PARCIAL DE GENETICA

12 de mayo de 2017- Prof. Mauricio Rey

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
LOS POLIMORFISMOS
Se puede decir que las tcnicas de diagnstico en biologa molecular
estn diseadas para la deteccin de polimorfismos genticos.
Cuando se habla de polimorfismos genticos se hace referencia
a variaciones en la secuencia del ADN genmico, cuya
frecuencia en la poblacin es mayor al 1%. Pueden ser
cualitativo (por ejemplo, el cambio de una base por otra) o
cuantitativo (inserciones o delecciones, que cambian la
cantidad de ADN).
Cuando una variacin en la secuencia del ADN genmico es
inferior al 1% se conoce con el nombre de mutacin.
El cariotipo nos permite observar delecciones o inserciones
gigantes de material gentico. Para delecciones o inserciones
de tamao pequeo se usan tcnicas de biologa molecular.
El cambio en la secuencia de ADN de un alelo genera, por ejemplo,
multiples polimorfismos.
Tanto los polimorfismos como las mutaciones pueden
ocasionar ventajas o desventajas para un organismo. Pueden
estar asociados a una enfermedad o a un menor fenotipo. La nica
diferencia es la frecuencia de ellos en el ADN de una poblacin.
Los polimorfismos se distribuyen a lo largo de todo el cromosoma.
Habr casos en los que, para un gen determinado, existan en
una poblacin multiples tipos de alelos, por lo que se dice que
tal gen es muy polimrfico.
 Los genes muy polimrficos son particularmente interesantes
para los casos de identificacin de individuos, en medicina
legal, por ejemplo.
La presencia de los polimorfismos en las secuencias codificantes o
reguladoras (polimorfismos de los genes) son los principales
responsables de las diferencias en el fenotipo de una poblacin. Por
ejemplo, el cambio de un nucletido por otro dentro de un gen,
podra ocasionar el cambio de un aminocido por otro en el producto
proteico, y que esa proteina pueda ser ms funcional o menos
funcional.
En una celula haploide de humano hay 3000 millones de pares
de bases en el ADN genmico. De esta cifra el 99.9% es idntico
entre todos los individuos humanos y nicamente el 0.1%
presenta polimorfismos. Es decir, entre los humanos nos
diferenciamos en el 0.1%.
TIPOS DE POLIMORFISMOS
Se puede decir que hay tres tipos:
1- Macro: son grandes duplicaciones, inserciones y delecciones.
Normalmente pueden ser vistos en citogentica.
2- Medios: pueden ser VNTR (variable number of tndem repeats),
o STR (short tndem repeats). Adems, CNV (copy-number
variation).
3- Micro: Single nucleotide poliymorfphisms (SNP) o Single
nucleotide insertions and deletions (indels)
VNTR o minisatelites son repeticiones de secuencia en tndem
de 6 a 25 pares de bases. pueden formar secuencias de entre
100 y 20000 pares de bases. No son homogneos a lo largo del
genoma, sino que se agrupan ms que todo en los telomeros,
por lo que solo se usan en el diagnstico de un nmero muy
reducido de enfermedades.
 STR, tambin llamadas microsatelites, son repeticiones en
tndem pequeas (de 2 a 6 pares de bases). Estn distribuidas
a lo largo del genoma. Son muy variables por eso son muy tiles
en identificacin humana.
SNP son cambios de un nucletido por otro. Hay aprox. 9
millones en el genoma humano.
Tndem en gentica hace referencia a secuencias que van
juntas una tras de otra.
CNV (en espaol, variacin en el nmero de copias) son
variaciones que poseen los individuos de una poblacin en
cuanto a la cantidad de veces que se repite una determinada
secuencia, mas no precisamente en el tipo de secuencia. Por
ejemplo, todos los individuos de una poblacin poseen en su
genoma la secuencia AATGTTCG, pero difieren en la cantidad
de veces que se repite tal secuencia en su ADN.
Actualmente se sabe que los CNVs contribuyen a una parte
importante de la diferencia en el fenotipo de los individuos, y
estn implicados en una gran cantidad de enfermedades como
diferentes tipos de cncer.
Algunos VNTR son hipermutables, presentando una tasa
media de mutacin entre el 0.5 y el 20% en las clulas de
lnea germinal, siendo as las regiones ms inestables del
genoma humano. Adems, se asocian con puntos de fragilidad
cromosmica.
Para los procesos de identificacin humana en el macro
judicial, en vez de VNTR, se prefieren examinar SNP o STR,
debido a la poca homogeneidad de los VNTR
El 40% de los indels son cambios de un nico nucletido. Pero
hay indels entre 1 y 100
Los indels pueden ocurrir por
 - Slippage de la polimerasa (resbalamiento de la DNA
polimerasa durante la replicacin)
- Defectos en la recombinacin
- Defectos en la replicacin
- Por elementos transponibles
CNV son segmentos de ADN mayor o igual a 1 kb cuyo
nmero de copias es variable. Se desconoce la contribucin
de los CNV a la variacin fenotpica y susceptibilidad a
enfermedades.
DIAGNOSTICO MOLECULAR DE UNA PATOLOGIA
Previamente se debe examinar si est asociado a una alteracin
cromosmica, para lo cual se realiza un cariotipo.
Si la enfermedad no es cromosmica ni presenta herencia no
mendeliana se realizan estudios de asociacin y se analizan los
factores de riesgo.
Si la enfermedad presenta herencia mendeliana entonces se
hace la pregunta de si el gen mutado est localizado o no lo
est.
Si est localizado e identificado se realiza diagnostico directo
(secuenciacin) o indirecto (uso de enzimas de restriccin y
sondas u otros mtodos no secuenciacin).
Si el gen mutado de una enfermedad mendeliana no est
localizado entonces se diagnostica por patrn de segregacin.
DIAGNOSTICO DIRECTO
Las variaciones (polimorfismos o mutaciones) cuantitativas o
cualitativas pueden ser vistas analizando el gen (ADN) o sus
productos gnicos (mARN o proteinas).
Las herramientas para el diagnstico directo son:
 Las tcnicas de extraccin y purificacin de ADN
Las enzimas de restriccin
Electroforesis
Tcnicas relacionadas con hibridacin
PCR
secuenciacin de cidos nucleicos
MUESTRASPARA EXTRACCION DE ADN
Semen
Sangre
Dientes
Tejidos
Huesos
Orina
Saliva
Cabello con folculo piloso
Cualquier fluido corporal
EXTRACCION DEL ADN
Lisis de membrana de eritrocitos
Lisis de membrana de glbulos blancos
Purificacin de ADN (eliminar todo lo que no se cido nucleico)
Precipitacin
Lavado
Almacenamiento
PRINCIPIOS DE ELECTROFORESIS
La electroforesis es un mtodo para separar molculas que estn
cargadas mediante un campo elctrico.
El mtodo de sostn posee un buffer. Estos soportes son geles de
agarosa o de poliacrilamida.
 La agarosa tiene poco poder de resolucin, pero alto grado de
separacin. Generalmente se usa para electroforesis
horizontal.
La poliacrilamida tiene menor grado de separacin, pero alto
poder de resolucin. Electroforesis vertical.
El agente inercalante se inserta entre bases de ADN y gracias
a l podemos ver el ADN en electroforesis. O sales de plata
El azul de Coomassie se usa para ver proteinas en
electroforesis.
ENZIMAS DE RESTRICCION
Son enzimas que cortan el DNA. Se encuentran en bacterias, las
cuales las usan para destruir el ADN extrao. Hay 3 grandes
grupos:
Tipo I, II, y III
El tipo II son las que se usan para biologa molecular pues
cortan en el lugar donde detectan la secuencia determinada.
Las otras cortan en un lugar diferente al sitio de deteccin, por
lo que son ms difciles de manipular.
Su nomenclatura es, la Inicial del gnero y de la especie, una
letra cdigo para la cepa y un nmero romano para identificar
el orden aislamiento de la ms antigua a la ms reciente, si
son varias. EcoRI: Genero Eshcerichia
Co: especie coli
R: cepa RV 13
I: primera endonucleasa aislada de esta cepa
Generalmente las secuencias que reconocen las enzimas de
restriccin son palindromicas, de 2 a 8 nucletidos
 Pueden generar extremos romos o extremos cohesivos. En
biologa molecular se usan ms las enzimas que generen
extremos cohesivos.
Se utilizan en las tcnicas southern blot y western blot
CLONACION
Las enzimas de restriccin se utilizan para la clonacin.
TIPOS DE VECTORES
Los plsmidos permiten clonaron hasta 15000 kb, son
provenientes de bacterias.
Los fagos permiten clonar ms de 20 kb
Los cosmidos son mezclas de ADN de fagos y plsmidos.
Permiten clonar ms de 50 kb
BAC permiten clonar hasta 300kb
YAC son cromosomas artificiales de levadura que permiten
clonar de 100 a 2000 kb. Tiene unas regiones llamadas ORI
que permiten que el DNA se replique.
MAC permite clonar ms de 1000 kb
los vectores deben tener genes reporteros, de resistencia a
antibiticos, ori, y sitios de reconocimiento para enzimas de
restriccin
las clulas deben ser competentes para la transformacin
los genes reporteros son CAT, GAL o lac Z, luciferasa o
proteina verde fluorescente.
DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS POR HIBRIDACION
western blot se usa para detectar proteinas
southern blot para ADN
Northern blot para ARN
MICROARRAYS
Se usa para estudios genmicos grandes. Usa sondas de multiples
genes para examinar la expresin.
7 de abril de 2017- Prof. Harvey Velasco
REPARACION DEL ADN