microrganismos. Podemos encontr-los no ar, na gua,
nos vrios objectos e superfcie s que nos circundam, etc. e por isto que o trabalho em
microbiologia dever ser executado em condies de assepsia que impeam a contaminao dos
meios usados com microrganismos adventcios.
Este trabalho pretende ilustrar a ubiquidade dos microrganismos.
Material e Reagentes
Estufa de incubao
Placas de Petri com agar nutritivo
Placas de Petri com meio de mosto
Procedimento experimental
Testar vrios ambientes e objectos existentes no laboratrio, usando placas de Petri contendo
meio slido nutritivo para a revelao dos microrganismos a detectar. Cada grupo dever eleger
um dos seguintes elementos a testar:
Identificar as placas, no fundo, com:
1. Data, Operador, Incuo
2. Abrir uma placa sobre a bancada e deix-la exposta durante cerca de 30 minutos
Tossir para a superfcie do agar
Espalhar gua da torneira sobre o agar. Aguardar alguns minutos. Remover o excesso
com papel absorvente
Tocar com os dedos em vrios locais da superfcie do agar
Tirar um cabelo e "col-lo" superfcie do agar
Use a imaginao para inocular outras placas
Incubar as placas de Petri em estufa a 25C durante, pelo menos, uma noite
3. Observar as placas e registar :
Nmero de colnias totais e Nmero de colnias diferentes
Aspecto geral da placa e das colnias
4. Descrever as caractersticas das colnias, acompanhando de esboos dos aspectos
observados, relativamente a:
Superfcie e bordos da colnia (lisa, rugosa, granular, irregular, filamentosa, etc.)
Caracterstica pticas (cor, transparncia, brilho, etc.)
Consistncia (membranar, butirosa, quebradia, etc.)
27
28
Registo de resultados
MICRORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE
Operador: Data: ____/____/____
Incuo: Total de colnias:
Caracterizao das colnias observadas

Nmero de
Dimenso Aspecto Cor Consistncia colnias Desenho
Notas:
29
P2. OBSERVAO COMPARADA DE BACTRIAS, FUNGOS E PROTOZORIOS
Introduo
Os microrganismo s no so todos iguais embora partilhem a caracterstica comum de na sua
maioria serem individualmente invisveis a olho nu, necessitando por isso de ampliao de forma
a serem visualizados. Os microrganismo s diferem entre si na sua organizao celular, na sua
aparncia e na sua actividade. A dimenso celular s por si pode-nos auxiliar na constituio de
diferentes grupos.
Podemos dividir os microrganismos em dois grandes grupos baseados no tipo de organizao
celular. Os microrganismo s eucariticos e os microrganismos procariticos. Os microrganismo s
eucariticos incluem trs grandes grupos; os protozorios, as algas e os fungos. Estes ltimos, os
fungos, so divididos em dois subgrupos em funo da sua organizao multicelular ou unicelular,
bolores e leveduras respectivamente. Os microrganismo s procariticos incluem as bactrias e as
cianobactrias.
Protozorios. Considerados como simples "animais" unicelulares dada a complexidade das suas
estruturas celulares. So conhecidas muitas espcies que colonizam ambientes aquticos ricos
em nutrie ntes tais como lagoas, mares e gua do solo. A maioria de vida livre e inofensivos
para o homem apesar de algumas espcies serem patognicas causando doenas tais como a
malria e a doena do sono. So microrganismos eucariticos possuindo um ou mais ncleos.
Frequentemente mveis possuindo como meios de locomoo clios, flagelos ou pseudpodes. As
suas dimenses so variveis podendo variar de alguns m a vrios mm.
Algas. Trata-se de um grupo de organismos que realizam a fotossntese e que se disseminam por
quase todos os ambientes aquticos. Alguns destes microrganismo s atingem grandes dimenses
sendo macroscopicamente visveis, no entanto a maioria so microscpicos. As algas
microscpicas so normalmente organismos livres encontrados em locais onde gua e luz estejam
presentes. So normalmente visveis como uma pelcula verde superfcie de lagoas e aqurios.
Fungos. Grupo muito diverso a largamente disseminado de microrganismos eucariticos
unicelulares e multicelulares (incluindo cenocticos). Nos fungos podemos distinguir dois tipos; os
bolores e as leveduras. Os bolores so normalmente organismos pluricelulares em que as clulas
se organizam em estruturas tubulares semi-rgidas designadas por hifa. Uma massa de hifas toma
a designao de miclio. De acordo com as espcies, as hifas podem ser de 3 tipos; no septadas
(cenocticas), septadas com clulas mononucleadas e septadas com clulas multinucleadas. O
dimetro de uma hifa varia de 1 m a dimenses visveis a olho nu. Num miclio podemos
encontrar hifas vegetativas e hifas frteis. Estas ltimas albergam estruturas reprodutivas dos
fungos (esporos), podendo ser do tipo sexuado ou assexuado. As leveduras so uma categoria de
fungos normalmente caracterizada com base em aspectos morfolgicos e fisiolgicos. Organizam-
se normalmente na forma unicelular podendo desenvolver estruturas alongadas resultantes de
divises celulares incompletas (pseudomiclio). Fermentam uma larga gama de acares e o seu
modo de reproduo assexuada , caracteristicamente, por gemulao. As suas dimenses so
reduzidas (alguns m) sendo geralmente maiores que as bactrias.
Bactrias. Microrganismos procariticos unicelulares muito diversificados e de distribuio
ubiquitria. Por possurem parede celular rgida, possuem formas caractersticas designadas por
bacilos (bacillus), cocos (coccus), espiraladas (spirillum) e vibrio (vibrio). As espcies de
bactrias moveis possuem flagelos que podem estar inseridos na clula em diferentes
localizaes (polar, lofotrica e peritriquial) O seu processo de multiplicao por fisso binria.
As suas dimenses podem ser inferiores a 1 m, sendo na sua maioria entre 1 e 10 m.
Cianobacterias (algas verdes -azuis). Grupo heterogneo de microrganismo s procariticos que
realizam fotossntese com produo de O2, ao contrrio do que acontece com as bactrias
fotossintetizantes. Distinguem-se das microalgas pois no possuem cloroplastos bem como outros
organitos caractersticos da clula eucaritica. Podem ser organismos unicelulares embora
30
existam muitas espcies caracteristicamente coloniais ou filamentosas. As suas dimenses so
muito semelhantes s das bactrias.
cultura de E. coli Soluo salina estril
cultura de Rhizobium Lminas e lamelas
cultura de S. cereviseae Microscpio e Lupa
cultura de fungos Azul metileno
suspenso de Leishmania Infuso de palhas
gua de poa orgnica Ansas
1. Sobre uma lmina de vidro coloque uma pequena gota de corante azul metileno diludo,
sobre a qual coloca uma ansada do material que pretende observar, observando cuidados
de assepsia.
2. Com o auxlio da ansa homogeneze a suspenso obtida.
3. Cubra a suspenso com uma lamela, pressionando levemente.
4. Observe ao microscpio, aumentando progressivamente de ampliao. Quando usar a
objectiva 100 x utilize leo de imerso.
5. Para a observao de fungos filamentosos, no abra as placas de Petri, procedendo s
observaes atravs do vidro da placa usando a lupa.
6. Fazer esboos das clulas observadas, tendo em ateno a complexidade celular
observvel e a dimenso relativa dos espcimes.
31
OBSERVAO COMPARADA DE BACTRIAS, FUNGOS E PROTOZORIOS
Esboo da Dimenso
Organismo morfologia Comentrio
relativa
predominante
E. coli
Rhizbio
S. cereviseae
Leishmania
Cultura de fungos
gua de poa orgnica
Infuso de palhas
Notas:
32
P3. PIPETAGENSE DILUIES
Introduo
O rigor nas diluies a efectuar com alguns materiais biolgicos e reagentes, no contexto de
vrios dos trabalhos experimentais que aqui se incluem, crtico e fundamental para o sucesso e
para a fiabilidade dos resultados.
Porque se observa com alguma frequncia uma grande inabilidade dos estudantes para a
manipulao adequada das micropipetas e para um raciocnio operacional das diluies expressas
como potncias de 10, introduz-se este trab alho preliminar.
Material e reagentes
Soluo concentrada de azul-de -metileno
Soro fisiolgico (salino)
Micropipetas diversas
Tubos de ensaio
Espectrofotmetro
Procedimento (por grupo)

1. Marque 10 tubos de ensaio (de 1 a 10)
2. A partir da soluo concentrada de azul-de -metileno proceda, esterilmente, s seguintes
diluies sequenciais (decimais):
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Solvente (ml) 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5
Corante (ml) 0,5
Soluo precedente (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9
Diluio 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10- 10
3. Registe as intensidades de cor observveis nos diferentes tubos

4. Determine a absorvncia das solues dos tubos com nmero par a 600-660 nm
5. Marque 5 tubos de ensaio (de 1 a 5)

6. A partir da soluo concentrada de azul-de -metileno proceda, esterilmente, s seguintes
diluies sequenciais (centesimais):
Tubo 1 2 3 4 5
Solvente (ml) 5 5 5 5 5
Corante (l) 50
Soluo precedente (l) 50 50 50 50
-2 -4 -6 -8
Diluio 10 10 10 10 10- 10
33
7. Registe as intensidades de cor observveis nos diferentes tubos
8. Determine a absorvncia das solues dos tubos com nmero par a 600-660 nm
9. A partir da soluo concentrada de azul-de -metileno proceda preparao de 5 ml de

soluo diluda a 5x104
10. Observe a intensidade de cor observvel
11. Determine a absorvncia da soluo a 600-660 nm
12. Compare o conjunto dos resultados que obteve
13. Insira num grfico, de tipo semi-logartmico, todos os resultados que obteve
14. Calcule as mdias de concentrao da soluo de partida para cada conjunto de diluies.
34
PIPETAGENS E DILUIES
DO 600nm / ml
Amostra DO 600nm / ml Observaes
(Soluo 100 )
10-2
Alnea 4.
10-4
10-6
10-8
10-10
Mdia
DO 600nm / ml
Amostr a DO 600nm / ml Observaes
(Soluo 100 )
10-2
Alnea 8.
10-4
10-6
10-8
10-10
Mdia
DO 600nm / ml
Amostra DO 600nm / ml Observaes
(Soluo 100 )
Alnea 11.
5 x 10-4
Notas:
35
P4. MEIOS DE CULTURA
Introduo
Quando no laboratrio se pretende cultivar microrganismo s necessrio fornecer -lhes as fontes
de nutrientes (materiais plsticos e energticos) indispensveis ao seu crescimento. Os meios de
cultura, para cumprir as suas funes tero de estar isentos de contaminantes susceptveis de
tambm crescer nas condies em que o microrganismo em teste se vai propagar.
Neste trabalho preparar-se- um meio de cultura slido e testar-se- a capacidade do estudante
para a sua preparao estril.
Autoclave Extracto de carne
Estufa de incubao Peptona
Potencimetro Agar
Balo Erlenmeyer de 250 ml 0,1N HCl e 0,1N NaOH
Placas de Petri esterilizadas gua destilada
1. Medir 200 ml de gua destilada para o balo Erlenmeyer
2. Pesar os seguintes produtos:
Extracto de carne 0,75 gr
Peptona 1,25 gr
3. Adicionar ao balo e agitar at dissoluo
4. Verificar e acertar a pH 7.2, se necessrio, com as solues de NaOH ou HCl
5. Adicionar gua destilada ao volume final de 250 ml
6. Adicionar 3,75 gr de agar (1,5% final)
7. Homogeneizar por agitao (o agar no dissolve a frio)
8. Esterilizar o meio de cultura na autoclave a 121C durante 15 minutos
9. Aps a esterilizao agitar o balo para homogeneizar o contedo
10. Deixe arrefecer at cerca de 45C (quando o calor se comea a suportar na mo)
11. Distribuir esterilmente por placas de Petri (meia altura) evitando a formao de
bolhas de ar
12. Deixar solidificar sobre a bancada (placas tapadas)
13. Incubar na estufa a 30C durante 24 horas
14. Observar, registar e rejeitar as placas eventualmente contaminadas
36
MEIOS DE CULTURA
Nmero de placas preparadas (A): Nmero de placas contaminadas (B):
Taxa de sucesso
100 - (100 x B / A):
Notas:
37
P5. CULTURAS PURAS
Introduo
Um microrganismo , colocado num meio de cultura slido adequado ao seu crescimento,
multiplicar-se- no local em que foi colocado, dado que o meio slido no lhe permite
movimentar -se livremente. Se num meio slido os microrganismos forem colocados
suficientemente afastados uns dos outros, cada um constituir um ncleo de crescimento a partir
do qual surgir uma massa macroscopicamente visvel - uma colnia.
Neste trabalho prtico isolar -se-o culturas puras de bactrias usando o mtodo do riscado e o
mtodo das placas de incluso
Estufa de incubao Placas de Petri
Banho Maria a 45C Placas de Petri com agar nutritivo
Vortex Tubos com agar nutritivo fundido
Ansa Salino estril
Riscado
1. Marcar uma placa de Petri contendo agar nutritivo (incuo, operador, data, tcnica do
riscado)
2. Esterilizar a ansa na chama e arrefecer nas proximidades
3. Tomar uma poro de cultura com as bactrias a isolar
4. Espalhar o contedo da ansa na superfcie do agar (escolha um dos mtodos atrs
descritos)
5. Repita o isolamento noutra placa usando uma tcnica de riscado diferente
6. Incubar as placas, em posio invertida, na estufa a 30C durante 24 horas
7. Observar as placas e registar a existncia de colnias isoladas
Placas de incluso
1. Marcar uma placa de Petri estril (incuo, operador e data)
2. Tomar um tubo com agar fundido do banho -maria
3. Adicionar uma ansada de cultura em estudo. Homogeneizar no vortex
4. Verter o contedo do tubo na placa de Petri cobrindo todo o fundo
5. Deixar solidificar sobre a bancada
6. Ressuspender uma ansada de cultura em 1 ml de soluo salina estril
7. Tomar uma ansada e repetir o processo para isolamento de colnias (passos 2 a 5)
8. Incubar as placas, em posio invertida, na estufa a 30C durante 24 horas
9. Observar o crescimento bacteriano e registar a existncia de colnias isoladas
38
CULTURAS PURAS
Incuo:
Isolamento por riscado

Nmero de colnias Percentagem da cultura
Tcnica exercitada Aspecto geral da placa isoladas em isolamento
Isolamento por placas de incluso

Nmero de colnias Percentagem da cultura
Quantidade de incuo Aspecto geral da placa
isoladas em isolamento
Notas:
39
P6. COLORAO DE BACTRIAS. MORFOLOGIA E ASSOCIAO
Introduo
Para a observao microscpica de micror ganismo s necessrio diferenciar o seu contedo
interno do meio exterior envolvente.
Neste trabalho observar -se-o vrias caractersticas de bactrias por observao ao microscpio
de preparaes submetidas a processos de colorao diversos. Pretende-se observar bactrias
vivas e respectiva mobilidade, contrastadas por colorao do meio envolvente, discriminao
entre microrganismo s Gram positivos e Gram negativos e identificao do tipo de associao
entre as clulas individuais.
Microscpio Azul-de -metileno
Ansa Tinta-d a-china
Lminas e lamelas de microscpio Reagentes para colorao de Gram
Preparao das lminas
1. Lavar as lminas com sabo e com lcool para eliminar vestgios de gordura
2. Limpar com papel absorvente . Secar bem ao ar
3. Manipular as lminas tocando apenas nos bordos
Preparao de um esfregao
1. Identificar lminas numa das extremidades

2. Tomar uma gota de cultura com uma ansa (a partir de meios lquidos)
3. Colocar a suspenso no centro da lmina (Para meios slidos tomar uma gota de salino no
centro da lmina e homogeneizar uma colnia de cultura com a ansa)
4. Espalhar bem toda a suspenso bacteriana com movimentos circulares da ansa
5. Deixar secar completamente ao ar
6. Fixar a preparao "cortando" a chama 3 x com a lmina (suspenso para cima)
7. Corar pelo mtodo escolhido
Colorao negativa (observao vital)
1. Identificar lminas numa das extremidades

2. Colocar uma gota de tinta-da-china no centro, a 2/3 do comprimento da lmina
3. Adicionar uma gota de suspenso da bactria (ou ansada com uma colnia)
4. Colocar lamela para observao vital
5. Observar ao microscpio de imediato
6. Registar a mobilidade observada, se aplicvel
40
Colorao negativa
1. Preparar uma suspenso bacteriana em tinta-da-china (como atrs)

2. Tocar com a extremidade de outra lmina na gota (posio inclinada)
3. Deslocar as duas lminas arrastando a suspenso para formar uma fina camada
4. Deixar secar bem ao ar
5. Observar ao microscpio procurando uma zona da lmina em que a observao seja
possvel
6. Registar a forma das bactrias e o tipo de associao das clulas individuais
Colorao simples
1. Colocar a lmina com o esfregao fixado sobre duas varetas na tina de lavagem
2. Colocar I ou II gotas de soluo de azul-de-metileno (suficiente para cobrir o esfregao)
3. Deixar actuar o corante durante 30 segundos a dois minutos
4. Passar a lmina por vrias "mudas" de gua at no ser arrastado corante visvel
5. Deixas secar ao ar
6. Observar ao microscpio e registar as observaes
Colorao de Gram
(respeitar rigorosamente os tempos indicados)

1. Colocar a lmina com o esfregao fixado sobre duas varetas na tina de lavagem
2. Cobrir o esfregao com a soluo de cristal violeta. Deixar actuar durante 1 minuto
3. Eliminar rapidamente o corante com gua corrente (jacto suave) - cerca de 5 segundos
4. Cobrir o esfregao com soluo de iodo. Deixar actuar durante 1 minuto
5. Eliminar rapidamente o iodo com gua corrente (jacto suave) - cerca de 5 segundos
6. Descorar com lcool a 95 corrente at sair sem cor (10 - 20 segundos)
7. Lavar com gua corrente (jacto suave) - cerca de 5 segundos
8. Cobrir o esfregao com soluo de safranina. Deixar actuar durante 30 segundos
9. Lavar com gua corrente at no ser arrastado corante visvel
10. Eliminar excesso de gua com papel absorvente. Deixar secar ao ar
11. Observar ao microscpio
12. Registar as observaes:
Desenhar os diferentes tipos de bactrias observadas
Forma das bactrias
Tipo de associao
Propriedade Gram (positivo ou negativo)
41
COLORAO DE BACTRIAS. MORFOLOGIA E ASSOCIAO
Colorao negativa
Amostra Mobilidade Forma / Associao Desenho
Colorao simples
Amostra Forma Associao Desenho
Colorao Gram
Amostra Gram Forma Associao Desenho
Notas:
42
P7. QUANTIFICAO DE MICRORGANISMOS
Introduo
Os estudos em microbiologia obrigam com frequncia determinao do nmero de
microrganismos num determinado incuo, para caracterizao da populao presente numa certa
amostra, ou para avaliao do crescimento do microrganismo em considerao.
Avaliar a concentrao de microrganismos numa suspenso problema, fornecida para o efeito,
constitui o objectivo deste trabalho. As tcnicas a executar na sesso laboratorial sero
indicadas pelo docente
Preparao de diluies
Amostra em estudo
Micropipetas, pontas e microtubos (ou pipetas graduadas)
Microtubos (ou tubos de ensaio
1. Observar as diluies e os volumes pretendidos (proporcionais aos indicados) para a
execuo da tcnica;
2. Preparar as diluies utilizando a tcnica assptica, conforme ao esquema:
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10
Amostra - - - - - - - - -
100 l
(100 )
Diluio
- 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l
anterior
Solvente 900 l 900 l 900 l 900 l 900 l 900 l 900 l 900 l 900 l 900 l
3. Homogeneizar bem cada diluio antes de tomar a amostra para a seguinte.

4. Anotar as diluies efectuadas
43
Contagem por Turbidimetria
Diluies adequadas
Turbidmetro
Procedimento
1. Acertar os 0% de transmitncia sem amostra
2. Transferir cerca de 3ml de SF para cuvete do espectrofmetro
3. Acertar os 100% de transmitncia
4. Substituir SF pela amostra mais diluda
5. Registar leitura do espectrofotmetro
6. Repetir passos 4 e 5 at ao primeiro tubo
7. Fazer o grfico respectivo
Avaliao em Cmara de Contagem
Diluies adequadas
Microscpio
Cmara de
contagem
1. Montar adequadamente a lamela na lmina para contagem
2. Com auxlio de pipeta Pasteur encher o espao entre as duas lminas com a suspenso a
avaliar
3. Observar ao microscpio
4. Enumerar os microrganismos contidos nas divises da lmina de contagem
5. Determinar a quantidade de microrganismos no volume contado
44
6. Calcular a concentrao por unidade de volume da suspenso inicial
7. Registar os resultados
Contagem de viveis (espalhamento)
Diluies adequadas
Pipetas Pasteur ou espalhador de vidro
Estufa de incubao
1. Marcar a placa com agar
2. Pipetar 200 l da diluio indicada para o centro de uma placa com agar nutritivo
3. Espalhar superfcie do agar at ao completo esgotamento do lquido, com auxlio de um
espalhador ou de pipeta pasteur dobrada.
4. Repetir os passos anteriores com as demais diluies requeridas.
5. Incubar em estufa a 37C durante 48 horas, em posio invertida
6. Observar as placas e contar o nmero de colnias de cada placa
7. Determinar a concentrao da amostra inicial (100 )
Contagem de viveis (incorporao)
Diluies adequadas
Placas de Petri esterilizadas
Agar nutritivo fundido (50C)
Estufa de incubao
1. Marcar a placa esterilizada
2. Pipetar 200 l da diluio indicada para dentro de tubo contendo o agar fundido
3. Transferir de imediato todo o agar na placa de Petri
4. Homogeneizar, com movimentos circulares, at ao incio do endurecimento do agar
5. Repousar sobre a bancada para consolidao da solidificao
6. Repetir os passos anteriores com as demais diluies requeridas
7. Incubar em estufa a 37C durante 48 horas, em posio invertida
8. Observar as placas e contar o nmero de colnias de cada placa
9. Determinar a concentrao da amostra inicial (100)
45
QUANTIFICAO DE MICRORGANISMOS
Amostra:
Contagens viveis (espalhamento ou incorporao)

Diluio Volume inoculado Nmero de colnias Concentrao (xx/ml)
Cmara de contagem
Diluio Nmero de indivduos Volume "contado" (xx/ml)
Turbidimetria
Diluio Transmitncia Diluio Transmitncia
Notas:
46
P8. CADEIA DE TRANSMISSO
Introduo
Os microrganismo s, particularmente os patognicos, podem ser dispersos na populao
susceptvel por vrias vias: por contacto directo, por gotas ou aerossis ou por vectores, como os
insectos. Uma via frequente de transmisso por contacto directo mediada pelo "aperto de
mos" inadequadamente limpas.
Este exerccio pretende documentar o contacto directo na transmisso de agentes infecciosos e a
determinao do foco inicial de irradiao da infeco.
Problema
Das vrias bolas fornecidas, apenas uma estar "contaminada" com uma levedura no patognica
(Saccharomyces cerevisiae). Qual?
Estufa de incubao
Bola de algodo embebida
Placas com meio de mosto
Luvas
1. Atribuir um nmero a cada estudante e preencher a tabela durante a execuo do
trabalho
2. Calar uma luva na mo direita
3. Dividir ao meio uma placa de meio de mosto e marcar cada lado com 2 e 3
4. Rolar a bola de algodo fornecida com os dedos da mo enluvada
(a mesma bola para todos os elementos do mesmo grupo)
5. Cada elemento dever "apertar a mo" a um colega de outro grupo
6. Repetir a ronda de "apertos de mo" com outro colega, diferente do anteriores
7. Inocular a placa de mosto, na zona 2, por contacto dos dedos da luva com a superfcie do
agar
8. Repetir a ronda de "apertos de mo" com outros colegas, diferentes dos anteriores
9. Inocular a placa de mosto, na zona 3, com idntico procedimento
10. Incubar as placas de agar em estufa a 30C durante 72 h.
11. Observar as placas e registar a presena de leveduras
12. Analisar os resultados e determinar a origem da infeco
47
CADEIA DE TRANSMISSO
1 aperto 2 aperto Cultura 3 aperto Cultura

# Nome
de mo de mo (s/n) de mo (s/n)
1 aperto 2 aperto Cultura 3 aperto Cultura

Nome #
de mo de mo (s/n) de mo (s/n)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Origem da infeco:
Notas:
48
P9. TESTE DO PAPEL HIGINICO
Introduo
Neste trabalho pretende-se avaliar a eficcia do papel higinico como barreira contaminao
com agentes bacterianos simulando uma situao corrente da sua utilizao.
Papel higinico
Placas com meio MacKonkey
Luvas de ltex
Copo com gua e lixvia
Toalha turca
Sabonete
Placa com crescimento de E. coli
1. Identificar convenientemente uma placa de Petri com meio MacKonkey
2. Traar um risco que a divida ao meio e identificar uma das metades como antes e a
outra como depois
3. Calar uma luva e envolver um dedo em papel higinico (1, 2, 3, 4 e 5 folhas, conforme o
grupo)
(Um ou dois elementos da turma executaro a experincia a partir do nmero 10)
4. Passar com o dedo envolvidos no papel higinico por uma superfcie do crescimento de
E. coli
5. Deitar o papel para o recipiente que contm gua e lixvia
6. Voltando placa com meio MacKonkey inocular o dedo na metade identificada como
antes
7. Lavar a mo (com a luva) em gua corrente e sabo e secar na toalha turca, como
normalmente faz aps o uso dos sanitrios
8. Inocular agora o mesmo dedo da luva na metade da placa com meio de MacKonkey
identificada como depois
9. Ainda com a luva calada, passar as mos por lcool e s depois retirar e rejeitar a luva
(Para os elementos que no executaram a experincia anterior )
10. Inocular um dedo de luva na metade antes da placa com meio MacKonkey
11. Lavar as mos como em 8, usando o mesmo sabonete e toalha dos colegas
12. Inocular o mesmo dedo da luva na metade depois da placa com meio MacKonkey
13. Incubar as placas a 37C durante uma semana
14. Observar o tipo e abundncia de crescimento em cada uma das metades das placas de
Petri inoculadas
49
Registo de Resultados
TESTE DO PAPEL HIGINICO
Amostra Aspecto do crescimento bacteriano Observaes
"antes"
"depois"
Notas:
50
P10. CONDIES AMBIENTAIS DE CRESCIMENTO MICROBIANO
Introduo
Para alm dos nutrientes para a sntese dos seus componentes vitais e da energia qumica
necessria ao seu metabolismo, outras condies ambientais so necessrias para um adequado
crescimento microbiano no laboratrio.
Entre os parmetros a controlar merecem especial destaque as concentraes relativas de
oxignio, os valores do pH no meio e a temperatura para o seu crescimento. Neste trabalho
estudar -se-o os efeitos de diferentes valores destes parmetros no crescimento bacteriano.
Estufas de incubao (20C, 30C e Meio de agar nutritivo semi-slido
37C) Crescimentos de E. coli, Rhizobium, S.
Banho-maria cerevisiae
Vortex Meio de mosto liquido (pH 4, 7 e 9)
Ansa Caldo nutritivo (pH 4, 7 e 9)
Tubos esterilizados
Efeito do pH e da temperatura
(Marcar convenientemente todos os tubos a usar)

1. Inocular 1 tubo contendo meio de mosto a pH 4 com S. cerevisiae
4. Inocular 1 tubo contendo caldo nutritivo a pH 4 com E. coli
7. Homogeneizar bem todos os tubos
8. Incubar em estufa, durante 48 horas:
Grupo A e D 20C Grupo B e E 30C Grupo C e F 37C
9. Observar o crescimento bacteriano nos diferentes tubos
10. Registar os resultados obtidos por todos os grupos da turma
51
Efeito do O2
1. Tomar um tubo contendo agar nutritivo fundido (no banho -maria)

2. Inocular com a bactria E.coli
3. Homogeneizar suavemente, mas de forma a espelhar a bactria por todo o agar
4. Colocar o tubo na vertical e deixar solidificar temperatura ambiente
5. Proceder do mesmo modo inoculando Rhizobium em outro tubo de agar
6. Incubar em estufa a 30C durante 48 horas
7. Observar o crescimento e registar os resultados
52
CONDIES AMBIENTAIS DE CRESCIMENTO MICROBIANO
Incuo / Meio de cultura pH Temperatura Resultado Observaes

S. cerevisiae 4 20
meio de mosto
30
37
7 20
30
37
9 20
30
37
E. coli 4 20
caldo nutritivo
30
37
7 20
30
37
9 20
30
37
53
CONDIES AMBIENTAIS DE CRESCIMENTO MICROBIANO
S. cerevisiae Temperatura
(Meio de mosto) 20 30 37
pH 4
pH pH 7
pH 9
E. coli Temperatura
(Caldo nutritivo) 20 30 37
pH 4
pH pH 7
pH 9
Notas:
54
P11. ANTIBITICOS
Introduo
As espcies microbianas frequentemente inibem o crescimento umas das outras tanto pela
excreo de produtos resultantes do seu metabolismo que alteram as condies ambientais,
como pela produo de algumas substncias qumicas especficas: os antibiticos. Os antibiticos
podem inibir o crescimento ou eliminar microrganismos com que contactem e, para poderem ser
utilizados clinicamente, no devero afectar significativamente os organismos eucariticos nas
doses teraputicas.
Neste trabalho documentar-se-o os efeitos de alguns antibiticos sobre algumas espcies
bacterianas.
Cultura de E. coli Soluo salina estril
Cultura de Rhizobium Rolho de algodo estril
Cultura de Actinomices Placas de agar nutritivo
Soluo de Kanamicina Discos de papel esterilizado
Soluo de Estreptomicina Pina
Soluo de Espectinomicina Estufa de incubao
Teste de susceptibilidade (Uma bactria por grupo)
1. Transferir 10 ml de soluo salina estril sobre placa com crescimento bacteriano

2. Suspender as bactrias com auxlio de rolho de algodo estril
3. Humedecer uniformemente a superfcie do agar de uma placa nova com o rolho de
algodo
4. Deixar secar na estufa (~10 minutos)
5. Marcar a placa, dividindo em 4 partes
6. Mergulhar um disco de papel esterilizado em soluo de antibitico (um por antibitico)
7. Escorrer excesso de soluo
8. Colocar no centro do quadrante da placa de Petri marcada
9. Repetir passos 6 e 7 com soluo salina estril
10. Incubar na estufa at crescimento visvel da bactria:
E.coli a 37C
Rizobium e Actinomices a 30C
11. Observar inibio de crescimento ao redor dos discos de papel
12. Medir os crculos de inibio e registar os resultados
55
ANTIBITICOS (teste de susceptibilidade)
Dimetro de inibio
Antibitico [ x ] / ml
E. coli Rhizobium Actinomices
Kanamicina
Estreptomicina
Espectinomicina
Salino
Sensibilidade relativa aos antibiticos testados

Resistncia
Maior Intermdia Menor
E. coli
Rhizobium
Actinomices
Notas:
56
P12. ANTI-SPTICOS E DESINFECTANTES
Introduo
Mltiplos reagentes qumicos so diariamente utilizados para controlo da disseminao de
microrganismos. Os produtos usados na "limpeza" de utenslios diversos, frequentemente
demasiado txicos para ser usados directamente no Homem, so chamados de desinfectantes. Os
produtos que aplicamos na pele, com o mesmo objectivo de eliminar eventuais microrganismos,
so anti-spticos. A promoo de artigos de higiene corporal e limpeza domstica refere-se
muitas vezes a propriedades antibacterianas desses produtos. Alguns sero bactericidas (matam
ou inactivam as bactrias) outros sero bacteriostticos (impedem o crescimento das bactrias,
sem as inactivarem)
Neste exerccio testar-se- a capacidade antibacteriana de agentes anti-spticos e
desinfectantes de uso comum.
Produto a testar
Pina
Rolho de algodo estril
Crculos de papel de filtro esterilizado
(Cada estudante dever trazer de casa um pouco de pasta de dentes, sabonete, champ,
detergente da loua ou outro produto que pretenda testar)
1. Recolher e marcar convenientemente as placas de Petri com agar nutritivo a usar
2. Preparar solues ou suspenses dos materiais a testar
3. Esterilizar uma pina, mergulhando em lcool e flamejando.
ATENO AO LCOOL NAS MOS e proximidade do lcool da chama !!!
4. Usando tcnica assptica, mergulhar um rolho de algodo esterilizado na cultura de
bactrias
5. Inocular uma placa espalhando as bactrias contidas no algodo de forma uniforme na
superfcie do agar
6. Tomar um crculo de papel de filtro esterilizado e mergulhar na soluo a testar,
eliminando o excesso de lquido (com pina estril)
7. Depositar o crculo de papel sobre a superfcie da placa inoculada, aconchegando com a
pina
8. Marcar convenientemente a posio na placa e a amostra a testar
9. Repetir com outros materiais, no mximo de 6 por placa de Petri
10. Incubar a 30C durante 48 horas
11. Observar os crescimentos bacterianos
12. Registar os resultados medindo o dimetro de inibio de crescimento bacteriano volta
dos filtros
13. Comparar a efectividade antibacteriana de cada material testado (ter em conta a diluio
inicial e o uso recomendado do produto)
57
ANTI-SPTICOS E DESINFECTANTES
Efectividade
Produto Diluio Dimetro de inibio Observaes
antibacteriana
Notas:
58
P13. MICROBIOLOGIA DAS GUAS
Introduo
A presena de microrganismos em todos os ambientes susceptveis de suportar a vida um dado
j adquirido. A gua, como suporte da vida terrestre, um bem fundamental de utilizao
generalizada em que o nvel e o tipo de microrganismo s que a contaminem so da maior
relevncia para as suas utilizaes. So mltiplos os testes que tm sido desenvolvidos para
avaliao da qualidade bacteriolgica da gua com vista a prevenir a transmisso de doenas
infecciosas pelo seu consumo.
Dado que os agentes patognicos para o Homem, eventualmente presentes na gua, existem aqui
em quantidades muito pequenas, a sua deteco por amostragem muito falvel. Recorre -se
ento pesquisa de organismos indicadores que possam reflectir os nveis de contaminao fecal
da gua. Dependendo dos usos a que a gua se destina, assim so definidos os nveis mximos de
coliformes permitidos por unidade de volume.
Neste exerccio laboratorial avaliar-se- a qualidade microbiolgica de uma gua pela deteco
de eventuais coliformes presentes e pela determinao do nmero mais provvel de
microrganismos .
9 tubos de caldo de lactose 2X (dupla Sistema para filtrao estril
concentrao e tubo de Durham) Filtros esterilizantes
- 10 ml cada Sistema de filtrao estril
pipetas estreis Meio ENDO (slido)
estufa de incubao 37C Amostra de gua
Determinao NMP (Nmero Mais Provvel)
1. Marcar e identificar os tubos com caldo de lactose:

3 tubos: #0,1
3 tubos: #1
3 tubos: #10
2. Adicionar a cada tubo #10 um volume de 10 ml de gua a testar
3. Adicionar a cada tubo #1 um volume de 1 ml de gua a testar+9 ml gua estril
4. Adicionar a cada tubo #0.1 um volume de 0.1 ml de gua a testar + 10 ml gua estril
5. Incubar em estufa a 37C.
6. Observar a formao de gs nos tubos de Durham entre as 24 e as 48 horas seguintes.
7. Registar o nmero de tubos positivos.
8. Determinar o NMP/100 ml usando a tabela de NMP.
59
Filtrao por membrana
1. Montar assepticamente a membrana no sistema de filtrao

2. Ligar a fonte de vcuo
3. Filtrar a gua a analisar (50 ml, 100 ml, 200 ml)
4. Transferir o filtro para meio slido (ENDO) em placa
6. Observar, registar os resultados
7. Contar as colnias avermelhadas com superfcie de aspecto metalizado
8. Calcular o nmero de coliformes por 100 ml
Tabela NMP
TABELA NMP
(3 x 10ml + 3 X 1 ml + 3 X 0,1 ml)
Nmero de tubos positivos ndice NMP Nmero de tubos positivos ndice NMP
#10 #1 #0.1 / 100 ml #10 #1 #0.1 / 100 ml
0 0 0 < 3 3 0 0 23
0 0 1 3 3 0 1 39
0 1 0 3 3 0 2 64
1 0 0 4 3 1 0 43
1 0 1 7 3 1 1 75
1 1 0 7 3 1 2 120
1 1 1 11 3 2 0 93
1 2 0 11 3 2 1 150
2 0 0 9 3 2 2 210
2 0 1 14 3 3 0 240
2 1 0 15 3 3 1 460
2 1 1 20 3 3 2 1 100
2 2 0 21 3 3 3 > 2 400
2 2 4 28
60
MICROBIOLOGIA DAS GUAS
Amostra de gua:
NMP
Tubos Positivos Negativos NMP / 100 ml

# 10
#1
# 0,1
Filtrao por membrana
Volume filtrado Nmero de coliformes
Notas:
61
P14. ANLISE MICROBIOLGICA DO LEITE
Introduo
O leite dos alimentos mais ricos e completos e, por isso, dos mais susceptveis a contaminaes
microbianas. O leite animal utilizado no consumo pblico tem de ser submetido a diversos
processos para diminuio da carga bacteriana tanto normal como adventcia, resultante das
prticas zootcnicas da sua recolha. Para garantia da segurana alimentar importa verificar o
estado microbiolgico do leite.
Neste trabalho executar-se-o algumas tcnicas simples para demonstrao do estado de
contaminao bacteriana de leites crus (no tratados) e de leites pasteurizados.
Material e Reagente s
Banho-maria Leite cru Tubos com agar
Estufa de incubao Leite UHT nutritivo (fundido)
(37C) Tubos com 5 ml de Placas de Petri
Azul-de -metileno caldo de lactose 2X esterilizadas
(1:25.000) Tubos de ensaio estreis
Teste da reductase
1. Transferir 10 ml de cada leite por tubo de ensaio

(2 por amostra)
2. Adicionar 1 ml de azul de metileno (1:25.000) a cada tubo
3. Tapar com parafilm. Homogeneizar por inverso duas vezes
4. Aquecer um tubo de cada leite em banho-maria fervente durante 3 min utos (controlos)
5. Incubar na estufa a 37C, durante 5 minutos
6. Homogeneizar de novo por inverso
7. Incubar na estufa a 37C, sem agitar
8. Observar a alterao da colorao por comparao de cada tipo de leite aos tempos
indicados
9. Registar as observaes (viragem a 4/5 do volume)
Interpretao:
Classe 1: Excelente - no descora at s 8 horas
Classe 2: Bom - descora em menos de 8 horas
Classe 3: Razovel - descora em menos de 6 horas
Classe 4: Mau - descora em menos de 2 horas
62
Contagem de microrganismos
1. Diluir cada tipo de leite a 10-2 , 10- 3 , 10-4 e 10-5 (volume final de 10 ml)
2. Leite cru:
Inocular 5 ml de cada diluio em 5 ml de caldo de lactose 2X
3. Leite UHT:
Incorporar 0,1 ml de cada diluio em agar nutritivo
5. Observar a produo de gs nos tubos de Durham s 24 e 48 horas
6. Observar crescimento bacteriano nas placas e contar colnias s 24 horas
7. Registar as observaes
63
ANLISE MICROBIOLGICA DE UM LEITE - Teste da reductase
Tempos Cru UHT Tempos Cru UHT
0:15 3:00
0:30 4:00
0:45 5:00
1:00 6:00
1:30 7:00
2:00 8:00
Qualidade do leite
Cru UHT
Notas:
64
ANLISE MICROBIOLGICA DE UM LEITE - Contagem de microrganismos
Leite Cru (caldo de lactose)

24 H 48 H Observaes
10-2
10-3
10-4
10-5
Leite UHT (agar nutritivo)

Nmero de colnias Bactrias / ml Observaes
-2
10
10-3
10-4
10-5
Notas:
65
P15. PREPARAO DE UM IOGURTE
Introduo
A fermentao microbiana desde h sculos usada como meio de preparao e preservao de
certos alimentos. O iogurte, o vinho, os picles, certos molhos de soja, o sauerkraut so apenas
alguns exemplos de produtos de fermentao microbiana. As alteraes qumicas que ocorrem
durante a fermentao permitem a preservao dos alimentos e fazem com que as
caractersticas organolpticas do produto final, nomeadamente o sabor e o aroma, assumam um
caracter atractivo para o consumidor. Para alm disso, particularmente no caso do iogurte, a
ingesto de grandes quantidades de bactria acido-lcticas que estes produtos contm parece
ter efeitos benficos para a sade humana.
As bactrias responsveis por algumas fermentaes, como o caso do sauerkraut ou dos picles,
fazem normalmente parte da flora nativa dos vegetais. As condies de crescimento favorveis
fermentao proporcionam a proliferao dos microrganismo s desejados. J para a produo
de outro tipo de alimentos fermentados, tal como o iogurte, normalmente adiciona-se uma
stater culture para iniciar a fermentao. Esta starter culture contm um nmero elevado de
microrganismos especficos necessrios fermentao desejada para que resulte um produto
final de alta qualidade.
A fermentao do leite para a obteno de iogurte principalmente levada a cabo por bactrias
acido-lcticas, nomeadamente estreptococos e lactobacilos. A produo de cido lctico a partir
do acar do leite (lactose) feita por estas bactrias resulta na coagulao das protenas do leite
formando -aquilo a que vulgarmente se chama uma coalhada.
Iogurte fresco Recipiente de plstico Copo de vidro
(ou starter culture) Placa de aquecimento Lminas de
Leite fresco magro Potencimetro microscpio
Leite em p Termmetro Corantes de Gram
1. Colocar 100 ml de leite fresco magro num copo de vidro de 250 ml.
2. Medir e registar o pH.
3. Aquecer o leite a 85C durante 15 minutos. Durante este perodo agitar suavemente o
leite e controlar a temperatura com o termmetro colocado dentro do copo.
4. Passados os 15 minutos adicionar 3 g de leite em p e agitar para dissolver.
5. Arrefecer a mistura at 40 a 42C e adicionar a starter culture ou duas colheres de ch de
iogurte fresco por cada 100 ml de leite.
6. Verter o contedo do copo para um recipiente de plstico, cobrir com papel de alumnio e
incubar a 40 ou 42C de 18 a 24 horas.
7. No final do perodo de incubao verificar o pH do produto (iogurte) e observar o seu
aspecto, particularmente a consistncia o sabor e o aroma.
8. Preparar um esfregao da starter culture ou do iogurte fresco usado na inoculao e do
produto obtido e corar para observao do Gram.
66
PREPARAO DE UM IOGURTE
Observao / Determinao Valor / Registo Notas

pH do leite
Gram do iogurte fresco (ou
starter culture)
Aspecto do produto obtido
Sabor do produto obtido
Aroma do produto obtido
pH do produto obtido
Gram do produto obtido
Notas:
67
P16. ISOLAMENTO DE RHIZOBIUM.
O BSERVAO DE NDULOS E BACTEROIDES
Introduo
A presena de ndulos na raiz levou os investigadores a atribuir desde muito cedo a
responsabilidade destas estruturas na fixao de N2. No entanto, apenas em 1888 BEIJERINCK
provou experimentalmente que os ndulos contm bactrias sendo estas responsveis pela
fixao do azoto atmosfrico. Para tal ter certamente utilizado a metodologia recentemente
desenvolvida por ROBERT KOCH no estabelecimento das relaes causa-efeito determinadas pela
aco de micrbios. Segundo esta metodologia, a identificao de um microrganismo como
responsvel por uma determinada sintomatologia, implica o seu isolamento em cultura pura,
bem como a reproduo daquela em condies experimentalmente definidas POSTULADOS DE
KOCH.
Este trabalho prtico consiste na tentativa de demonstrao de que a bactria com as
caractersticas a seguir descritas a responsvel pela formao de ndulos e fixao de azoto
em hospedeiros compatveis.
Caractersticas
Clulas em forma de bastonete curto, Gram -, com dimenses que variam entre 0,5 e 0,9 mm
por 1,2 a 3,0 mm, ocorrendo isolados ou aos pares, mveis por flagelos polares, subpolares ou
peritriquiais, no formam esporos e em culturas envelhecidas apresentam granulaes de poli-b-
hidroxibutirato. Apresentam bom crescimento em meio de Manitol Levedura, podendo em meios
gelificados desenvolver colnias planas, convexas ou umbilicadas. Estas so normalmente
brancas e opacas, por vezes translcidas, apresentando frequentemente produo de goma de
natureza polissacardica. A incluso de vermelho do Congo no meio de cultura no conduz a uma
forte absoro deste corante pelas colnias, podendo certas estirpes apresentar ligeira absoro.
As estirpes de crescimento rpido produzem colnias de 4 a 6 mm de dimetro em 5 dias de
incubao a 26-30C provocando acidificao do meio de cultura. As estirpes de crescimento
lento produzem colnias com 1 mm de dimetro em 10 dias de incubao a 28-30C, provocando
a alcalinizao do meio de cultura. Induzem a formao de ndulos na raiz de leguminosas
compatveis, colonizando-os e podendo a desenvolver actividade diazotrfica em simbiose. No
interior dos ndulos podem sofrer pleomorfismos apresentando clulas de formas muito variadas.
68
1 Sesso
Objectivo
Observao de ndulos e bacterodes.

Inicio do isolamento em cultura pura.
Material necessrio
Biolgico Diverso
Razes de leguminosas noduladas; trevos, Pinas de ponta fina, Tesouras,
luzernas, vicias e serradelas recolhidas no Bisturis, Varetas de vidro
campo. Caixas de Petri esterilizadas
Bico de Bunsen ou lamparinas
de lcool
Qumico Lminas de vidro para
microscopia
Soluo de etanol 90% Microscpio ptico
Soluo de H 2O 2 a 3-5% Ansas de cromonquel
Soluo de NaCl a 0,85% (Salina) Pipetas de Pasteur esterilizadas
Soluo de Safranina Papel de filtro
Meio de Agar Manitol Levedura (AML) com Copos de vidro de 250 ml
Vermelho do Congo
Bales Erlenmeyer de 250 ml,
Meio de Agar Manitol Levedura (AML) com esterilizados
Cyclohexamida
Estufas de incubao
leo de imerso para microscopia ptica
Fsforos
Xilol Caixa para guardar preparaes.
Procedimento
Observao da nodulao em diferentes leguminosas
1. Identifique as leguminosas que encontra sobre a sua bancada de trabalho.

2. Corte a parte area das plantas e coloque as razes num copo de vidro, utilizando um
copo para cada gnero de leguminosa.
3. Lave vigorosamente as razes em gua corrente de modo a remover t oda a terra e outras
impurezas.
4. Retire uma raiz de cada copo e coloque-as sobre folhas de papel de filtro.
5. Distenda a raiz, separando bem as razes secundrias, deixando a raiz principal numa
posio central.
6. Observe e anote o nmero de ndulos na raiz principal e razes secundrias, a sua
distribuio ao longo da raiz e as suas dimenses.
7. Observe a colorao exterior dos ndulos e aps seccionar com bisturi alguns ndulos,
observe a colorao interior do tecido nodular.
8. Compare a forma dos ndulos nas diferentes leguminosas.
69
Observao de bacterodes
1. Escolha uma raiz de vcia e uma raiz de trevo bem noduladas e destaque um ndulo
proeminente localizado na raiz principal de cada uma delas, colocando-a sobre uma gota
de soluo salina no fundo de uma caixa de Petri.
2. Com uma vareta de vidro proceda ao esmagamento do ndulo de forma a obter um
macerado.
3. Coloque uma gota de soluo salina sobre uma lmina de microscopia e transfira uma
ansada do macerado obtido para a gota de soluo salina
4. Homogeneze e proceda ao espalhamento da suspenso de modo a obter um esfregao.
5. Faa a colorao da preparao com soluo de safranina durante 5 minutos.
6. Remova o excesso de corante, lave a preparao com gua e deixe secar.
7. Observe ao microscpio utilizando objectiva de ampliao 100x, com leo de imerso.
8. Aps observao de bacterodes, limpe a objectiva com xilol e identifique as preparaes
com data, espcime e grupo de trabalho, guardando-as em caixa distribuda para o
efeito.
Isolamento de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
1. De uma das razes de trevo retire alguns ndulos da raiz principal, com o cuidado de
deixar cerca de 1-2 mm de raiz para cada um dos lados do ndulo.
2. Coloque -os numa caixa de Petri com soluo etanol 90% durante 30 segundos,
transferindo-os de seguida para outra caixa de Petri contendo soluo de H 2O 2 a 3-5%,
deixando actuar durante 4-5 minutos.
3. Seguidamente transfira assepticamente os ndulos para uma caixa de Petri com gua
destilada esterilizada.
4. Transfira os ndulos para o fundo de uma caixa de Petri, colocando cada um sobre uma
gota de soluo salina.
5. Com vareta de vidro esterilizada, proceda ao esmagamento dos ndulos de forma a obter
um macerado to uniforme quanto possvel.
6. Com este macerado inocule placas MLA com Vermelho do Congo e Cyclohexamida*.
7. Proceda inoculao de placas por riscado, com flambagem da ansa entre cada srie de
riscos, de forma a obter colnias individualizadas.
8. Inocule 2 caixas de Petri por cada ndulo.
9. Aps a inoculao inverta as placas e coloque -as na estufa de incubao temperatura de
28C.
10. Lave e arrume a bancada de trabalho.
70
2 Sesso
Objectivo
Familiarizao com as caractersticas coloniais e morfologia celular de Rhizobium, repicagem de

colnias para obteno de culturas "puras" e observao diferencial de bactrias e bacterodes.
Material necessrio
Biolgico Qumico
Colnias obtidas pelos crescimentos Corantes para colorao de
resultantes das inoculaes realizadas na Gram
sesso anterior Soluo de Cristal Violeta
Bacterodes em esfregaos corados Soluo de Iodo
lcool Iodado
Soluo de Safranina
Diverso Soluo de NaCl a 0,85% (salina)
Lminas de vidro para microscopia leo de imerso para
Ansas de cromonquel microscopia ptica
Caixas de Petri Xilol
Pipetas de Pasteur Meio de Agar Manitol Levedura
Microscpio ptico (AML) com e sem Azul de
Bico de Bunsen ou lamparina de lcool Bromotimol
Esguicho para gua Meio de Agar Peptona Glucose
Peras de borracha com Vermelho Neutro
Estufas de incubao Soluo de etanol 90%
Procedimento
Caracterizao da morfologia colonial, morfologia celular e reaco de Gram de isolamentos de

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
1. Retire da estufa de incubao as placas inoculadas na sesso anterior.

2. Observe os crescimentos obtidos e tente encontrar colnias perfeitamente
individualizadas.
3. Com o auxlio da bibliografia fornecida, procure identificar colnias com as caractersticas
descritas para o gnero Rhizobium.
Atenda essencialmente dimenso, forma, textura, elevao e pigmentao das
colnias.
D especial ateno ao grau de absoro do corante utilizado no meio de cultura.
4. Escolha algumas colnias individualizadas com caractersticas que mais se assemelhem
com as descritas para a bactria em estudo e proceda sua descrio.
5. Com o auxlio de uma ansa flambada, transfira uma pequena poro de cada uma das
colnias para gotas de soluo salina sobre lmina de microscopia.
6. Homogeneze e espalhe sobre a lmina a suspenso assim obtida.
7. Elabore esfregaos seguindo o protocolo habitual e proceda colorao de Gram sobre
tais esfregaos.
71
8. Observe as preparaes ao microscpio com objectiva de 100x e leo de imer so.
9. Verifique a morfologia celular, a reaco aos corantes e a presena de contaminantes
Gram positivos.
10. Compare a morfologia celular encontrada nestes esfregaos com a obtida nos esfregaos
realizados na sesso anterior.
11. Identifique e guarde todas as preparaes coradas.
Inoculao de meios para a sesso seguinte
1. Proceda repicagem de colnias que, por observao ao microscpio, no apresentem

contaminantes e cuja morfologia celular esteja de acordo com a descrita para o gnero,
inoculando :
meio AML com Azul de Bromotimol*1
Agar de Pepton a Glucose com Vermelho Neutro
MLA sem corante. Neste ltimo meio faa um riscado que permita um crescimento em
massa, o que poder obter se no esterilizar a ponta da ansa entre cada srie de
riscos.
1
- A incorporao de Azul de Bromotimol permite verificar a natureza cida ou alcalina dos metablitos
resultantes da utilizao da fonte de energia do meio de cultura. A inoculao de Meio de Agar Peptona
Glucose com Vermelho Neutro, pretende despistar contaminantes, dado que o rizbio no cresce neste
meio de cultura.
72
3 Sesso
Objectivo
Realizao do ensaio gnotobitico para verificao dos "Postulados de Koch" e avaliao de

isolamentos.
Material necessrio
Biolgico Diverso
Crescimentos resultantes das inoculaes Bales Erlenmeyer de 150
realizadas na sesso anterior ml, esterilizados
Radculas de Trifolium subterraneum cv.Mount Frascos sorolgicos de 25
Barker ml, esterilizados
Areia esterilizada
Tubos de ensaio com tampa
de rosca, esterilizados
Qumico
Pipetas volumtricas de 5
Soluo de NaCl a 0,85% ml, escoamento total,
Soluo nutritiva de Jensen com e sem azoto esterilizadas
combinado Caixas de Petri,
Soluo de etanol 90% esterilizadas
Soluo de HgCl2 a 0,1%, acidificado com HCl puro Sacos de polietileno 8x12
5ml/l cm
Agar de gua 0,8% Elsticos
gua destilada esterilizada Cmara climatizada
Procedimento
Nesta 3 sesso procede-se inoculao de plntulas de trevo subterrneo, obtidas por
germinao assptica de sementes desinfectadas. No sendo exequvel, por questes
essencialmente de tempo, a obteno pelos alunos de tais plntulas, procede-se demonstrao
da desinfeco e embebio de sementes para rpida germinao ( 24 horas), sendo
acompanhada com comentrios sobre a tcnica utilizada. Os alunos encontram, assim, na
bancada de trabalho caixas de Petri com sementes germinadas assepticamente sobre agar de
gua, com cerca de 1 cm de radcula e prontas a serem transferidas. Tambm os frascos com
areia e soluo nutritiva esto j previamente preparados e esterilizados.
Preparao de suspenses e inoculao de plntulas
(Mantenha cuidados de assepsia em toda a execuo do trabalho)

1. Observe os crescimentos obtidos nos diferentes meios de cultura inoculados na sesso
anterior, e , baseando -se no resultado dessa observao :
2. Escolha uma das placas MLA inoculada para crescimento em massa
3. Junte cerca de 20 ml de soluo salina no interior da caixa de Petri.
4. Com o auxlio da ponta de uma pipeta esterilizada, procure suspender a massa de clulas
que se encontra sobre o agar, de modo a obter uma suspenso densa.
73
5. Transfira a suspenso por pipetagem para um balo Erlenmeyer 150 ml esterilizado
6. Homogeneze a suspenso recorrendo ao enchimento e esvaziamento vigoroso da pipeta
para o interior do balo.
7. Repita vrias vezes este procedimento.
8. Com uma ansa esterilizada e arrefecida, transfira plntulas para frascos de areia com
soluo nutritiva.
9. Quando terminar a transferncia de plntulas inocule 10 frascos com 1 ml da suspenso
anteriormente obtida.
10. Elabore tratamentos testemunha no inoculados, com utilizao de soluo nutritiva de
Jensen com e sem azoto combinado e em nmero idntico ao dos inoculados.
11. Identifique claramente todos os frascos com data, espcime, tratamento e grupo de
trabalho.
12. Cubra os frascos com sacos de polietileno, fixando a boca do saco contra o frasco
utilizando um elstico.
13. Coloque todos os frascos no interior da cmara climatizada, procurando que a sua
distribuio seja feita ao acaso.
14. Programe as condies de temperatura e fotoperodo nas quais pretende o
desenvolvimento das plantas.
15. Inocule tubos com meio MLA com os isolamentos utilizados na inoculao de plntulas.
74
4 Sesso
Esta tem lugar 6 semanas aps a 3 sesso
Objectivo
Confirmao de isolamentos e avaliao da efectividade simbitica.
Material necessrio
Biolgico Diverso
Plantas de trevo subterrneo preparadas na 3 sesso Idntico ao da 1 sesso
desta Unidade Pedaggica Folhas de papel de
alumnio
Alfinetes ou fios de
Qumico cromonquel
Estufa ventilada
Idntico ao da 1 sesso
Procedimento
Avaliao da efectividade simbitica
1. Retire as plantas da cmara climatizada e remova os sacos de polietileno.

2. Separe as plantas pelos tratamentos realizados (inoculados, no inoculados sem azoto
combinado e no inoculados com azoto combinado)
3. Compare o desenvolvimento das plantas nos 3 tratamentos.
4. Proceda remoo da parte area das plantas, cortando-a junto ao colo.
5. Com papel absorvente retire as gotas de gua que eventualmente se encontrem sobre
folhas e caules.
6. Coloque cada uma das plantas recolhidas (s parte area) sobre um pedao de folha de
alumnio, dobre com cuidado e abra pequenos orifcios para circulao de ar.
7. Coloque as plantas assim acondicionadas na estufa ventilada a 65C.
8. Identifique claramente o material colocado na estufa.
Confirmao de isolamentos como Rh. leguminosarum bv. trifolii
1. Em gua corrente remova a areia dos frascos sorolgicos, retirando as razes com todo o
cuidado. (Proceda remoo de todas as partculas de areia tentando no as confundir
com ndulos)
2. Verifique a presena ou ausncia de ndulos em todas as razes, quer inoculadas quer no
inoculadas.
3. Escolha alguns dos ndulos obtidos, proceda ao seu esmagamento e com os macerados
resultantes, inocule meio MLA, procedendo de forma idntica ao trabalho realizado na 1
sesso.
75
5 Sesso
Objectivo
Continuao do trabalho da sesso anterior
Material necessrio
Biolgico Diverso
Crescimentos resultantes das inoculaes realizadas na Idntico ao da 1
sesso anterior sesso
Parte area das plantas recolhidas na sesso anterior Balana analtica
Esfregaos corados e guardados desde a 2 sesso. Exsicadores
Qumico
Idntico ao da 1 sesso
Procedimento
Avaliao da efectividade simbitica
1. Munindo -se de uma pina, retire da estufa ventilada os pequenos embrulhos contendo a
parte area das plantas utilizadas no ensaio
2. Coloque -as rapidamente no exsicador, no mantendo este aberto mais tempo que o
necessrio.
3. Dirija-se para a bancada onde se encontra a balana analtica e proceda pesagem de
cada um dos pequenos embrulhos, respeitando os procedimentos relativos abertura e
fecho do exsicador.
medida que so efectuadas as pesagens um outro colega de grupo:
4. Retira o contedo dos pequenos embrulhos
5. Limpa os envlucros colocando-os novamente dentro do exsicador.
6. Quando terminarem as pesagens dos embrulhos, iniciam-se as pesagens dos envlucros.
7. Tome nota dos valores das pesagens
8. Determine o peso seco da parte area das plantas utilizadas no ensaio.
Confirmao de isolamentos como Rh. leguminosarum bv.trifolii
1. Retire as placas de Petri com meio AML inoculadas na sesso anterior

2. Compare as caractersticas do crescimento colonial com as mesmas que anotou na 2 e 3
sesses.
3. A partir de colnias isoladas elabore esfregaos e faa a colorao de Gram, comparando
ao microscpio as preparaes agora obtidas com as da segunda sesso.
76
P17. BACTERIFAGO DE E. COLI
Introduo
Todos os vrus so parasitas intracelulares obrigatrios e so incapazes de se propagar em meios
nutritivos como acontece com grande nmero de bactrias e outras clulas. Cada tipo de vrus
requer um hospedeiro adequado para se replicar. H vrus que conseguem infectar diferentes
tipos de hospedeiros e outros de maior especificidade para um tipo particular de clulas.
No caso dos bacterifagos (="comedores de bactrias"), os hospedeiros nos quais se podem
multiplicar so bactrias.
Neste trabalho isolar-se-o bacterifagos de E. coli em placas de lise.
Suspenso de bacterifago ltico de E. Agar NZY (NZY contendo 1,5% de Bacto
Coli (-DASH) Agar)
Suspenso de cultura recente de E. coli TOP NZY (NZY contendo 0,7% de
(P2) agarose)
Meio de cultura NZY Soluo salina estril
NaCl 5 g MgSO4 10mM
MgSO4 7H2O 2 g Pipetas pasteur
Yeast extract 5 g Microtubos esterilizados
N7 amine (casein hy drolysate) 10 g Micropipetas (200 e 1000) e respectivas
H20 ad 1000 ml pontas esterilizadas
Procedimento (por grupo)
Preparao das bactrias:
1. Tomar 10 ml de meio de cultura lquido NZY adicionado de maltose a 0,2%

2. Adicionar 200 l clulas E.coli P2
3. Incubar a 37C durante uma noite sob agitao constante
4. Centrifugar 10 minutos a 1 000 rpm
5. Decantar e suspender o sedimento em 5ml 10mM MgSO4
6. Conservar a suspenso celular a 4C entre 2 horas (mnimo) at 1 ms (mximo)
Plaqueamento dos fagos:
7. Diluir a suspenso de fagos em gua estril:
Tubo # 1 2 3 4 5
Amostra inicial 100 l - - - -
Diluio anterior - 100 l 100 l 100 l
gua 900 l 900 l 900 l 900 l 900 l
-1 -2 -3 -4
Diluio fin al 10 10 10 10 -
77
8. Tomar 100 l clulas E.coli P2 (anteriormente preparadas) para tubo de ensaio
9. Adicionar 0,5 l de cada diluio dos fagos
10. Incubar a 37C durante 25 minutos
11. Adicionar 8 ml TOP NZY a 50C
12. Rodar tubo para misturar
13. Verter rapidamente sobre placas Petri contendo agar NZY
14. Deixar solidificar sobre a bancada (10 a 15 minutos)
15. Incubar em estufa a 37C durante uma noite
16. Observar as placas e registar as observaes
78
BACTERIFAGO DE E. COLI
Placa Amostra Nmero de placas Observaes
#1
#2
#3
#4
#5
Ttulo da suspenso inicial de bacterifagos: Unidade infecciosas / ml
Notas:
E:\U E\ Disciplinas\M icr-g eral\praticas \Textos de Apoio e Protocolos experimentais.doc
79
P18. ELISA (E NZYME LINKED IMMUNO SORBENT A SSAY )
Microplacas para ELISA (2 X 8 poos) Tampo de Lavagem, pH 7,2
Soluo de antignio a 1 mg/ml - 0,8% NaCl
Soro de cabra pr -imune (diludo a 1:100 - 0,02% KH2PO4
em Tampo de bloqueio) - 0,144% Na2HPO4.2.H2O
2. Anticorpo - Soro de coelho anti-cabra - 0,05% Tween 20
conjugado com peroxidase (RAGIG -HRPO) Tampo de Substrato, pH 5,0
(diludo em Tampo de bloqueio 1:20 000) - 1,118% Na2HPO4
Tampo de Fixao pH 9,6 - 0,56% cido ctrico
- 0,159% Na2CO3 Soluo OPD (extempor nea)
- 0,293% NaHCO3 OPD (O -fenileno-diamina) 20
- 0,02% NaN3 mg
Tampo de Bloqueio H2O2 10 l
- 0,5% BSA em PBS -A Tampo de substrato 60 ml
4N H2SO4
1. Distribuir 100 l de soluo de antignio por poo de microplaca

2. Incubar 4C durante, pelo menos 24 horas, ao abrigo da dissecao
3. Lavar trs vezes cada poo da microplaca com 200 l de Tampo de Lavagem, repousando
durante 3 min de cada vez
4. Distribuir 100 l de Tampo de Bloqueio. Incubar durante 30 minutos a 37C
5. Repetir Lavagem
6. Distribuir 100 l de Tampo de Bloqueio em cada poo (excepto poos 2)
7. Pipetar 100 l de soro pr-imune para poos 2
8. Pipetar 50 l de soro a testar para um poo 3. Homogeneizar.
9. Tomar sequencialmente 50 l de diluio do soro para o poo seguinte, conforme o
esquema:
A3 A4 A5 A6 A7 A8 B8 B7 B6 B5 B4 B3
1 2 3 4 5 6 7 8
-1 -1 -2 -2 -3
A 0 Neg. 3 x 10 10 3 x 10 10 3 x 10 10- 3
B 0 Neg. 10- 6 3 x 10-6 10- 5 3 x 10-5 10-4 3 X 10-4
80
10. Incubar 37C durante 30 minutos (ou a 4C durante uma noite), ao abrigo da dissecao
11. Repetir Lavagem
12. Distribuir 100 l da soluo do 2. Anticorpo por cada poo da microplaca
13. Incubar 37C durante 30 minutos, ao abrigo da dissecao
14. Repetir Lavagem
15. Adicionar 200 l de soluo OPD a cada poo
16. Incubar 37C durante 15 min, ao abrigo da dissecao e no escuro
17. Adicionar 50 l de H2SO4 por poo
18. Observar as intensidades de cor relativas
19. Avaliar ttulo aproximado do soro (ltima diluio positiva = diferente do controlo
negativo)
81
ELISA
Coluna A Coluna B
fila Amostra Resultado fila Amostra Resultado
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
Ttulo do soro:
Notas:
82
Representao grfica de uma ELISA
83

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Textos de apoio e Manual prtico

Carlos Sinogas, Lus Alho, Isabel Brito

Comportamentos em laboratrio de microbiologia .............................................................................3

Calor Calor seco (ar quente)

T UBOS DE CULTURA E PLACAS DE P ETRI

E STERILIZAO PELO CALOR

Aspectos da esterilizao por vapor-presso

A coagulao do protoplasma bacteriano em temperaturas moderadas requer humidade e h

O ar relativamente frio na cmara de esterilizao muito mais pesado que o vapor

Geralmente, os materiais mais volumosos requerem um maior tempo de esterilizao, sendo

Procedimento para operao da autoclave

E STERILIZAO POR GASES

C OMPONENTES PRINCIPAI S DO MICROSCPIO

Ampliao Ampliao final

Objectiva Distncia de trabalho Objectiva Distncia de trabalho

Benzeno Solvente orgnico incolor

Tipos de Colorao do meio envolvente das Nigrosina

Parede rgida Parede externa

O processo da colorao baseia-se na capacidade que certos microrganismos possuem em reter a

Meio definido Meio complexo

SEMENTEIRA POR ESPALHAMENTO

Para o sucesso no isolamento de colnias pela tcnica do espalhamento necessrio que o

SEMENTEIRA POR RISCADO

P1. MICRORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE

Incuo: Total de colnias:

Caracterizao das colnias observadas

gua de poa orgnica

Procedimento (por grupo)

3. Registe as intensidades de cor observveis nos diferentes tubos

5. Marque 5 tubos de ensaio (de 1 a 5)

9. A partir da soluo concentrada de azul-de -metileno proceda preparao de 5 ml de

Nmero de placas preparadas (A): Nmero de placas contaminadas (B):

Isolamento por riscado

Isolamento por placas de incluso

Preparao das lminas

1. Identificar lminas numa das extremidades

Colorao negativa (observao vital)

1. Identificar lminas numa das extremidades

1. Preparar uma suspenso bacteriana em tinta-da-china (como atrs)

(respeitar rigorosamente os tempos indicados)

3. Homogeneizar bem cada diluio antes de tomar a amostra para a seguinte.

Avaliao em Cmara de Contagem

Contagem de viveis (espalhamento)

Contagem de viveis (incorporao)

Contagens viveis (espalhamento ou incorporao)

1 aperto 2 aperto Cultura 3 aperto Cultura

1 aperto 2 aperto Cultura 3 aperto Cultura

Amostra Aspecto do crescimento bacteriano Observaes

(Marcar convenientemente todos os tubos a usar)

1. Tomar um tubo contendo agar nutritivo fundido (no banho -maria)

Incuo / Meio de cultura pH Temperatura Resultado Observaes

Teste de susceptibilidade (Uma bactria por grupo)

1. Transferir 10 ml de soluo salina estril sobre placa com crescimento bacteriano

Sensibilidade relativa aos antibiticos testados

Determinao NMP (Nmero Mais Provvel)

1. Marcar e identificar os tubos com caldo de lactose:

1. Montar assepticamente a membrana no sistema de filtrao

Tubos Positivos Negativos NMP / 100 ml

Filtrao por membrana

Volume filtrado Nmero de coliformes

1. Transferir 10 ml de cada leite por tubo de ensaio