UNIVERSITATEA DE MEDICIN

I FARMACIE DIN CRAIOVA

Mihail-Virgil BOLDEANU

STUDIUL CLINICO-EPIDEMIOLOGIC I IMUNOLOGIC

AL BOLILOR INFLAMATORII INTESTINALE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conductor tiinific:
Prof. univ. dr. Tudorel CIUREA

Craiova
2014
 UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE DIN CRAIOVA

COALA DOCTORAL

Mihail-Virgil BOLDEANU

STUDIUL CLINICO-EPIDEMIOLOGIC I IMUNOLOGIC

AL BOLILOR INFLAMATORII INTESTINALE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conductor tiinific:
Prof. univ. dr. Tudorel CIUREA

Craiova
2014
 LIST DE ABREVIERI

MMP Matrix metalloproteinases, metaloproteinaze matriceale

IL Interleukine

CRP Proteina C reactiv

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IBD1 Identity By Descent

NOD2/CARD Nucleotide-binding Oligomerization Domain 2 / Caspase-

15 Activating Recruitment Domain 15

GWAS Genome-wide association studies, studii de asociere la

nivelul intregului genom,

OCTN Organic cation transporter

DLG Drosophila Large Discs Homologue

MDR Multidrug resistance

ICAM Moleculele de adeziune intercelular

TGF Transforming growth factor beta

TNF Tactorul de necroz tumoral alfa

CCR Receptori ai chemokinelor

CD Cluster designation

ROC Receiver-operator characteristic

-2-
 INTRODUCERE

Bolile inflamatorii intestinale (BII) sunt, n termeni generali afeciuni cronice,

inflamatorii idiopatice, ale cror efecte primare se observ n cadrul tractului gastro-
intestinal, dar pot avea de asemenea manifestri grave extraintestinale. BII sunt
afeciuni inflamatorii progresive, recurente, de etiologie necunoscut, ce afecteaz n
special populaia tnr, activ socio-profesional. Influeneaz calitatea vieii ducnd la
invaliditi cronice i costuri mai mari ale sistemelor de sntate.

BII reprezint afeciuni care pot aprea n orice moment de-a lungul vieii, din
copilrie pn la vrsta adult, dei sunt studii care arat c peste 80% din cazuri sunt
diagnosticate n prezent n cea de a doua sau a treia decad de via. BII au o incident
i o prevalen n cretere la nivel mondial, n special n rile occidentale fiind n
strns legatur cu progresele socio-economice.

Elucidarea factorilor imunologici i genetici, cu rol important n patogeneza

acestor afeciuni, indic mai multe puncte unde cascada inflamatorie poate fi ntrerupt,
rezultnd posibilitatea de terapii intite pentru BII. Astfel, descoperiri recente au condus
la apariia de noi medicamente terapeutice care regleaz activarea rspunsului imun
celular i inflamaia mucoasei intestinale (terapia biologic cu anticorpi anti factorul de
necroz tumoral alfa, anti-TNF, asociat imunosupresoarelor). Aceast terapie
biologic a schimbat abordarea pacientului, stabilindu-se noi obiective terapeutice care
s duc la vindecarea mucosal i modificarea istoriei naturale a bolii.

Toate aceste progrese nregistrate n ultimii ani n domeniul imunologiei i

geneticii, alturi de noile tehnici endoscopice i metodele minim invazive de
diagnostic, ajut n definirea corect a fenotipului de boal i n conturarea unor noi
sisteme de clasificare a BII care s cuprind pe lng clasificarea clinic i datele
serologice i genetice noi descoperite.

-3-
 Tema de cercetare propus este de actualitate i prezint un deosebit interes
tiinific pentru c realizeaz o analiz complex din punct de vedere epidemiologic,
fenotipic i serologic a pacienilor cu boli inflamatorii intestinale. Originalitatea
studiului const n determinarea profilului serologic al pacienilor, asocierea ntre
dinamica concentraiilor serice ale acestor markeri serologici i diferitele fenotipuri
clinice de boal i prezena de corelaii ntre activitatea bolilor inflamatorii intestinale
la aduli i concentraiile serice ale MMP. Datorit sensibilitii i specificitii
superioare, markerii serologici analizai (MMP-3, MMP-9 i IL-13) pot fi considerai
ca o alternativ diagnostic sau suplimentar la CRP, VSH i ali indici inflamatori de
boal, n diagnosticul bolilor inflamatorii intestinale, ct i n scop prognostic pentru
predicia evoluiei bolii i n orientarea terapeutic.

Cuvinte cheie : ELISA, metaloproteinaze matriceale, interleukine, curba ROC,

acuratee diagnostic.

I. STADIUL CUNOATERII

Capitolul I - Epidemiologia bolilor inflamatorii intestinale prezint date

recente referitoare la incidena i prevalena acestor entiti, cum influeneaz vrsta,
sexul, diferenele rasiale/etnice aceti parametri epidemiologici i evoluia BII, n lume
i Romnia. Au fost observate variaii geografice ale BII i s-au constatat un gradient
nord-sud i vest-est al incidenei i prevalenei acestor afeciuni la nivel mondial.

Capitolul II - Etiopatogeneza bolilor inflamatorii intestinale trece n revist

principalele mecanisme etiopatogenice implicate n BII, fiind considerate boli
multifactoriale.

Cauzele exacte i mecanismele etiopatogenice care duc la distrugerile tisulare sunt

extrem de complexe i incomplet cunoscute pn n prezent. n ultimul deceniu s-a
intensificat cercetarea tiinific a acestor afeciuni, s-au formulat mai multe

-4-
teorii/ipoteze care s explice mecanismele etiopatogenezei i au aprut suficiente
progrese pentru a accepta urmtoarea ipotez ca fiind valabil : BII constituie un
rspuns imun inadecvat care apare la indivizii susceptibili genetic, ca rezultat al unei
interaciuni complexe ntre evoluia schimbrilor de mediu induse de progresul
societii, microflora intestinal diferit n mod constant i hiperactivarea sistemului
imun intestinal individual. Toate acestea au ca finalitate pierderea homeostaziei i a
funciei de barier a mucoasei intestinale, afectarea tisular mediat imun i apariia
manifestrilor clinice. Datele experimentale i observaiile clinice, obinute prin
studierea mecanismelor imune alterate i a inflamaiei intestinale pe modele animale, la
care s-a indus i generat un model de boal, au contribuit la nelegerea patogenezei
BII. Aceste mecanisme imune alterate au la baz defecte nnscute sau dobndite ale
sistemului imun, avnd ca trigger declanator microflora intestinal.

Capitolul III - Susceptibilitatea genetic n bolile inflamatorii intestinale

prezint date privind rolul factorilor genetici i principalele gene de susceptibilitate
implicate n patogeneza BII.

n paralel cu cercetrile din domeniul imunologiei, o contribuie important n

studierea patogenezei BII a avut i domeniul geneticii moleculare. Studiile
epidemiologice i de migraie a populaiei au evideniat diferene semnificative ale
incidenei i prevalenei BII n ceea ce privete distribuia geografic i etnic. Aceste
observaii au condus la formularea de noi ipoteze, aa cum ar fi rolul posibil al
factorilor genetici n patogeneza BII. Pentru a dovedi aceast ipotez s-au realizat
iniial studii privind agregarea familial, urmate de studiile pe gemenii monozigoi i
dizigoi. Au urmat, ncepnd cu anii 2000 studiile de linkage genetic pe cohorte de
pacieni nrudii ce au condus la identificarea locusului IBD1 de pe cromozomul 16 i la
descoperirea primei gene de susceptibilitate pentru BC, gena NOD2/CARD15. Dar cele
mai importante progrese in domeniul geneticii moleculare au fost trecerea de la analiza
genelor candidate la studii de asociere la nivelul intregului genom, GWAS, ce au permis

-5-
identificarea a mii de polimorfisme n genomul uman i peste 160 de noi gene de
susceptibilitate pentru BII.

ncepnd cu anul 1996 studiile de linkage genetic, de scanare a genomului uman,

utiliznd ca markeri microsatelii ADN, au contribuit la identificarea mai multor
regiuni de susceptibilitate pentru BC situate pe mai muli cromozomi 1, 3, 4, 5, 6, 7, 10,
12, 14, 16, 19 i X . Ulterior, regiuni/locusuri de pe cromozomii 16, 12, 6, 14, 5, 19 i 1
au fost redenumite ncepnd cu IBD1 pn la IBD7 i numai locusurile IBD1, IBD2,
IBD3 i IBD4 au fost replicate n studii (Tabelul 1).

Regiunea Localizare Gene implicate

IBD 1 Cromozomul 16 NOD2/CARD15, IL-4R, CD11B

IBD 2 Cromozomul 12 Receptorul vit. D, STAT 6, Interferon

IBD 3 Cromozomul 6 Complexul major de histocompatibilitate (MHC)

IBD 4 Cromozomul 14 Receptorul Ly T (TCR)

IBD 5 Cromozomul 5 OCTN, DLG5, MDR1, IL-6, CD14

IBD 6 Cromozomul 19 Tromboxan A2, Leucotriena B4, ICAM-1

IBD 7 Cromozomul 1 TGF, Receptorii TNF

IBD 8 Cromozomul 16 -

IBD 9 Cromozomul 9 Receptorii pentru chemokine (CCR-5, CCR-9), IL-

12

Tabelul 1 . Regiunile i genele importante implicate n BII

(Adaptat dup Zheng CQ) [1].

n Capitolul IV intitulat Markerii serologici n bolile inflamatorii intestinale

sunt prezentai cei mai importani markeri serologici studiai n bolile inflamatorii
intestinale i corelaiile lor cu anumite fenotipuri de boal.

-6-
 MMP sunt o familie de endopeptidaze Zn+ i Ca dependente, considerate a fi cele
mai puternice proteaze ce controleaz homeostazia proteinelor matricei extracelulare,
inclusiv reglarea funciei celulare, creterea, diviziunea celular, reglarea aprrii
nnscute i dobndite a gazdei, ct i controlul sintezei matricei extracelulare.

n ultimii ani multe studii au avut ca obiectiv nelegerea implicrii MMP n

homeostazia intestinal, dar i rolul i funcia lor n BII. Mai multe metaloproteinaze
matriceale (MMP-1, -2, -3, -8, -9, -12, MT-MMP-1) au fost raportate a fi implicate n
patogeneza colitelor induse la o mare varietate de modele animale. De asemenea,
studiile au artat c nivelurile crescute ale MMP se coreleaz direct proporional cu
activitatea bolii. Dintre MMP, MMP-3 i MMP-9 au avut o exprimare predominant n
majoritatea studiilor efectuate pe colitele induse, la animalele de laborator, cu sulfat de
sodiu dextran, acid trinitrobenzensulfonic i Salmonella typhimurium. MMP-3 i
MMP-9 au fost asociate cu leziuni la nivelul mucoasei colonului i cu apariia
complicaiilor, fistule, la pacienii cu BC.

Capitolul V - Clasificarea fenotipic a bolilor inflamatorii intestinale

prezint clasificarea fenotipic Montreal a celor dou entiti clinico-patologice de BII.

-7-
 II. CONTRIBUII PROPRII

Capitolul VI - SCOPUL I OBIECTIVELE STUDIULUI

Obiectivul tezei l constituie analiza complex din punct de vedere epidemiologic,

fenotipic i serologic a pacienilor cu BII (BC i CU), n Centrul de referin Craiova,
judeul Dolj. Proiectul de cercetare tiinific se axeaz pe urmtoarele obiective
specifice :

Analiza principalilor parametri epidemiologici (incidena, prevalena) n BII i a

tendinelor de modificare a acestora n judeul Dolj ;
Evaluarea caracteristicilor fenotipice ale pacienilor cu BII n ceea ce privete
vrsta de debut, localizarea, severitatea leziunilor inflamatorii i complicaiile
intestinale i extra-intestinale ;
Determinarea profilului serologic al pacienilor cu identificarea de asocieri ntre
dinamica concentraiilor serice ale acestor markeri serologici i diferitele
fenotipuri clinice de boal i stabilirea de corelaii ntre markerii serologici i
severitatea puseului de activitate al BII prin :
- cuantificarea MMP-3 (Stromelizina 1), MMP-9 (Gelatinaza B), cu rol n
distrucia tisular i a componentei matricei extracelulare ;
- msurarea nivelurilor unor citokine (citokina pro-inflamatoare IL-17 i a
citokinei anti-inflamatoare IL-13), cu rol n iniierea mecanismelor imuno-
patogenice ;
- msurarea CRP, prin determinare nalt specific (hs-CRP), marker important n
cuantificarea rspunsului inflamator.
Evaluarea acurateei diagnostice a determinrii metaloproteinazelor matriceale i a
interleukinelor comparativ cu determinarea CRP, folosind analiza prin curba ROC.

-8-
 Capitolul VII MATERIAL I METOD

VII.1. Stabilirea loturilor i includerea pacienilor n studiu

n acest studiu au fost inclui 67 de pacieni diagnosticai cu BC i CU, pe baza
istoricului, examenului clinic, a endoscopiei digestive inferioare i a examenului
anatomopatologic al pieselor de biopsie. Pacienii cuprini n acest studiu au fost
diagnosticai n Clinica Gastroenterologie a Spitalului Clinic Judeean de Urgen
Craiova, n intervalul octombrie 2011- mai 2014.

Pentru analiza comparat a fost constituit un lot control (pacieni fr BII active
sau n antecedente) format din 30 de subieci sntoi selecionai din pacienii
investigai pentru alte afeciuni digestive, tot n Clinica de Gastroenterologie. Ambele
loturi au fost stabilite pe baza unor criterii de includere i excludere. Att pacienii cu
BII ct i subiecii control au semnat un consimmnt informat de includere n studiu.
Pentru fiecare pacient cu BII s-a ntocmit un formular structurat care a cuprins
informaii de contact, date demografice, antecedente heredo-colaterale i personale
patologice, manifestri clinice, analize de laborator, clasificarea fenotipic Montreal,
complicaii intestinale i extraintestinale, clasele de medicamente utilizate i schema de
tratament actual.

VII.2. Recoltarea probelor i materialul biologic

La pacienii din ambele loturi (lotul cu BII i lotul control) materialul biologic a
fost reprezentat de snge (aproximativ 5 ml de snge venos) recoltat n eprubete fr
coagulant. Dup recoltare, a urmat separarea cheagului prin centrifugare (15 min la
1500 rpm) n cel mult 4 ore de la recoltare, dup procedura standard. Tuburile cu ser au
fost nchise etan, pentru a evita contaminarea i depozitate la temperaturi ntre +2C i
+8C timp de 3 zile dac probele s-au lucrat imediat sau au fost congelate la cel puin -
20C i chiar -80C dac probele s-au lucrat la un interval de timp mai mare. Probele au
fost codificate cu litere i numere acordate n ordinea recoltrii.

-9-
VII.3. Determinarea prezenei i a concentraiilor markerilor serologici
Determinarea profilului serologic al pacienilor cu BII, precum i identificarea de
asocieri ntre dinamica concentraiilor serice ale markerilor serologici i diferitele
fenotipuri clinice de boal i stabilirea de corelaii ntre markerii serologici i
severitatea puseului de activitate al BII, s-au realizat n Laboratorul de Imunologie din
cadrul UMF din Craiova. Pentru dozarea cantitativ a IL-17, IL-13, MMP-3, MMP-9,
CRP am utilizat tehnica ELISA.
VII.4. Analiza statistic
Informaiile obinute au fost stocate n fiiere Microsoft Excel, fiind apoi
prelucrate statistic, n vederea analizrii relaiilor dintre datele clinice i paraclinice ale
pacienilor. Sistemul de management a datelor pacienilor precum i prelucrarea acestor
date s-a efectuat folosind programul Microsoft Excel, mpreun cu suita XLSTAT
pentru MS Excel, iar analiza statistic a fost fcut cu ajutorul softurilor dedicate
calculelor statistice tiinifice, GraphPad Prism 5 i IBM SPSS Statistics 20.0. Am
folosit analiza prin curba ROC pentru a detecta posibile valori prag, cut-off, pe care s
le folosim n practic pentru a face separarea pacienilor cu afeciuni inflamatorii
intestinale de pacienii fr o astfel de patologie.

Capitolul VIII ASPECTE EPIDEMIOLOGICE N BII

Cerectarea noastr reprezint primul studiu epidemiologic efectuat n centrul nostru

de referin i furnizeaz primele date epidemiologice, caracteristice pacienilor
diagnosticai cu BII :
1. Datele sunt n concordan cu observaiile anterioare furnizate de studiile efectuate
n Centrul de referin Bucureti i confirm incidena anual medie redus a BC i
a CU n judeul Dolj (0.82/10 locuitori, respectiv 1.26/10) (Figura 1) [2,3].
2. Am constatat o inciden mai mare a CU comparativ cu BC.

- 10 -
3. BC a debutat la o vrst mai tnr (vrsta medie de 39.52 ani) comparativ cu cea
din populaia vestic sau central European, avnd o distribuie echilibrat cu o
uoar preponderen a sexului feminin i cu un singur vrf de inciden [4-10].
4. CU a avut o vrst de debut (vrsta medie de 44.80 ani) similar cu cea din
populaia vestic [4-10], cu o distribuie bimodal (intervalele 20-29 ani i 50-59
ani) a incidenei la femei i repartiie egal pe sexe.
5. Incidena BC este nesemnificativ mai mare n mediul rural comparativ cu mediul
urban. n mediul urban se constat incidena crescut a CU, semnificativ statistic
(p=0.013), fa de mediul rural.

1,6
1,33
1,4
1,33 1,14
1,2
1,14
1,0
INCIDENTA

0,95
0,8

0,6

0,4
0,38
0,2

0,0
Oct 2011 - Sep 2012 Oct 2012 - Sep 2013 Oct 2013 - Mai 2014
Incidenta CU Incidenta BC

Figura 1. Evoluia incidenei anuale a CU i BC

- 11 -
 Capitolul IX. PARTICULARITI FENOTIPICE ALE PACIENILOR N
BOLILE INFLAMATORII INTESTINALE

Pentru analiza particularitilor fenotipice ale pacienilor diagnosticai cu BII, am

studiat dou loturi de pacieni :

Lotul 1 - reprezentat de 21 pacieni aduli cu BC (toi pacienii cunoscui sau nou-

diagnosticai), internai i investigai n Clinica Gastroenterologie a Spitalului Clinic
Judeean de Urgen Craiova n perioada analizat octombrie 2011 mai 2014.
Datele au fost preluate i analizate din documentele medicale existente, aflate n
arhiva Clinicii. Fiecare pacient a fost ncadrat conform clasificrii Montreal n
funcie de : vrsta la diagnostic (A1: < 16 ani, A2: 17- 40 ani, A3: > 40 ani),
localizarea leziunilor (L1: ileal, L2: colonic, L3: ileo-colonic, L4: tub digestiv
superior, p: perianal) i patternul (tipul) leziunilor (B1: non-stenozant, non-
penetrant, B2: stenozant, B3: penetrant). Pentru fiecare caz a fost calculat scorul
Harvey-Bradshaw (HBI), util n evaluarea pacienilor n funcie de severitatea
puseului de activitate a bolii. n funcie de scorul obinut fiecare pacient a fost
ncadrat n tipul de activitate corespunztor, astfel: scor HBI = 5-7, activitate uoar;
scor HBI = 8-16, activitate moderat ; scor HBI = > 16, activitate sever [11].

Lotul 2 - reprezentat de 46 pacieni aduli cu CU (toi pacienii cunoscui sau nou-

diagnosticai), internai i investigai de asemenea n Clinica Gastroenterologie, n
aceeai perioad analizat, octombrie 2011 mai 2014. i pentru acest lot s-a
procedat la fel, fiecare caz a fost ncadrat conform clasificrii Montreal n funcie de
extensia leziunilor : E1 - proctit, E2 - colit stng, E3 - colit extins. Pentru
clasificarea cazurilor n funcie de severitatea bolii am utilizat scala TRUELOVE-
WITTS (TWI). n funcie de scorul obinut fiecare pacient a fost ncadrat n tipul de
activitate corespunztor, astfel : scor TWI = < 5, activitate uoar ; scor TWI = 5-9,
activitate moderat ; scor TWI = > 9, activitate sever [12].

- 12 -
 Rezultate

1. n judeul Dolj, la nivelul centrului nostru, observm c vrsta de debut pentru cele
dou entiti clinico-patologice este cu 5 ani mai mare comparativ cu vrsta rilor
Central i Vest Europene. Se constat o tendin de apariie a CU la vrste mai
tinere n ultimii ani [4, 5, 14, 15].
2. Peste jumtate din cazurile nou-diagnosticate cu BC au prezentat afectarea colonic.
Colita stng a predominat la pacienii cu CU. Observm o progresie fenotipic a
bolii n timp, la pacienii nou-diagnosticai cu colit scade ponderea colitei stngi, se
dubleaz ponderea colitelor extinse i se nregistreaz cazuri de proctit (Figurile 2, 3 i 4).

70,00%

60,00%
52,38%
50,00%

40,00%

30,00% 23,81% 23,81%

20,00%

10,00%

0,00%
L1 -Ileon L2 - Colon L3 - Ileon si colon

Figura 2. BC Clasificarea Montreal L clasificarea pacienilor

n funcie de localizarea leziunilor

- 13 -
 80,00%
71,74%
70,00%

60,00%

50,00%

40,00%

30,00%
17,39%
20,00% 10,87%
10,00%

0,00%
E1 (proctita) E2 (colita stg) E3 (colita extinsa)

Figura 3. CU Distribuia cazurilor n funcie de localizarea leziunilor

100,00%
88,46%

80,00%

60,00%
50%

40,00%
25% 25%
11,54%
20,00%
0
0,00%
Cazuri noi Cazuri diagnosticate > 5 ani

E1 E2 E3

Figura 4. CU Localizarea leziunilor la pacienii cu diagnostic mai vechi de 5 ani

vs cazuri nou-diagnosticate
(E1: proctit, E2: colit stng, E3: colit extins, p=0.0067)

- 14 -
3. Fenotipului non-stenozant, non-penetrant (forma inflamatorie) este cel mai frecvent
ntlnit n BC (Figura 5).

70,00% 61,90%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00% 23,81%
20,00% 14,29%
10,00%
0,00%
B1 - Non- B2 - Stenozant B3 - Penetrant
stenozant / non-
penetrant

Figura 5. BC Clasificarea Montreal B clasificarea pacienilor

in funcie de patternul leziunilor

4. Formele uoare i moderate au predominat n ambele entiti.

5. Absena manifestrilor perianale, frecvena sczut a complicaiilor intestinale i a

celor extra-intestinale n lotul nostru, sugereaz o evoluie blnd a BC i a CU n
centrul nostru (judeul Dolj). Datele sunt mici n comparaie cu cele comunicate n
literatura Vest European.

- 15 -
 Capitolul X. ASPECTE SEROLOGICE N BII

Dozarea cantitativ a IL-17, IL-13, MMP-3, MMP-9, CRP s-a realizat utiliznd
kituri ELISA, furnizate de INVITROGEN Corporation (Camarillo, CA, USA),
urmrind protocolul de lucru, conform recomandrilor productorului. Valorile au fost
exprimate n pg/mL (IL-13, IL-17, MMP-9), ng/mL (MMP-3) i mg/mL (CRP). Pentru
identificarea de asocieri ntre concentraiile acestor markeri serologici i diferitele
fenotipuri clinice de boal, att pentru BC ct i pentru CU, am utilizat datele furnizate
de clasificarea Montreal.

Pentru analiza statistic a rezultatelor am verificat distribuia gaussiana a valorilor

din seriile obinute cu ajutorul testelor de normalitate Kolmogorov-Smirnov sau
D'Agostino & Pearson. Astfel concentratiile serice ale MMP-3 au avut o distribuie
normal dup log-transformare (din considerente statistice i de aspect, prin logaritmare
se reduce plaja valorilor, pstrnd raporturile iniiale), n timp ce concentraiile
celorlali markeri serologici, MMP-9, IL-13, IL-17 i CRP, la analiza cu testul de
normalitate D'Agostino & Pearson au avut o distribuie gaussiana. Toate valorile au fost
exprimate prin media aritmetic (mean), nsoit de intervalul de ncredere de 95%
(95% CI).

Rezultate

Asocieri ntre dinamica concentraiilor serice i diferite profiluri fenotipice n

BII

1. Studiul realizat n Centrul nostru a subliniat asocierea anumitor caracteristici

fenotipice cu markerii serologici analizai, la pacienii cu BII.
2. Pentru prima dat am demonstrat prezena concentraiilor semnificativ mai mari
ale MMP-3, MMP-9, IL-13, IL-17 i CRP n serul pacienilor cu BII, comparativ
cu lotul control.

- 16 -
 3. Concentraii semnificativ mai mari ale MMP-3 s-au observat la pacienii cu debut
peste 40 ani (A3) a BC, la cei cu afectare colonic (L2), cu pattern non-stenozant,
non-penetrant (B1) i penetrant/fistulizant (B3) i la pacienii cu extensie la nivelul
colonului stng (E2) a CU.
4. Nivelurile serice ale MMP-9 s-au asociat cu debutul precoce al BC (sub 40 ani), la
cei cu afectare ileal (L1), cu pattern stenozant (B2) i la pacienii cu localizare
stng a colitei (E2).
5. Citokina anti-inflamatoare IL-13 a prezentat valori serice semnificativ mai mari la
pacienii cu debut peste 40 ani, cu afectare ileal i la pacienii cu colit stng.
6. Citokina pro-inflamatoare IL-17 s-a asociat cu debut sub 40 ani a BC, cu
localizarea colonic i ileo-colonic i cu proctitele.
7. Singurele concentraii serice semnificativ mai mari ale CRP au fost asociate colitei
extinse.

Asocieri ntre dinamica concentraiilor serice i activitatea clinic n BII

Analiza complex a celor dou loturi incluse n studiu (lotul 1, pacieni

diagnosticai cu BC, respectiv lotul 2, pacienii cu CU) a cuprins i investigarea
existenei diferitelor asocieri ntre concentraiile markerilor serologici i severitatea
puseelor de activitate clinic, pentru fiecare entitate clinic. Severitatea puseului de
activitate clinic a fost estimat abordnd dou scale/scoruri (HBI respectiv TWI)
utilizate n practica medical curent, pentru evaluarea pacienilor, dar i pentru
monitorizarea evoluiei i aprecierea eficienei schemelor terapeutice. n funcie de
scorul obinut fiecare pacient a fost ncadrat n tipul de activitate corespunztor

Distribuia pacienilor n funcie de entitatea clinico-patologic i severitatea

puseului de activitate clinic, n funcie de scorul obinut, este prezentat n Tabelele 2
i 3.

- 17 -
 Lotul 1 Pacieni diagnosticai cu BC
Activitate HBI Nr. %
pacieni
Scorul Harvey-Bradshow Activitate uoar 6.00 (5.24-6.75) 7 33.33
(Severitatea puseului Activitate moderat 12.56 (10.67-14.44) 9 42.86
de activitate) Activitate sever 18 (16.76-19.24) 5 23.81

Tabelul 2. Distribuia pacienilor cu BC n funcie de severitatea puseului de activitate

Lotul 2 Pacieni diagnosticai cu CU

Activitate TWI Nr. %
pacieni
Scala Truelove-Witts Activitate uoar 3.20 (2.89-3.51) 15 32.61
(Severitatea puseului de Activitate moderat 7.23 (6.72-7.74) 22 47.83
activitate)
Activitate sever 11.33 (10.18-12.49) 9 19.56

Tabelul 3. Distribuia pacienilor cu CU n funcie de severitatea puseului de activitate

Comparnd concentraiile markerilor analizai, am constatat c valorile lor serice n

subgrupurile de pacieni cu activitate uoar, moderat i sever au fost semnificativ
mai mari, comparativ cu lotul control (p< 0.0001). Concentraiile serice ale MMP-3.
MMP-9, IL-13, IL-17 i CRP pentru BC respectiv CU sunt evideniate n Tabelele 4 i
5.

- 18 -
 Parametru Activitate Activitate Activitate Lot
(mean SD) sever moderat uoar control

MMP-3 (ng/ml) 9.69 1.40 9.88 1.60 7.00 2,27 3.23 0.86
MMP-9 (pg/ml) 544,42 189,30 531.90 109,80 505,60 67,91 112.20 21.10

IL-13 (pg/ml) 65,78 21,54 82,11 19,42 64,83 25,52 26.16 4.64

IL-17 (pg/ml) 53,99 4,54 58,55 34,42 45,74 7,61 34.08 10.33

hs-CRP (mg/ml) 13,00 4,80 9,00 4,87 7,14 2,12 5.17 3.48

Tabelul 4. Concentraiile markerilor serologici n funcie de diferite

stadii de activitate clinic a BC

Parametru Activitate Activitate Activitate Lot

(mean SD) sever moderat uoar control

MMP-3 (ng/ml) 7.08 3.76 5.89 3.34 3.60 1,17 3.23 0.83
MMP-9 (pg/ml) 683.50 93.61 646.13 101.20 519.19 17.39 112.20 21.10

IL-13 (pg/ml) 61.81 22.48 64.62 31.15 57.40 33.29 26.16 4.64

IL-17 (pg/ml) 42.32 5.32 47.76 10.83 34.48 15.42 34.08 10.33
hs-CRP (mg/ml) 16,11 10.06 10.86 6.47 7.17 5.20 5.17 3.48

Tabelul 5. Concentraiile markerilor serologici n funcie de diferite

stadii de activitate clinic a CU

n studiul nostru, am identificat i asocieri semnificative ale MMP-3, MMP-9, IL-

13, IL-17 i CRP cu diferite stadii de activitate clinic a BC i CU.

- 19 -
BOALA CROHN - am observat c MMP-3 a avut o cretere pn la stadiul
moderat de activitate, cu o scdere ulterioar n stadiul sever. Diferene
semnificative statistic au fost ntre concentraiile MMP-3 din serul pacienilor cu
activitate sever i activitate moderat vs activitate uoar (Figura 6).

Spre deosebire de MMP-3, n cazul MMP-9 concentraiile serice au crescut

direct proporional cu activitatea BC, cele mai mari concentraii avnd pacienii cu
activitate sever de boal. Singura diferen care a atins semnificaie statistic s-a
observat ntre concentraiile MMP-9 din serul pacienilor cu activitate sever vs
activitate uoar (Figura 7).

Datele obinute de noi sunt n concordan cu observaiile din literatura de

specialitate, prezentate anterior [16-20].

100

Activ itate mode rata vs activ itate usoara

p=0.008
log-MMP3 ng/mL

Activ itate se v e ra vs activ itate usoara

p=0.049

10

1
Control Usoara Moderata Severa
3.23 7.00 9.88 9.69
(2.03-4.88) (3.50-10.67) (7.94-12.60) (7.27-10.69)

Activitate BC

Figura 6. Concentraiile MMP-3 n serul pacienilor aflai n diferite stadii de

activitate clinic a BC vs lotul control

- 20 -
 1000
Activitate sev e ra vs activitate usoara
p=0.049

800
MMP-9 pg/mL

600

400

200

0
Control Usoara Moderata Severa
112.20 505.60 531.87 544.42
(90.75-155.15) (379.85-600.50) (397.56-718.39) (362.38-794.76)
Activitate BC

Figura 7. Concentraiile MMP-9 n serul pacienilor aflai n diferite stadii de

activitate clinic a BC vs lotul control

Pentru cele dou citokine, IL-13 i IL-17, am observat concentraii n cretere, cu

un maxim n grupul pacienilor cu activitate moderat a BC, urmnd o uoar
scdere n grupul pacienilor cu activitate sever. Semnificaie statistic au atins
nivelurile din grupurile cu activitate moderat vs activitate sever i activitate
moderat vs activitate uoar (pentru IL-13) i ntre concentraiile din serul
pacienilor cu activitate sever i activitate moderat vs activitate uoar (n cazul
IL-17). Pentru cele dou citokine nu am gasit date n literatura de specialitate la care
s ne raportm.

CRP a prezentat niveluri serice ce au crescut mpreun cu activitatea bolii,

diferene semnificative statistic fiind doar ntre grupul pacienilor cu activitate
sever vs activitate uoar.

- 21 -
COLITA ULCERATIV - ambele proteinaze, MMP-3 i MMP-9, au prezentat
concentraii serice care au crescut direct proporional cu activitatea bolii, cele mai
mari concentraii avnd pacienii cu activitate sever de boal. Att MMP-3 ct i
MMP-9 au prezentat diferene semnificative statistic ntre concentraiile din serul
pacienilor cu activitate sever i activitate moderat vs activitate uoar. Datele
obinute n studiul nostru sunt n concordan cu datele recent publicate n literatura
de specialitate [16-20].

Concentraiile IL-13 i IL-17 n serul pacienilor cu CU, au prezentat un trend

asemntor celor din lotul cu BC, cu un maxim n grupul pacienilor cu activitate
moderat, urmnd o uoar scdere n grupul pacienilor cu activitate sever.
Semnificaie statistic s-a atins doar n cazul IL-17, ntre nivelurile din serul
pacienilor cu activitate sever i activitate moderat vs activitate uoar (Figurile 8,
9).

CRP a nregistrat n serul pacienilor cu CU o cretere direct proporional cu

severitatea puseului de activitate, niveluri maxime avnd pacienii din grupul cu
activitate sever. CRP s-a asociat cu niveluri semnificative la pacienii din grupurile
cu activitate sever i moderat vs activitate uoar. Datele sunt n concordan cu
observaiile anterioare din literatura de specialitate [369].

- 22 -
 160 p> 0.05

120
IL-13 pg/mL

80

40

0
Control Usoara Moderata Severa
26,16 57,40 64,62 61,81
(18,00-33,00) (21,75-142,86) (30,00-136,65) (26,25-104,04)

Activitate CU

Figura 8. Concentraiile IL-13 n serul pacienilor aflai n diferite stadii de

activitate clinic a CU vs lotul control

100 Activ itate se v e ra vs activ itate usoara

p=0.0483

Activ itate mode rata vs activ itate usoara

80 p=0.0065
IL-17 pg/mL

60

40

20

0
Control Usoara Moderata Severa
34,08 34,48 47,76 42,32
(15,18-50,08) (17,35-68,00) (34,92-76,81) (34,92-49,67)
Activitate CU

Figura 9. Concentraiile IL-17 n serul pacienilor aflai n diferite stadii de

activitate clinic a CU vs lotul control

- 23 -
 Corelaii n BII

Studiul profilului serologic al pacienilor diagnosticai cu bolile inflamatorii

intestinale, a continuat cu un alt obiectiv specific, acela de a stabili corelaii ntre
markerii serologici investigai (MMP, IL i CRP) i ntre markerii serologici i
scorurile HBI respectiv TWI de evaluare a severitii puseului de activitate a bolii.

Folosind softul GraphPad Prism 5 am calculat coeficientul de corelaie Pearson i

am demonstrat prezena de corelaii ntre concentraiile serice ale MMP-3, MMP-9
cu activitatea BII la aduli (scorurile HBI, respectiv TWI) i cu ceilali indici
evaluai pentru cuantificarea rspunsului inflamator al organismului n BC (Tabelul
6), respectiv CU (Tabelul 7).

Markeri MMP-3 MMP-9 HBI IL-13 IL-17 CRP

MMP-3 r = 0.554* r = 0.276* r = - 0.341* r = 0.216* r = 0.016

p = 0.037 p = 0.049 p = 0.030 p = 0.047 p = 0.943

MMP-9 r = 0.608* r = - 0.349* r = -0.037 r = 0.246

p = 0.039 p = 0.029 p = 0.874 p = 0.282

HBI r = 0.063 r = 0.300* r = 0.398*

p = 0.785 p = 0.046 p = 0.047

IL-13 r = 0.365 r = -0.061

p = 0.103 p = 0.791

IL-17 r = -0.226
p = 0.322

r coeficientul de corelaie Pearson, * Corelaie semnificativ statistic

Tabelul 6. Corelaii ntre markerii serologici evaluai n BC

- 24 -
 Markeri MMP-3 MMP-9 IL-13 IL-17 CRP TWI

MMP-3 r = 0.248 r = 0.036 r = 0.213 r = 0.209 r = 0.344*

p = 0.095 p = 0.810 p = 0.154 p = 0.162 p = 0.029

MMP-9 r = 0.259* r = 0.563* r = 0.425* r = 0.308*

p = 0.048 p = 0.00004 p = 0.003 p = 0.037

IL-13 r = 0.354* r = 0.108 r = 0.093

p = 0.015 p = 0.473 p = 0.538

IL-17 r = 0.588* r = 0.312

p= 0.00001 p = 0.034

CRP r = 0.223
p = 0.136

r coeficientul de corelaie Pearson, * Corelaie semnificativ statistic

Tabelul 7. Corelaii ntre markerii serologici evaluai n CU

n lotul pacienilor cu boal Crohn, dintre proteinaze, concentraiile serice ale

MMP-3 s-au corelat mult mai bine cu indicii de boal evaluai pentru aceast
entitate. De asemenea dintre citokine doar IL-17 a prezentat corelaie cu scorul de
boal HBI.
n lotul pacienilor cu colit ulcerativ, MMP-9 a prezentat niveluri serice corelate
mult mai bine cu indicii evaluai. Dintre citokine, pentru IL-17 am identificat
concentraii mai bine corelate cu indicii de boal.
Toate datele obinute n studiul nostru att pentru lotul de pacieni cu boala Crohn,
ct i pentru lotul pacienilor cu colit ulcerativ sunt n concordan cu
observaiile anterioare din literatura de specialitate.

- 25 -
 Acurateea diagnostic a markerilor serologici

Un ultim obiectiv al studiului nostru a fost de a determina performana/acurateea

diagnostic a markerilor serologici analizai comparativ cu CRP, utiliznd analiza prin
curba ROC. Am folosit analiza prin curba ROC pentru a detecta posibile valori prag
(cut-off), pe care s le folosim n practic pentru a face separarea pacienilor cu BC i
CU, de subiecii fr o astfel de patologie. Pentru diversele valori prag investigate la
fiecare marker, am calculat sensibilitatea (Sn), specificitatea (Sp), precum i valorile
predictiv pozitiv (VPP) i negativ (VPN) i likelihood ratio pozitiv (LR+) sau rata
fals pozitiv i likelihood ratio negativ (LR-) sau rata fals negativ. Performana a fost
exprimat ca aria de sub curba ROC (AUC, area under ROC curve), nsoit de
intervalul de ncredere de 95% (95% CI) i p statistic pentru diferena dintre AUC
calculat i AUC= 0.05 (marcator fr putere discriminativ).

Comparnd curbele ROC pentru cei 5 parametri analizai (Tabelul 8), se observ c
separarea cea mai bun a bolnavilor cu BC se poate face cu ajutorul MMP, cea mai
performant detecie fcndu-se cu ajutorul MMP-9 (acuratee de 100%), urmat de
interleukine, IL-13 (acuratee de 97.90%) avnd performane mai bune dect IL-17,
dar mai slabe dect MMP, cea mai puin bun detecie fcndu-se prin dozarea CRP
(i aceasta fcnd o separare bun a cazurilor) (Figura 10).

Prag propus Valoarea p

Parametru AUC Sensibilitate Specificitate
(cut-off) AUC<>50%

MMP-9 1.000 155.15 < 0.0001 100.00% 100.00%

MMP-3 0.992 4.88 < 0.0001 95.24% 100.00%
IL-13 0.979 32.95 < 0.0001 95.24% 93.33%
IL-17 0.885 42.35 < 0.0001 85.71% 80.00%

CRP 0.819 6.00 < 0.0001 80.95% 76.67%

Tabelul 8. BC Performana diagnostic a markerilor serologici

- 26 -
 Figura 10. BC curbele ROC ale markerilor serologici analizai

De asemenea la compararea curbelor ROC pentru cei 5 parametri analizai n CU

(Tabelul 9), am observat c separarea cea mai bun a bolnavilor cu CU se poate face
cu ajutorul MMP-9, avnd cea mai performant detecie (acuratee de 100%) de a
diagnostica, urmat de IL-13 (acuratee de 92.80%), cea mai puin bun detecie
fcndu-se prin dozarea IL-17. Performana/acurateea diagnostic a CRP a fost cu
puin mai bun dect detecia prin dozarea MMP-3 (Figura 11).

- 27 -
 Prag propus Valoarea p
Parametru AUC Sensibilitate Specificitate
(cut-off) AUC<>50%

MMP-9 1.000 155 (- 410) < 0.0001 100.00% 100.00%

IL-13 0.928 31.5 (30-33) < 0.0001 86.96% 83.33%

CRP 0.766 6.00 < 0.0001 73.91% 76.67%

MMP-3 0.764 3.55 < 0.0001 71.74% 70.00%

IL-17 0.690 37.50 0.00146 65.22% 63.33%

Tabelul 9. CU Performana diagnostic a markerilor serologici

Figura 11. CU curbele ROC ale markerilor serologici analizai

- 28 -
 1. n studiul nostru am obinut, o performan/acuratee diagnostic superioar pentru
dozarea metaloproteinazele matriceale, MMP-9 i MMP-3, comparativ cu dozarea
CRP, n diagnosticarea corect a pacienilor cu sau fr boal intestinal
inflamatorie.
2. De asemenea am identificat o performan diagnostic mai bun pentru dozarea
IL-13 comparativ cu determinarea seric a CRP la pacienii cu boal Crohn i
colit ulcerativ.
3. Interleukina IL-17 a avut o performan diagnostic mai bun dect dozarea seric
a CRP, doar n diagnosticul pacienilor cu boal Crohn.
4. Datorit sensibilitii i specificitii superioare, putem considera
metaloproteinazele matriceale i interleukinele analizate ca o alternativ
diagnostic sau suplimentar la CRP, VSH i ali indici inflamatori de boal,
utilizai n diagnosticul bolilor inflamatorii intestinale.

Capitolul XI. CONCLUZII GENERALE

1. Primul studiu epidemiologic efectuat n Centrul nostru de referin indic o

incidena redus a BC i a CU n judeul Dolj (0.82/10 locuitori pe an, respectiv
1.26/10 locuitori ; am constatat o inciden mai mare a CU comparativ cu BC).
Datele sunt n concordan cu observaiile anterioare furnizate de Centrul de
referin Bucureti i confirm incidena sczut a bolilor inflamatorii intestinale n
Romnia.
2. Boala Crohn a debutat la o vrst mai tnr, avnd o distribuie echilibrat cu o
uoar preponderen a sexului feminin i cu un singur vrf de inciden, n timp ce
colita ulcerativ a avut o vrst de debut similar cu cea din populaia vestic, cu o
distribuie bimodala a incidenei la femei i repartiie egal pe sexe.
3. La nivelul judeul Dolj, observm c vrsta de debut pentru cele dou entiti
clinico-patologice este cu 5 ani mai mare comparativ cu vrsta populaiei rilor

- 29 -
 Central i Vest Europene. Se constat o tendin de apariie a CU la vrste mai
tinere n ultimii ani.
4. Din punct de vedere al localizrii leziunilor am observat c peste jumtate din
cazurile nou-diagnosticate cu BC au prezentat afectare colonic. Colita stng a
predominat la pacienii cu CU. Observm o progresie fenotipic a bolii n timp, la
pacienii nou-diagnosticai cu colit scade ponderea colitei stngi, se dubleaz
ponderea colitelor extinse i se nregistreaz cazuri de proctit.
5. Fenotipului non-stenozant, non-penetrant (forma inflamatorie) este cel mai frecvent
ntlnit n BC.
6. Formele uoare i moderate au predominat n ambele entiti. Absena manifestrilor
perianale, frecvena sczut a complicaiilor intestinale i a celor extra-intestinale n
lotul nostru, sugereaz o evoluie blnd a BC i a CU la nivelul judeului Dolj.
7. Studiul nostru a evideniat pentru prima dat, asocierea anumitor caracteristici
fenotipice cu markerii serologici analizai n serul pacienilor cu BII. Am obinut
concentraii semnificativ mai mari ale MMP-3, MMP-9, IL-13, IL-17 i CRP n
serul pacienilor cu BII, comparativ cu lotul control. Concentraii semnificativ mai
mari ale MMP-3 s-au observat la pacienii cu debut peste 40 ani (A3) a BC, la cei cu
afectare colonic (L2), cu pattern non-stenozant, non-penetrant (B1) i
penetrant/fistulizant (B3) i la pacienii cu extensie la nivelul colonului stng (E2) a
CU. Nivelurile serice ale MMP-9 s-au asociat cu debutul precoce al BC (sub 40
ani), la cei cu afectare ileal (L1), cu pattern stenozant (B2) i la pacienii cu
localizare stng a colitei (E2).
8. Citokina anti-inflamatoare IL-13 a prezentat valori serice semnificativ mai mari la
pacienii cu debut peste 40 ani, cu afectare ileal i la pacienii cu colit stng.
Citokina pro-inflamatoare IL-17 s-a asociat cu debut sub 40 ani a BC, cu localizarea
colonic i ileo-colonic i cu proctitele. Singurele concentraii serice semnificativ
mai mari ale CRP au fost asociate colitei extinse.

- 30 -
9. n BC i CU am obinut concentraii serice semnificativ mai mari n subgrupurile de
pacieni cu activitate uoar, moderat i sever, comparativ cu lotul control i am
demonstrat ca nivelurile serice ale MMP-3, MMP-9, IL-13, IL-17 i CRP se
asociaz semnificativ cu diferite stadii de activitate clinic ale celor dou entiti. n
serul pacienilor cu BC i fumtori am identificat niveluri mai mari, semnificative,
ale MMP-9 i IL-13 vs grupul foti-fumtori i nefumtori.
10. Am demonstrat n studiul nostru, prezena de corelaii ntre activitatea bolilor
inflamatorii intestinale la aduli i concentraiile serice ale metaloproteinazelor
matriceale, MMP-3 i MMP-9. n lotul pacienilor cu boal Crohn, dintre
proteinaze, concentraiile serice ale MMP-3 s-au corelat mult mai bine cu indicii de
boal evaluai, n timp ce pentru lotul pacienilor cu colit ulcerativ, MMP-9 a
prezentat niveluri serice corelate mult mai bine cu indicii evaluai pentru aceast
entitate. De asemenea dintre citokine doar IL-17 a prezentat corelaii cu scorul de
boal HBI pentru BC i respectiv concentraii mai bine corelate cu indicii de boal
n CU.
11. Utiliznd analiza curbei ROC am obinut, o acuratee diagnostic superioar pentru
dozarea serica a metaloproteinazele matriceale, MMP-9 i MMP-3, comparativ cu
dozarea CRP, n diagnosticarea corect a pacienilor cu sau fr boal intestinal
inflamatorie. De asemenea dozarea seric a IL-13 a prezentat o performan
diagnostic mai bun comparativ cu determinarea seric a CRP la pacienii cu boal
Crohn i colit ulcerativ. Determinarea seric a IL-17 a avut o performan
diagnostic mai bun dect cea a CRP, doar n diagnosticul pacienilor cu BC.
12. Datorit sensibilitii i specificitii superioare, putem considera metaloproteinazele
matriceale i interleukinele analizate ca o alternativ diagnostic sau suplimentar la
CRP, VSH i ali indici inflamatori de boal, utilizai n diagnosticul bolilor
inflamatorii intestinale.

- 31 -
 BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Zheng CQ, Hu GZ, Zeng ZS, et al. Progress in searching for susceptibility gene for
inflammatory bowel disease by positional cloning. World J Gastroenterol, 2003; 9: 1646-1656.
2. Gheorghe C, Pascu O, Gheorghe L, et al. Epidemiology of inflammatory bowel disease in
adults who refer to gastroenterology care in Romania: a multicentre study. Eur JGastroenterol
Hepatol 2004; 16:11539.
3. Mocanu D,Catuneanu AM, Diculescu M, Gologan S, Spore I. Current epidemiologic trends in
Crohns disease: data from a tertiary refferal centre in Bucharest. Maedica A Journal of
Clinical Medicine, 2010 Volume 5 No.2, 95-101.
4. Shivananda S, Lennard-Jones J, Logan R, et al. Incidence of inflammatory bowel disease
across Europe: is there a difference between north and south? Results of the European
Collaborative Study on Inflammatory Bowel Disease (EC-IBD). Gut 1996; 39:690697.
5. Lakatos L, Lakatos PL. Is the incidence and prevalence of inflammatory bowel diseases
increasing in Eastern Europe? Postgrad Med J 2006; 82:332-337.
6. Gheorghe C, Dimitriu A, Iacob R, et al. Epidemiological and phenotypic characteristics of
IBD patients in Romania results of a nationwide hospital-based registry. J Gastrointestinal
Liver Dis, 2014; 23: Suppl. 1., 41-42.
7. Boldeanu MV, Isabela S, Gheonea DI, Ciurea T, et al. Epidemiological and phenotypic aspects
of IBD patients in Referral Center of Craiova - retrospective study in period 2011 2014.
Current Health Sciences Journal, 2014; Volume 40, Supplement 8 : 21-27.
8. Mijandrusic-Sincic B, Vucelic B, Persic M, et al. Incidence of inflammatory bowel disease in
Primorsko-Goranska county, Croatia, 20002004. Scand J Gastroenterol, 2006; 41:437444.
9. Pavlovic-Calic N, Salkic NN, Gegic A, et al. Crohns disease in Tuzlaregion of Bosnia and
Herzegovina: a 12-year study (19952006). Int JColorectal Dis, 2008; 23:957964.
10. Salkic NN, Pavlovic-Calic N, Gegic A, et al. Ulcerative colitis in theTuzla region of Bosnia
and Herzegovina between 1995 and 2006: epidemiologicaland clinical characteristics. Eur J
Gastroenterol Hepatol, 2010; 22:346353.
11. Harvey RF, Bradshow JM. A simple index of Crohns disease activity. Lancet 1980; i: 514.
12. Truelove SC, Witts LJ. Cortisone in ulcerative colitis: Final report on a therapeutic trial. Br
Med J, 1955; 2: 1041-1048.

- 32 -
13. Loftus CG, Loftus EV Jr, Harmsen WS, et al. Update on the incidence and prevalence of
Crohns disease and ulcerative colitis in Olmsted County, Minnesota, 1940-2000. Inflamm
Bowel Dis, 2007;13:254261.
14. LakatosL, Mester G, ErdelyiZ, et al. Striking elevation in incidence and prevalence of
inflammatory bowel disease in a proince of western Hungary between 1977-2001. World J
Gastroenterol 2004; 10: 404-409.
15. Lakatos L, Lajos S K, Gyula D . Incidence, Disease Phenotype at Diagnosis, and Early
Disease Course in Inflammatory Bowel Diseases in Western Hungary, 20022006. Inflamm
Bowel Dis, 2011; 17:25582565.
16. Kofla-Dlubacz A, Matusiewicz M, Krzystek-Korpacka M, Iwanczak B: Correlation of MMP-3
and MMP-9 with Crohns Disease Activity in Children. Dig Dis Sci, 2012; 57:706712.
17. Matusiewicz M, Neubauer K, Mierzchala-Pasierb M, et al. Matrix Metalloproteinase-9: Its
Interplay with Angiogenic Factors in Inflammatory Bowel Diseases. Disease Markers, 2014:
1-8.
18. Gan X, Wong B, Wright SD, et al. Production of matrix metalloproteinase-9 in CaCO-2 cells
in response to inflammatory stimuli. Journal of Interferon & Cytokine Research, 2001 ; 21:93
98.
19. Lakatos G, Sipos F, Miheller P et al. The behavior of matrix metalloproteinase-9 in
lymphocytic colitis, collagenous colitis and ulcerative colitis. Pathology and Oncology
Research, 2012; 18:8591.
20. Pedersen G, Saermark T, Kirkegaard T, Brynskov J. Spontaneous and cytokine induced
expression and activity of matrix metalloproteinases in human colonic epithelium. Clin Exp
Immunol, 2008; 155:257265.

- 33 -