Revista de Ciencias Biolgicas y de la Salud Universidad de Sonora

El saber de mis hijos har

www.biotecnia.uson.mx mi grandeza

VALIDACIN DE UN MTODO ANALTICO PARA LA DETERMINACIN DE

FSFORO POR ESPECTROFOTOMETRA ULTRAVIOLETA-VISIBLE
VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD FOR UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETRIC
PHOSPHORUS DETERMINATION

Mara Guadalupe Cez Carrasco*, Alejandro Monserrat Garca Alegra

Departamento de Ciencias Qumico Biolgicas, Universidad de Sonora. Rosales y Luis Encinas S/N. Hermosillo, Sonora. C.P.
83000.

RESUMEN cient (R); sensitivity, m = 0.170 0.038 mg L-1; limit of detec-

La entidad mexicana de acreditacin (ema ac) esta-
blece que los parmetros analticos de calidad para la cuan-
tificacin de un analito son exactitud, precisin, linealidad,
especificidad, sensibilidad, sesgo, lmite de deteccin, lmite
de cuantificacin, entre otros. El objetivo del presente estu-
dio fue la validacin del mtodo espectrofotomtrico para la
cuantificacin de fsforo en condiciones ideales a partir de
la preparacin de estndares de trabajo a concentraciones
conocidas y posteriormente determinar la aplicabilidad del
mtodo en bebidas de cola, con alto contenido de fsforo.
La validacin del mtodo de anlisis espectrofotomtrico
se logr a partir de una disolucin de referencia de fsforo
en forma de pentxido de fsforo (P2O5). Los resultados
obtenidos fueron: exactitud 99.12% de recuperacin; preci-
sin 0.96% de coeficiente de variacin; linealidad 0.9992 de
coeficiente de correlacin (R); sensibilidad m = 0.170 0.038
mgL-1; lmite de deteccin de 0.18 mgL-1 y lmite de cuantifi-
cacin de 0.58 mgL-1 de P2O5. La aplicabilidad del mtodo va-
lidado se evalu en bebidas de coca cola, obtenindose una
concentracin de 113.15 0.10 mgL-1 de fsforo. Este trabajo
pretende ilustrar de manera sencilla la metodologa para la
estimacin de los parmetros analticos, que son necesarios
para darle mayor confiabilidad a los resultados.
Palabras clave: validacin, fsforo, mtodo analtico, espec-
trofotometra, refrescos de cola.
ABSTRACT
The mexican accreditation entity (MAE ca) establishes
that the analytical quality parameters for the quantification
of an analyte are accuracy, precision, linearity, specificity,
sensitivity, bias, limit of detection, limit of quantification,
among others. The objective of the present study was the
validation of the spectrophotometric method for phospho-
rus quantification in ideal conditions from working standars
with known concentrations and subsequently determine the
applicability of the method in cola drinks with high phos-
phorus content.The validation of the spectrophotometric
analysis method was achieved from a reference dissolution
of phosphorus as phosphorus pentoxide (P2O5). The results
obtained were: accuracy, 99.12% recovery; precision, 0.96 %
coefficient of variation; linearity, 0.9992 correlation coeffi-
tion, 0.18 mgL- 1 and limit of quantification, 0.58 mgL- 1 of P2O5.
The applicability of the validated method was evaluated in
coca cola beverages, resulting in a concentration of 113.15
0.97 mgL-1 of phosphorus. This work is intended to illustrate
in a simple way the methodology for the quality parameters
estimation, which are necessary to give greater reliability to
the results.
Keywords: validation, phosphorus, analytical methods, spec-
trophotometry, cola drink.
INTRODUCCIN
Por definicin la validacin es la confirmacin me-
diante el suministro de evidencia objetiva de que se han
cumplido los requisitos del mtodo para una utilizacin o
aplicacin especfica prevista (NMX-CH-152-IMNC-2005). La
validacin examina las caractersticas de desempeo de un
mtodo para identificar y establecer cualquier limitacin que
pueda esperarse del mtodo, as como identificar los facto-
res que pueden influir en el cambio de dichos parmetros y
limitaciones; permite demostrar que el mtodo es adecuado
para el propsito, esto es, para resolver un problema analtico
particular (CENAM, 2005; EURACHEM, 2003). En anlisis qu-
mico cuantitativo, muchas decisiones importantes se basan
en los resultados obtenidos por un laboratorio; por lo que es
necesario, disponer de un indicador sobre la calidad de tales
resultados. Hoy ms que nunca se pretende que los qumicos
analticos estn en condiciones de demostrar la calidad de
sus resultados, indicando el grado de confiabilidad en que
cada uno de estos parmetros demuestra su idoneidad para
la finalidad prevista. Esto supone, que se indique en qu
medida se prev que tal resultado concordar con otros,
independientemente del mtodo aplicado. La validacin
analtica de los mtodos de anlisis es uno de los elementos
bsicos en sistemas de calidad. La validacin trata de dis-
minuir o controlar los factores que llevan a la imprecisin o
inexactitud de un dato obtenido, a travs de la realizacin
de un trabajo analtico dentro de unos parmetros definidos
generando una mayor fiabilidad y aceptacin de los datos, al
estar en proporcin con la calidad del proceso de obtencin
de los mismos (Castineira, 2009). Entre los parmetros analti-
cos ms utilizados se encuentran: exactitud, sesgo, precisin,

Volumen XVII, Nmero 1 Autor por correspondencia: Mara Guadalupe Cez Carrasco
32 Correo electrnico: canez@correom.uson.mx
Recibido: 19 de febrero de 2015
Aceptado: 04 de abril de 2015
 Cez Carrasco et al: Validacin de un Mtodo Analtico para la / XVII (1): 32-39(2015)
linealidad, repetibilidad, lmite de deteccin y de cuantifi-
cacin, sensibilidad, entre otros (CENAM-ema, 2008b). De
tal manera que el objetivo del presente trabajo fue validar
un mtodo para la determinacin espectrofotomtrica de
fsforo y demostrar la aplicabilidad del mtodo en bebidas
de cola. Para la determinacin de fsforo mediante espec-
trofotometra UV-visible, se emple el mtodo del azul de
molibdeno con cido ascrbico, cuyo fundamento consiste
en adicionar molibdato de amonio en presencia de fosfatos
y este compuesto se reduce a un complejo azul soluble
(fosfomolibdato de amonio), tal y como se representa en las
reacciones qumicas de la ecuacin (Worsfold et al., 2005;
APHA, 2012):
7H3PO4+12[(NH4)6Mo7O244H2O]
7[(NH4)3(PO4(MoO3)12)]+51NH4++51OH-+33H2O
MATERIALES Y MTODOS
Para la determinacin de fsforo mediante espectro-
fotometra UV-visible, se emple el mtodo del azul de mo-
libdeno. Se pesaron 0.1919 g de KH2PO4, secado previamente
a 105C/1 h, disuelto en agua desionizada, aforando a 1 L.
Esta disolucin es equivalente estequiomtricamente a la
concentracin terica de 100 mgL-1 de P2O5 de la disolucin
madre. A partir de esta disolucin se prepararon las disolu-
ciones de trabajo de 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 4.0, 8.0 y 12.0
mgL-1 de P2O5. El tiempo de incubacin fue de 45 minutos a
50C. Las concentraciones de trabajo para cada parmetro a
evaluar se corrieron por quintuplicado cada una.
Para la preparacin de la muestra de coca cola, se
midi 1 mL de refresco desgasificado y se afor a 50 mL con
agua desionizada. Se midieron 5 mL de esta disolucin, se
le agregaron 20 mL de disolucin reductora (molibdato de
amonio 2.52 x 10-3 M) y se afor a 50 mL con agua desioniza-
da. Posteriormente se le dio el mismo tratamiento que a los
estndares. Se realizaron cinco corridas con cinco repeticio-
nes cada una, obtenindose 25 lecturas. La absorbancia de
las disoluciones acuosas conteniendo P2O5 y la absorbancia
de la muestra se determinaron en un espectrofotmetro
marca AQUAMATE ThermoSpectronic Tipo Helios a 660 nm,
y la absorbancia obtenida es directamente proporcional a la
concentracin de fsforo presente en la muestra (Severiche-
Sierra y Gonzlez-Garca, 2012).
Para la validacin de la metodologa analtica se pro-
cedi a la evaluacin de los siguientes parmetros: exactitud,
sesgo, precisin, linealidad, sensibilidad, lmite de deteccin
y lmite de cuantificacin, de acuerdo a lo que establece
el Centro Nacional de Metrologa y la Entidad Mexicana de
Acreditacin (CENAM-ema, 2008b).
Para la evaluacin de la exactitud, sesgo y precisin se
utilizaron las concentraciones de 1.2, 1.6, 2.0, 4.0 y 8.0 mgL-1
de P2O5. Para las curvas de calibracin y la evaluacin de la
linealidad se utilizaron las concentraciones de 0.4 hasta 8.0
mgL-1 de P2O5. En tanto que para evaluar la sensibilidad del
mtodo a travs de la curva Ringbom, se trabaj con el rango
de concentraciones de 0.1 hasta 12.0 mgL-1 de P2O5. Final-
mente, para obtener el lmite de deteccin (LD) y el lmite de
cuantificacin (LC) se trabaj en el rango de 0.1 a 1.2 mgL-1
de P2O5.
Parmetros Analticos de Calidad para la Validacin del
Mtodo
Exactitud
Se utilizaron estndares de trabajo preparados a par-
tir de una disolucin madre de 20 mgL-1 de P2O5. El clculo
del porcentaje de recuperacin se obtiene con la siguiente
ecuacin:
% Recuperacin = Concentracin obtenida x 100
Concentracin real (1)
En validacin, el porcentaje de recuperacin acepta-
ble est entre 85 y 115% (IUPAC, 2014; CENAM-ema, 2008a).
Sesgo
El sesgo mide el error sistemtico o determinado
de un mtodo analtico, en contraste con el error aleatorio.
Puede existir uno o ms componentes del error sistemtico
que contribuyen al sesgo. Una diferencia sistemtica mayor
con respecto al valor de referencia aceptado se refleja por un
valor de sesgo ms grande
El sesgo se define mediante la ecuacin:
Sesgo = x -
(2)
Donde x es el promedio de la concentracin experi-
mental y es la concentracin terica o verdadera (CENAM-
ema, 2009).
Precisin
La precisin se evalu mediante el clculo del porcen-
taje del coeficiente de variacin (%CV) y el criterio de acepta-
cin para mtodos instrumentales es 2% de CV (Christian,
2009; Harvey, 2002).
% CV= S/x *100
(3)
Donde;
x = media del grupo muestral
S = desviacin estndar
Linealidad
La linealidad de la curva de calibracin se determin
utilizando cinco concentraciones diferentes con un rango de
1.2 8.0 mgL-1 de P2O5 para la determinacin de fsforo con
cinco repeticiones cada una (CENAM-ema, 2008a; Christian,
2009; Skoog et al., 2013), obtenindose 25 lecturas, a una
longitud de onda de 660 nm. Este parmetro se evalu por
inspeccin visual del grfico seal contra la concentracin
del analito y por dos mtodos estadsticos apropiados: co-
eficiente de determinacin (R2) y coeficiente de correlacin
de Pearson (R). Estas determinaciones de linealidad no son
excluyentes unas de otras (Miller y Miller, 2002; NMX-CH-
152-IMNC-2005; Westgard, 2003).
Volumen XVII, Nmero 1
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 Cez Carrasco et al: Biotecnia / XVII (1): 32-39 (2015)

Coeficiente de Determinacin centracin. Simultneamente se prepararon y determinaron

(Y Y )
2 cinco blancos por triplicado.
R = 1
2

(Y Y )
2
RESULTADOS Y DISCUSIN
(4) Parmetros Analticos de Calidad para la Validacin del
Mtodo
Donde: Y= y/n Exactitud
(5) Uno de los criterios de calidad que tiene gran rele-
Coeficiente de Correlacin de Pearson vancia en la estandarizacin y validacin de un mtodo

R=
[a y + b xy n(Y )
2
] analtico es la exactitud, ya que este parmetro refleja de
manera evidente, el grado de concordancia entre un valor
y nY 2
2
(6) real (medido) y un valor terico (verdadero) y generalmente
se sustenta a travs del porcentaje de recuperacin o recobro
Donde: (CENAM-ema, 2008a). Los valores obtenidos para la exacti-
Y = y/n tud del mtodo por medio del porcentaje de recuperacin,
(5) calculados a partir de la Ec. (1), se muestran en la Tabla 1.
El criterio de aceptacin es si R y/o R2 > 0.995, entonces Como se puede apreciar, los valores para el porcentaje de
el mtodo es lineal (CENAM-ema, 2008a; Rodrguez et al., recuperacin se encuentran dentro del rango 100 15% con-
2012). siderado como aceptable (IUPAC, 2014; CENAM-ema, 2008a),
ya que los valores fluctuaron entre 93.16 y 107.88, con un
Sensibilidad promedio global de 99.12% de recuperacin. Si se considera
La sensibilidad de un mtodo mide su capacidad para el promedio global de 99.12 % de recuperacin como valor
discriminar entre pequeas diferencias en la concentracin aceptable de la exactitud, se tendra otro rango ms estrecho
del analito. Segn la IUPAC (2014), la sensibilidad (m) se defi- para avalar la exactitud del mtodo de acuerdo a nuevos
ne como el cociente entre la seal medida (absorbancia, s) y criterios establecidos recientemente por la ema (2008a), en
la concentracin (c) de analito: donde se establece un rango de aceptabilidad de 100 2%
m = s c de recuperacin.
(7) Los resultados obtenidos para el porcentaje de re-
En una regresin lineal, la sensibilidad es la pendiente cuperacin concuerdan con los obtenidos por Garca et al.
de la curva a una concentracin dada. En caso de ser una
recta, coincide con la pendiente de la misma. Como valor se Tabla 1. Resultados obtenidos a partir de cinco concentraciones de P2O5
puede utilizar el promedio de las pendientes obtenidas en (mgL-1) y por quintuplicado.
las rectas de los ensayos de estandarizacin, indicando su Table 1. Results obtained from five P2O5 concentrations (mgL-1) and for
quintupled.
desviacin estndar (Sabido et al., 2010).
Lmite de Deteccin (LD) (NMX-AA-051-SCFI-2001):
LD = yB + 3sB Concentracin de P2O5 (mgL-1)
RPLICA
(8) 1.2 1.6 2.0 4.0 8.0
Donde: Prom. Prom. Prom. Prom. Prom.
yB = concentracin del analito que proporciona una seal igual
1 1.1100 1.4787 2.1408 3.9673 7.7800
a la seal del blanco.
3sB = tres veces la desviacin estndar del blanco. 2 1.1100 1.4939 2.1636 4.0814 7.9855
3 1.1200 1.4939 2.1784 4.1119 8.0312
Lmite de Cuantificacin (LC) (NMX-AA-051-SCFI-2001): 4 1.1200 1.4939 2.1560 4.1119 7.9399
LC = yB + 10sB 5 1.1300 1.4939 2.1484 4.1119 8.0464
(9)
Promedio 1.12 1.49 2.16 4.08 7.96
Donde: DE** 0.01 0.01 0.01 0.06 0.11
yB = concentracin del analito que proporciona una seal Recuperacin 93.16 93.18 107.88 101.92 99.46
igual a la seal del blanco. (%)
10sB = diez veces la desviacin estndar del blanco. Sesgo -0.08 -0.08 0.16 0.08 -0.04
% CV 0.75 0.46 0.68 1.54 1.35
Las determinaciones de LD y LC, se realizaron poste- % Error -6.67 -6.88 8.00 2.00 -0.50
riormente a la determinacin del parmetro de linealidad, 0.004 0.004 0.004 .027 0.049
donde se aplic una calibracin lineal del tipo y = bx + a.
Para determinar los parmetros LD y LC se midieron cinco
El promedio corresponde a cinco rplicas de la concentracin del analito,
disoluciones de referencia de P2O5 para elaborar su curva de
con un total de 25 muestras. (**) = Desviacin Estndar.
calibracin. El anlisis se realiz tres veces para cada con-

Volumen XVII, Nmero 1

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 Cez Carrasco et al: Validacin de un Mtodo Analtico para la / XVII (1): 32-39(2015)
(2009), quienes validaron un mtodo espectrofotomtrico
aplicable en los laboratorios clnicos para la determinacin
analtica de fsforo en suero, y encontraron que los porcenta-
jes de recuperacin son mayores del 98% y no sobrepasan el
102%. Por otro lado, Sabido et al. (2010) en la adaptacin de
un micromtodo espectrofotomtrico para determinacin
de fsforo en hueso, reportaron valores de porcentaje de
recobro de 89.97%. Estos porcentajes de recuperacin se
encuentran dentro de los lmites (100 15%) establecidos
por la A.O.A.C. (2005) para la validacin o prevalidacin de
mtodos analticos mediante anlisis espectrofotomtricos.
Por su parte, Carrillo et al. (2012) evaluaron espec-
trofotomtricamente un mtodo para determinar fsforo
disponible en fertilizantes inorgnicos. Se analizaron tres
fertilizantes y utilizaron un estndar de fosfato monopo-
tsico (KH2PO4). Los valores de recuperacin del fsforo al
analizar un rango de patrones de KH2PO4 entre 0 y 15 mgL-1,
variaron entre 98.98% y 102.62% con un promedio 101.23%.
Estos valores se consideran aceptables segn los criterios de
CENAM-ema (2008a).
Sesgo
Los resultados obtenidos para el sesgo se aprecian en
la Tabla 2, los cuales se calcularon a partir de la Ec. (2). Para
establecer el criterio de aceptabilidad del sesgo, se debe
evaluar la prueba del sesgo, la cual generalmente se detecta
analizando uno o varios materiales de referencia cuya compo-
sicin se conoce. Con toda seguridad, la media experimental
del anlisis diferir del valor verdadero de , proporcionado
para el material de referencia. En este caso, debe juzgarse si
esta diferencia es consecuencia de un error aleatorio en el
anlisis del material de referencia o de un sesgo en el mtodo
usado. La forma habitual de tratar estadsticamente este pro-
blema consiste en comparar la diferencia experimental x
con la diferencia que cabra esperar para un nivel de proba-
bilidad dado si no existiera sesgo. La presencia de un sesgo
en el mtodo se indica cuando el valor x experimental es
mayor que el valor x calculado ( tS/N) a partir de la
Ec. (12). Por lo contrario, si el valor experimental es igual o
menor que la diferencia calculada, no queda demostrada la
presencia de un sesgo (Guarin, 2011).
Tabla 2. Validacin del intervalo reportable para el sesgo.
Table 2. Validation of the reportable range for bias
Valor Valor Sesgo % Criterio de
Rplica terico experimental Error aceptacin
(mgL-1) Promedio
(mgL-1)
1 1.2 1.12 - 0.08 - 6.67 0.01
2 1.6 1.49 - 0.11 - 6.88 0.01
3 2.0 2.16 0.16 8.00 0.01
4 4.0 4.08 0.08 2.00 0.07
5 8.0 7.96 - 0.04 - 0.50 0.13
Este test de deteccin del sesgo se apoya en el par-
metro estadstico t Student y utiliza la ecuacin siguiente:
x = tS /N
(10)
Donde N es el nmero de medidas replicadas que se
han utilizado en este test.
Finalmente se compara el sesgo (desviacin) o el
porcentaje de error para cada dilucin con el error permitido
para la prueba. Los valores del sesgo calculados a partir de la
Ec. (12) son mayores a los obtenidos experimentalmente, por
lo que se puede decir que no existe un sesgo en el mtodo
analtico (Tabla 2).
Precisin
La precisin es una medida de la dispersin de los
datos en torno a un valor central o el grado de concordancia
entre mediciones replicadas de la misma cantidad, y puede
expresarse como rango, desviacin estndar, porcentaje del
coeficiente de variacin (%CV) o la varianza. En este estudio,
la precisin se evalu mediante el %CV el cual se calcul a
partir de la Ec. (3), tal y como se puede apreciar en la Tabla
1, los resultados para este parmetro no rebasan el valor de
1.54, por lo cual, la precisin para este mtodo analtico se
considera aceptable, ya que para mtodos instrumentales
debe ser menor del 2% (Christian, 2009; Harvey, 2002).
Los resultados obtenidos en este estudio para %CV,
son similares a los obtenidos por Lpez (2009), quin de-
termin parmetros de desempeo en mtodos analticos
espectrofotomtricos especficos para cuantificar fsforo y
potasio en suelos utilizados para cultivo del caf, obtenien-
do un CV de 3.03% indicando que el mtodo es preciso, de
acuerdo al criterio de aceptacin determinado en la valida-
cin de mtodos analticos por la Asociacin Espaola de
Farmacuticos de la Industria (2001), que para este parmetro
establece que el %CV 3.88. Por su parte, Garca et al. (2009)
al determinar la precisin del mtodo espectrofotomtrico
para cuantificar fsforo en suero sanguneo encontr que el
CV est por debajo del 3%.
Linealidad
La linealidad es la capacidad (dentro de un intervalo
dado) para proporcionar resultados que son directamente
proporcionales a la concentracin del analito en las mues-
tras de examen (CENAM-ema, 2008b). En este estudio, la
linealidad se evalu mediante el coeficiente de correlacin
de Pearson (R) a travs de las ecs. (5-6) y el coeficiente de
determinacin (R2) a travs de las ecs. (4-6). R indica el grado
de asociacin entre dos variables (en este caso absorbancia
y concentracin) y R2, indica qu tan bueno es el modelo de
regresin utilizado. Los criterios de aceptacin para ambos
parmetros son que R y R2 deben ser mayores que 0.995
(CENAM-ema, 2008a; Rodrguez et al., 2012). La inspeccin
visual de la Figura 1, indica que la linealidad es aceptable, en
tanto que el valor obtenido para R fue de 0.9992 y para R2 de
0.9984. Por lo que de acuerdo a la EMA (2008a), los valores
obtenidos son mayores que 0.995 y por lo tanto se corrobora
Volumen XVII, Nmero 1
35
 Cez Carrasco et al: Biotecnia / XVII (1): 32-39 (2015)

Tabla 3. Valores obtenidos para la sensibilidad de la curva de calibracin

del mtodo.
1.4 Table 3. Values obtained for the method calibration curve sensitivity.
1.2

1 C Sensibilidad
S660
Absorbancia

mgL-1 P (m)
0.8 y = 0,1314x + 0,0917 0.8 0.174 0.218
R = 0.9984
0.6 1.2 0.239 0.199
R = 0.9992
0.4 1.6 0.288 0.180
2.0 0.375 0.188
0.2
4.0 0.627 0.157
0 8.0 1.137 0.142
0 2 4 6 8 10
12.0 1.276 0.106
Concentracin de P2O5 (mgL-1) Promedio 0.170
Desvest 0.038
Figura 1. Curva de calibracin para cuantificacin de P en forma de P2O5
Figure 1. Calibration curve for quantifying P as P2O5. et al., 2009). Mediante una inspeccin visual se observa que
la parte lineal de la grfica (Figura 2) permite obtener el inter-
que la linealidad obtenida es aceptable. El resultado obte- valo de concentraciones ptimo o el intervalo que presentar
nido en este estudio para el coeficiente de correlacin es una relacin lineal entre absorbancia y concentracin, ya que
similar con el reportado por Cavazos et al. (2000). En tanto en la zona de altas y bajas absorciones existe una desviacin
que Gomara et al. (2004), encontraron que en el intervalo de de la lnea recta que debera esperarse. Esto significa que el
5 a 25 g/mL de cido kjico, el mtodo es lineal (R = 0.9994) intervalo de trabajo ms confiable del mtodo se encuentra
de acuerdo a ICH (2005). entre 1.2 y 4.0 mgL-1 de fsforo en forma de P2O5, que sera
a su vez el intervalo donde se comete el mnimo de error.
Sensibilidad Por lo que la sensibilidad de este mtodo est entre el rango
La sensibilidad de un mtodo analtico, se define como 1.2 y 4.0 mgL-1. Cabe recordar que la sensibilidad del instru-
la pendiente, m, de la curva de calibracin, ya que esta define mento est en funcin de la Ley de Lambert-Beer, y esta solo
la razn de cambio de la propiedad medida por unidad de se cumple dentro de un intervalo de concentracin, que
concentracin. Una respuesta no lineal en la grfica de A vs comnmente se le llama intervalo de trabajo, de tal manera
C indica un cambio en el valor de la sensibilidad en funcin que en este estudio, la Ley de Lambert-Beer no se cumple a
de la concentracin. Conforme la concentracin del analito concentraciones muy bajas o muy altas de fsforo y esto se
se aproxima a cero, la seal desaparece dentro del ruido y se refleja en el comportamiento grfico de la curva de sensibili-
rebasa el lmite de deteccin. dad o curva de Ringbom.
La sensibilidad aunque es independiente de la con- Es importante sealar que en la Fig. 1 se muestra la
centracin, se obtiene como el cociente de dividir la seal recta de calibrado que se obtuvo graficando los promedios
medida (absorbancia) entre su valor (m = s/c), y por lo que se de las absorbancias de cinco estndares de P2O5. En esta
puede observar es simplemente igual a la pendiente prome- figura se aprecia claramente que las lecturas de absorbancia
dio. En la Tabla 3 se correlacionan los datos mencionados y se tuvieron una tendencia lineal, sin presentar dispersin sig-
muestra el valor de la m (sensibilidad) = 0.170 0.038 mgL-1 nificativa, asegurando una correlacin lineal entre c y s (c =
P2O5. El valor de sensibilidad obtenido a partir de la Ec. (7)
concentracin; s = seal analtica = absorbancia) entre valo-
debe permitir una adecuada discriminacin de los valores de
concentracin en base a la lectura. Mientras ms prxima al
Figura 2. Curva Ringbom para valorar la sensibilidad del mtodo.
eje de las Y est la recta, significa que a ligeros cambios en las Figure 2. Ringbom curve to assess the sensitivity of the method.
concentraciones esperadas habr grandes variaciones en los
resultados de las lecturas observadas. 140
Por el contrario, entre ms se aleje al eje de la Y, gran-
120
des cambios en la concentracin no son significativos para la
lectura. Se considera, que un mtodo es sensible cuando una 100
% Absorbancia

pequea variacin de concentracin determina una gran 80

variacin de respuesta. La sensibilidad permite observar la 60
capacidad de respuesta instrumental frente a una determi-
nada cantidad de analito. Con respecto al tiempo, se visualiza 40

mejor cmo se comporta el instrumento (Gua tcnica No. 1, 20

2010). 0
Con el propsito de tener ms elementos confirmato- -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5
rios, se recurri al desarrollo de la curva de Ringbom (Surez Logaritmo mgL-1 de P2O5

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 Cez Carrasco et al: Validacin de un Mtodo Analtico para la / XVII (1): 32-39(2015)
res de concentracin de 1.2 y 8.0 mgL-1 de P2O5. Este intervalo
asegura la reproducibilidad de las lecturas dependientes de
la concentracin, con un valor de R = 0.9984.
Lmite de Deteccin
El lmite de deteccin (LD) es la concentracin mni-
ma de un analito en la matriz de una muestra que puede
detectarse, pero no necesariamente cuantificarse, bajo
condiciones analticas especficas, segn la norma mexicana
NMX-CH-152-IMNC-2005 (IUPAC, 2014; Thompson et al.,
2002; CENAM-ema, 2008a).
El resultado obtenido para el LD de acuerdo al proce-
dimiento recomendado por la NMX-CH-152-IMNC-2005, fue
de 0.18 mgL-1 de P2O5 utilizando un mtodo espectrofotom-
trico UV-VIS. Este valor obtenido para el LD, fue estimado a
partir de la Ec. (8), est muy por debajo del valor obtenido
por Garca et al. (2009) quienes obtuvieron un LD con valor de
1.1 mgL-1 de fsforo cuantificado a partir de suero sanguneo
humano. En otra investigacin Severiche y Gonzlez (2012),
reportan un LD relativamente bajo de 0.03 mgL-1 al validar
el mtodo colorimtrico del cido ascrbico para la determi-
nacin de fosfatos en agua, que quiz rebase la capacidad
analtica de los mtodos espectrofotomtricos.
Lmite de Cuantificacin
El lmite de cuantificacin (LC) es aquel valor de con-
centracin mnima que puede obtenerse con una impreci-
sin aceptable (Thompson et al., 2002; CENAM-ema, 2008a).
El resultado obtenido para LC a partir de la Ec. (9), siguiendo
el procedimiento establecido fue de 0.58 mgL-1 de P2O5. Este
resultado es similar al reportado por Lpez (2009) quin ob-
tuvo un LC de 0.7678 mgL-1 para mtodos espectrofotomtri-
cos para la cuantificacin de fsforo en suelos utilizados para
cultivo del caf. Por su parte Garca et al. (2009), en la valida-
cin del mtodo espectrofotomtrico para la determinacin
analtica de fsforo en suero sanguneo humano, obtuvieron
valores para el lmite de cuantificacin de 4 mgL-1 de fsforo,
los cuales son ms altos a los obtenidos en este estudio.
Es importante sealar que se han realizado estrategias
de validacin de mtodos analticos empleando tcnicas de
espectrofotometra UV-Visible, como los trabajos realizados
por Gomara et al. (2004) para la cuantificacin del cido
kjico, o la cuantificacin de metabolitos estables de xido
ntrico en fluidos biolgicos (Tenorio et al., 2008), entre otros.
Sin embargo, la gran mayora de los trabajos recientes de va-
lidacin de mtodos analticos tienen una gran aplicacin en
la investigacin de productos farmacuticos. Entre estos m-
todos analticos validados se encuentra la determinacin y/o
cuantificacin de sertralina (Walash et al., 2011), candesartan
(Pradhan et al., 2011), determinacin de fenol en productos
farmacuticos (Vukovic et al., 2012), desloratadina (Derayea,
2014), cromoglicato de sodio y clorhidrato de oximetazolina
(Abdel-Aziz et al., 2014) entre otros.
Aplicabilidad del Mtodo
Para confirmar la validacin del mtodo analtico
utilizado, se procedi a evaluar la aplicabilidad del mtodo
para cuantificar la concentracin de fsforo en una bebida
de cola (coca cola). Se obtuvo la linealidad de la curva de
calibracin en un rango de 1.2 a 8.0 mgL-1 de P2O5. Con los
datos obtenidos y aplicando mnimos cuadrados se lleg
a la ecuacin Y = 0.1314X 0.0917, con un coeficiente de
correlacin (R) de 0.9992. La absorbancia promedio (0.1598)
de las lecturas de las muestras analizadas se interpol en la
curva de calibracin para obtener la concentracin de P2O5
(0.5183 mgL-1). La desviacin estndar de la concentracin
de la muestra fue de 0.0972 mgL-1. Posteriormente, conside-
rando las diluciones realizadas se obtuvo la concentracin de
fsforo en el refresco de la siguiente forma:
mgL-1 de P = (mgL-1 P2 O5) (fdn) (g de P/g de P2O5) =
(0.5183)(50)(10)(62/142)= 113.15
Por lo anterior el contenido de fsforo en las muestras
de coca cola analizadas en el presente estudio fue de 113.15
0.10 x10-1 mgL-1. Cavazos et al. (2000), determinaron el con-
tenido de fsforo en bebidas de consumo popular, como son
los refrescos de cola por espectrofotometra UV-VIS, repor-
tando que 355 mL de un refresco de cola proporcionan entre
66 y 85 mg de fsforo. Citan que el contenido de fsforo en
coca cola fue de 215 mgL-1 con un % CV = 1.78. Por otro lado,
Murphy (1983) report un contenido de H3PO4 de 5.06 0.09
x10-3 M en refrescos de cola, lo que equivale a 156.86 mgL-1
de P, utilizando el mismo mtodo. Lozano-Calero et al. (1996)
cuantificaron 142 mgL-1 de P en crystal pepsi. Martnez y No-
yola (2012) cuantificaron el contenido de cido fosfrico por
el mtodo colorimtrico de cido vanadomolibdofosfrico,
reportando 345.88 mgL-1 de H3PO4, lo que equivale a 109.41
mgL-1 de P.
Finalmente, la comunidad analtica internacional
ha establecido las principales especificaciones y requisitos
operativos de un laboratorio de pruebas por medio de la
Norma Internacional ISO/IEC 17025:2005 Requisitos gene-
rales para la competencia de los laboratorios de ensayo y
calibracin, esta norma especifica claramente la necesidad
de la validacin de los mtodos analticos como un requisito
indispensable antes de realizar una medicin analtica, ya
que el desempeo de un mtodo analtico es diferente en
cada laboratorio que lo realiza y adems los mtodos anal-
ticos no se pueden utilizar para medir algn mensurando en
cualquier matriz, sino que son muchas veces especficos para
la matriz en la que fueron desarrollados y por ende validados
originalmente (INECC-CCA, 2010).
La validacin de un mtodo analtico se refiere a su
evaluacin cuantitativa y tiene como objetivo proporcionar
informacin fiable, exacta y de fcil interpretacin sobre el
objeto de anlisis (Gomara et al., 2004; Sabido et al., 2010;
Severiche-Sierra y Gonzlez-Garca, 2012).
Volumen XVII, Nmero 1
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 Cez Carrasco et al: Biotecnia / XVII (1): 32-39 (2015)

CONCLUSIONES EURACHEM/CITAC. (2003). Guide Traceability in Chemical

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under contract with the UK Department of Trade and
parmetros analticos de exactitud, sesgo, precisin, lineali-
Industry as part of the National Measurement System Valid
dad, sensibilidad, lmite de deteccin y lmite de cuantifica- Analytical Measurement (VAM) Program.
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