UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

NOMBRE: Priscila Vizuete

NRC: 4162
FECHA: 07/06/2017

Introduccin
El conocimiento de la diversidad gentica de este hongo se debe considerar en el desarrollo de estrategias de mejoramiento de
la resistencia. El objetivo fue analizar la diversidad gentica de P. pachyrhizi
Roya asitica de la soja (SBR), enfermedad causada por el hongo biotrfica Phakopsora pachyrhizi Syd. y Syd, es una de las
principales enfermedades que afectan soja.
Seis locis de resistencia SBR, RPP1 - 6 , se han mapeado en la soja. Sin embargo, la resistencia conferida por estos alelos no siempre
es duradera, ya que puede llegar a ser ineficaz despus de slo unos pocos aos. Esta evidencia sugiere que hay rpidos cambios
en la virulencia probablemente en base a la alta diversidad gentica de P. pachyrhizi . Por esa razn, es importante estimar la
diversidad gentica de este patgeno con el fin de desarrollar enfoques de manejo de enfermedades eficientes, as como las
estrategias de mejoramiento para obtener nuevos cultivares resistentes a largo plazo.
En el presente estudio se estableci un enfoque que combina la toma urediniosporas y el anlisis gentico posterior por AFLP y se
utiliza para examinar el polimorfismo molecular de los aislados de P. pachyrhizi recogido de varios lugares agro-ecolgicas en
Argentina, Brasil, Paraguay y Uruguay.
Material y mtodos
Muestreo P . pachyrhizi : La muestra Urediniosporas se obtuvieron de 20 a 40 hojas de 10 a 20 plantas infectados con SBR elegidas
al azar de los campos de produccin comerciales. Cada grupo de muestras representa ms de un genotipo de roya. Cuatro
muestras se recogieron en Argentina y cinco en Paraguay durante el ao 2008; mientras que en 2009 se recogieron tres muestras
en Brasil, siete en Paraguay y cuatro en Uruguay, lo que representa un total de 23 muestras.
Extraccin de ADN:El ADN genmico total se extrajo a partir de 10 mg de urediniosporas utilizando un protocolo de bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB). La concentracin de ADN se determin espectrofotomtricamente .
Identificacin PCR:Para confirmar la identidad de las muestras recogidas, se realiz la amplificacin por PCR con cebadores
especficos de P. pachyrhizi, Ppa1 (5'-TAAGATCTTTGGGCAATGGT-3 ') y Ppa2 (5'-GCAACACTCAAAATCCAACAAT-3'). Como control
positivo, se utiliz ADN de una muestra infectada con P. pachyrhizi previamente recogida en un lugar en el Noroeste de Argentina,
mientras que el ADN de soja se utiliz como control negativo
Protocolo de AFLP, electroforesis y tincin gel:Se realizaron reacciones de amplificacin con 34 combinaciones de cebadores que
tenan uno o tres nucletidos selectivos. Cada combinacin se repiti al menos dos veces mediante un procedimiento AFLP
independiente para confirmar los patrones de banda. Los productos de amplificacin final se separaron en geles de poliacrilamida
desnaturalizantes al 6% usando un sistema Sequi-Gen GT. Se incluy un marcador de peso molecular en todos los geles (intervalo
de tamao de 250-1500 pb). Los geles se tieron con nitrato de plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Anlisis de los datos:Porcentaje de polimorfismo y la diversidad gentica se calcularon para medir la variabilidad gentica entre
muestras de diferentes pases y aos de recopilacin, usando el software Info-Gen.Se realiz un anlisis de varianza molecular
(AMOVA) utilizando tambin el software Info-Gen.Cada banda (monomrfica o polimrfica) se puntu de manera dominante y se
transform en una matriz 0 (ausente) o 1 (presente). Slo se incluyeron en el anlisis las bandas que se podan calificar
inequvocamente. Para el anlisis se consider el intervalo entre 80 y 1000 pb del tamao de la banda.
La similitud gentica se calcul mediante el uso de Jaccard ndice (Sj). Los anlisis de agrupamiento se llevaron a cabo utilizando
el anlisis de similitud de McQuitty (mtodo de grupo de pares no ponderado con media aritmtica, UPGMA) para determinar la
diversidad gentica de las muestras. Todos los clculos se realizaron utilizando el software Info-Gen. Para evaluar la solidez de los
grupos formados, el conjunto de datos binarios se someti a bootstrapping utilizando el programa WINBOOT. El dendrograma fue
reconstruido 1000 veces y se consider que la frecuencia con que se form un grupo particular reflejaba la fuerza del grupo. Se
consider que el lmite del 50% indica un apoyo estadstico para la topologa en un nodo en el rbol de consenso bootstrap.
Adems de evaluar la evolucin molecular de las muestras recogidas P. pachyrhizi, se construy un rbol de evolucin mnima
(rbol de unin vecina) utilizando el software Mega 6 basado en la matriz de distancias de Info-Gen.
Resultados
Se confirm la presencia de P. pachyrhizi en todas las muestras recogidas
que presentaban sntomas tpicos de SBR, ya que slo se amplific un
fragmento de tamao esperado (332 pb) con cebadores de PCR especficos
de especie.El patrn de bandas AFLP fue altamente reproducible para las 23
muestras de utilizando 34 pares de primers AFLP. De los 1919 marcadores
totales obtenidos, el 77% fueron polimrficos. El alto porcentaje de
polimorfismo y el coeficiente de diversidad gentica de Nei (0,22) indicaron
alta diversidad de patgenos (Tabla 1).
El anlisis de la varianza molecular mostr una mayor variacin gentica dentro de los
pases que entre ellos (Tabla 2).
Para estimar la similitud gentica
entre las muestras recogidas, se
calcularon las distancias de Jaccard y
se construy un dendrograma (Fig. 2). El anlisis de agrupamiento de P.
pachyrhizi revel que las muestras del grupo de Uruguay se separaron a una
distancia de 0.94 del grupo principal. A una distancia de 0,87 se diferenciaron
dos grupos segn el ao de recoleccin. Adems, dentro de cada uno de los
dos grupos, todas las muestras del mismo pas se subagruparon.
En el anlisis filogentico (Fig. 3), al
menos cinco grupos podran
distinguirse claramente: i)
muestras de Argentina y Paraguay
recogidas en 2008; Mientras que el
resto de los grupos
correspondientes a las muestras
recogidas en 2009 fueron: ii) y iii)
de Paraguay, iv) de Brasil y v) de Uruguay. Al igual que en el anlisis de la diversidad, las
muestras agrupadas principalmente por el ao de recoleccin y las muestras de
Uruguay fueron las ms distantes.
En el PCoA, los dos primeros ejes de coordenadas principales
representaron el 24% de la varianza total (Fig. 4). Los grupos generados
por PCoA apoyan los resultados obtenidos por el anlisis dendrograma.
Las muestras de Argentina y Paraguay se agruparon a la izquierda en el
hacha 1 (CP 1), lo que indica una mayor similitud molecular entre ellas,
mientras que muestras de Brasil y Uruguay se agruparon a la derecha
en esta. No se encontraron diferencias claras entre las muestras de
Paraguay en diferentes aos en el CP 1, pero al analizar el CP 2, dos
grupos se diferencian claramente segn el ao de muestreo.

Discusin
Los resultados del presente trabajo mostraron claramente que la
tcnica de AFLP es una herramienta molecular poderosa para estudiar la variabilidad gentica de este patgeno ya se obtuvieron
un gran nmero de marcadores y el porcentaje de polimorfismo, a pesar de que un nmero relativamente pequeo de las
muestras se caracterizaron. Debe sealarse que el nivel de diversidad gentica que se encuentra en este trabajo mediante el uso
de marcadores AFLP, era comparable a la que se inform anteriormente utilizando marcadores SSR (77% vs. 87%,
respectivamente).
Debe tenerse en cuenta que, aunque el objetivo del presente estudio fue establecer una metodologa para la evaluacin de la
diversidad gentica, era til para llevar a cabo un anlisis preliminar de muestras recogidas de P . pachyrhizi muestras. Los
resultados de mtodo de agrupamiento, filogentica y anlisis PCoA agrupan muestras principalmente por el ao de la recogida y
luego por cada pas. Estos resultados sugieren posibles cambios genticos entre aos posteriores dentro de la misma regin.
En resumen, el muestreo mediante la recoleccin de urediniosporas junto con el enfoque molecular propuesto, permiti detectar
la diversidad gentica en P. pachyrhizi muestreada en cuatro pases de Amrica del Sur. Si bien se han reportado resultados
alentadores que sugieren una alta diversidad gentica del patgeno, se deben realizar ms investigaciones para aumentar el
nmero de muestras para investigar las estructuras poblacionales regionales de P. pachyrhizi. Los resultados dan una interesante
visin de la diversidad gentica de P. pachyrhizi, lo que podra explicar la gran capacidad de este patgeno para superar los genes
de resistencia nica.
De acuerdo con esto, las nuevas estrategias de cra para aumentar la duracin de la resistencia deben considerarse en la futura
mejora de la soja. Un enfoque podra ser la pirmide de los principales genes de resistencia, segn lo descrito por Lemos et al. que
introdujo tres genes de resistencia a la roya de la soja en un solo cultivar. Otra posible estrategia alternativa podra basarse en la
identificacin e introduccin de resistencia cuantitativa, conferida por muchos genes con efectos aditivos que generan una presin
menos selectiva sobre el patgeno, y por lo tanto puede proporcionar una resistencia ms duradera.

Conclusin
El estudio propuesto por la combinacin de una simple coleccin de urediniosporas con un posterior anlisis por AFLP fue til
para examinar el polimorfismo molecular de las muestras de P. pachyrhizi y podra tener una contribucin significativa al
conocimiento de su diversidad gentica. Adems, el anlisis AFLP es una herramienta molecular importante y potente para el
estudio de la diversidad gentica y podra ser til para realizar estudios ms amplios de diversidad gentica.

Bibliografa
Rocha, L., Vellice, G., Pardo, E., Racedo, J., Perera, A., Gili, J., & Bogado, N. (10 de Noviembre de 2015). Use of AFLP markers to
estimate molecular diversity of Phakopsora pachyrhizi. Electronic Journal of Biotechnology, 18.