UNIVERZITET U TRAVNIKU

FARMACEUTSKO-ZDRAVSTVENI FAKULTET

Ramanova spektroskopija i njena primjena

-seminarski rad-

Kandidat Mentor

Pepi Feka prof.dr. Jasminka Sadadinovi

Sadraj

1. UVOD....................................................................................................................................1

2. Ramanova spektroskopija...................................................................................................3

2.1. Povrinski poja ano Ramanovo rasprenje................................................................5

2.1.1. Elektromagnetski mehanizam pojaanja

.............................................................................................................................................
6

2.1.1.1. Rezonancija lokaliziranog povrinskog plaz mona

........................................................................................................................................
6
2.1.1.2. Faktor pojaanja
........................................................................................................................................
8
2.1.1.3. Utjecaj udaljenosti izmeu molekule i metalne povrine
......................................................................................................................................
10
2.1.1.4. Utjecaj pobudnog zraenja..............................................................................11
2.1.2. Mehanizam prijenosa naboja
...........................................................................................................................................
12

2.1.3. SERS supstrati

...........................................................................................................................................
12

2.1.3.1. Priprema, karakterizacija i stabilnost koloida metala

......................................................................................................................................
13
2.1.3.2. Agregacija metalnih nanoestica u koloidnoj suspenziji
......................................................................................................................................
15
2.1.3.3. Bimetalni koloidi
......................................................................................................................................
15
2.2. Primjena povrinski poja anog Ramanovog rasprenja.........................................16

2.2.1. Primjena SERS spektroskopije u biologiji i biokemiji

...........................................................................................................................................
16

2.2.2. Primjena SERS spektroskopije u ekologiji i forenzici

...........................................................................................................................................
17

2.2.3. Primjena SERS spektroskopije u istraivanju farmaceutski aktivnih tvari

...........................................................................................................................................
18
1. UVOD

Spektroskopija povrinski poja anog Ramanovog rasprenja ( surface-enhanced Raman

scattering, SERS) metoda je koja se razvija posljednjih tridesetak godina, a zahvaljujui vrlo
visokoj osjetljivosti nalazi svoju primjenu u brojnim podrujima kao to su kemijska i
biokemijska analiza, medicina, forenzika i arheologija.
SERS spektroskopijom opaa se vibracijski spektar karakteristian za molekulu smjetenu na
ili vrlo blizu metalne, nanostrukturirane povrine. Ramanovo rasprenje molekula moe se
povrinski pojaati i do 106 puta, a ukoliko se radi o kombinaciji povrinskog pojaanja s
pojaanjem koje nastaje uslijed rezonancije energije zraenja koju analit apsorbira i energije
pobudnog zraenja (surface-enhanced resonance Raman scattering, SERRS), faktor ukupnog
pojaanja moe iznositi i 1014 puta, to u konanici omoguuje detekciju jedne molekule
analita.
Zahvaljujui detekciji analita pri iznimno niskim koncentracijama i sve dostupnijim i
bolje karakteriziranim supstratima, SERS spektroskopija sve se ee primjenjuje i u
farmaceutici. Trend u farmaceutskoj industriji je proizvodnja uinkovitih lijekova s
minimalnim nuspojavama, radi ega se nove aktivne tvari esto primjenjuju u vrlo malim
dozama (primjerice 100 mg aktivnog sastojka u tableti, to iznosi oko 10% mase). Tako male
koliine aktivnog sastojka svakako su izazov analitikim metodama s obzirom na zahtjev za
brzom identifikacijom aktivne tvari i moguih oneienja, odreivanjem raspodjele tvari u
tableti i utvrivanjem interakcija aktivne tvari s pomonim tvarima. Takoer, sve prisutnija
procesna analitika tehnologija zahtjeva brzo i uinkovito praenje sinteze aktivnih sastojaka
koje ukljuuje odreivanje sadraja i oneienja te praenje tijeka reakcije. Analize
konvencionalnim kromatografskim (HPLC) i spektroskopskim metodama esto nisu
jednostavne, te osjetljivost, selektivnost i brzina SERS spektroskopije ukazuju na potencijalnu
uspjenu primjenu ove metode.
Vaan aspekt istraivanja farmaceutski aktivnih tvari SERS spektroskopijom je i
otkrivanje naina adsorpcije farmaceutskog analita na supstrat, s obzirom na moguu
korelaciju interakcija s biolokim supstratom i spoznaje o mehanizmu biolokog djelovanja.
Primjena SERS spektroskopije u farmaceutskoj industriji u smislu alternative HPLC
metodama ili standardnim spektroskopskim tehnikama za kvalitativno i kvantitativno praenje
kemijskih reakcija ili analize gotovih proizvoda prisutna je u literaturi u manjoj mjeri, iz
razloga to metoda jo uvijek zahtjeva pronalaenje i ugaanje sustava analizirane tvari i
odgovarajueg supstrata.
2. Ramanova spektroskopija

Ramanova spektroskopija temelji se na neelastinom rasprenju elektromagnetskog zraenja

uslijed njegove interakcije s vibracijskim modovima molekule. Vibracije dozvoljene u
Ramanovom spektru one su pri kojima se mijenja polarizabilnost molekule. Ukoliko se uzorak
ozrai monokromatskim zraenjem, zraenje se raspruje na naine prikazane na slici (Slika
1). Rayleighovo rasprenje podrazumijeva elastino rasprenje zraenja pri kojem su
frekvencije pobudnog i rasprenog zraenja jednake. Ramanovo rasprenje je neelastino
rasprenje pri kojem se frekvencija rasprenog zraenja razlikuje od frekvencije pobudnog
zraenja. Ukoliko se molekule nakon pobude u virtualno stanje vraaju u vii vibracijski nivo
osnovnog elektronskog stanja, emitirani foton manje je frekvencije od pobudnog te se pojava
naziva Stokesovo rasprenje. Pri anti-Stokesovom rasprenju frekvencija emitiranog fotona
vea je od frekvencije pobudnog fotona, budui se molekule pobuene u virtualno stanje iz
poetnog, vieg vibracijskog nivoa, vraaju u nii vibracijski nivo osnovnog elektronskog
stanja.

Slika 1. Mehanizmi razliitih procesa rasprenja svjetla

Proces Ramanovog rasprenja manje je vjerojatan od elastinog Rayleighovog rasprenja jer
se tek jedan od 106-108 fotona neelastino raspruje. Takoer, prema Boltzmannovoj
raspodjeli, pri sobnoj temperaturi veina molekula u osnovnom je elektronskom stanju, dok je
vrlo mali broj molekula u pobuenom stanju odnosno viim nivoima osnovnog stanja.
Ramanov proces koji se temelji na Stokesovom neelastinom rasprenju tako je pri sobnoj
temperaturi vjerojatniji od anti-Stokesovog procesa.
U sluaju da je energija upadnih (i rasprenih) fotona bliska energiji elektronskih
prijelaza u molekuli, zraenje se rezonantno raspruje. Virtualno stanje tada rezonira s jednim
od realnih elektronskih stanja molekule to rezultira pojaanjem rasprenja s molekule za
nekoliko redova veliine. Rezonantno Ramanovo rasprenje moe se opaziti za bilo koju
molekulu koja apsorbira zraenje valne duljine koje je jednaka ili bliska valnoj duljini
pobudnog zraenja lasera (Slika 2).

Slika 2. Dijagram procesa rezonantnog Ramanovog rasprenja.

Ukoliko je energija pobudnog zraenja dovoljna za prijelaz izmeu elektronskih stanja,

pobudno zraenje se apsorbira. Pri povratku u osnovno elektronsko stanje, osim gubitka
energije otputanjem topline, pojedine molekule mog u emitirati zraenje. Fluorescencija kao
nain deaktivacije molekule iz pobuenog u osnovno stanje vrlo esto zasjenjuje Stokesovo
rasprenje.
2.1. Povrinski poja ano Ramanovo rasprenje

Jedan od najveih nedostataka Ramanove spektroskopije je slaba osjetljivost metode.

Poveanje intenziteta Ramanovog rasprenja moe se postii rezonantnom pobudom te
povrinskim pojaanjem. Rezonantno raspreno zraenje intenzivnije je od normalnog
Ramanovog rasprenja 10 2 do 104 puta, a koristi se pri istraivanju razliitih tvari meu
kojima i bioloki vanih molekula, stanica i virusa . Meutim, za postizanje rezonancije
koriste se laseri zraenja manjih valnih duljina od uobiajenog za Ramanovu spektroskopiju,
vidljivog i bliskog infracrvenog zraenja. Laseri velike energije, posebice one
ultraljubiastog dijela spektra, mogu uzrokovati raspad uzorka te pojavu fluorescencije.
Drugi nain poveanja osjetljivosti proizlazi iz efekta pojaanja rasprenog zraenja
molekula analita koje se nalaze u neposrednoj blizini povrine metalnih nanostruktura. Efekt
povrinski pojaanog Ramanovog rasprenja otkrili su Fleischmann, H endra i McQuillan
1974. godine.
Primijeeno je naime da je Ramanov spektar molekule piridina adsorbirane na srebrnoj
elektrodi neobino visokog intenziteta. Teorijsko objanjenje fenomena ubrzo su ponudili
Jeanmaire i Van Duyne, te Albrecht i Creighton.
Od otkria pojaanja rasprenog zraenja molekule na povrini metala istraivanje
povrinski pojaanog Ramanovog rasprenja proirilo se, uz srebro, i na druge metale,
primjerice zlato, bakar, platinu, aluminij i alkalijske metale, te se zajedno sa srodnom granom
plazmonike znaajno razvilo. Najvaniji razlog za razvoj SERS tehnike upravo je njena
primjenjivost u razliitim granama prirodnih znanosti. Pojaanjem intenziteta rasprenog
zraenja molekule na metalnom supstratu poveava se osjetljivost Ramanove spektroskopije
i omoguava strukturna analiza molekula na temelju vibracijskog spektra.
2.1.1. Elektromagnetski mehanizam pojaanja

Prilikom interakcije elektromagnetskog vala s metalnom povrinom, jakost polja na povrini

drugaija je od jakosti polja udaljenog od povrine. Ukoliko je povrina metala nepravilna,
zraenje moe pobuditi lokalizirane povrinske plazmone , to rezultira pojaanjem
elektromagnetskog polja u blizini povrine. Pod pretpostavkom da se pojaava jakost upadnog
i rasprenog zra enja (dakako razliitih valnih duljina), mogue je opaziti vrlo visoki
intenzitet Ramanovog rasprenja. Pojaanje signala koje proizlazi iz pojaanja polja
pobudnog i rasprenog zra enja osnova je teorije elektromagnetskog mehanizma.

2.1.1.1. Rezonancija lokaliziranog povrinskog plaz mona

Rezonancijom oscilacija valentnih elektrona metalnih nanoestica s frekvencijom pobudnog

zraenja nastaju lokalizirani povrinski plazmoni (Slik a 3).

Slika 3. Lokalizirani povrinski plazmoni.

Razumijevanje karakteristinog ekstinkcijskog spektra (apsorpcija i rasprenje ) metalne

nanoestice moe biti vrlo sloeno s obzirom da na njegov intenzitet i poloaj utjeu
dielektrino okruenje te veliina i oblik nanoestice. Znaajke lokaliziranih povrinskih
plazmona koje izravno utjeu na elektromagnetsko pojaanje mogu se razmotriti
kvazistatinim pristupom koristei sfernu nanoesticu radijusa a, izloene zraenju valne
duljine polariziranom u smjeru osi z, pri emu je dugovalna granica a/ < 0,1. Pri
navedenim uvjetima pretpostavlja se da je elektrino polje oko metalne nanoestice jednoliko.
Rjeenje Laplacove jednadbe za jakost polja oko na noestice je:
 z 3z (1)
3 - 5
Ev (x, y, z) = E0 z - aE0 (xx + yy + zz)
r r

pri emu su x, y i z Kartezijeve koordinate, r je radijalna udaljenost, x, y, z su Kartezijevi

jedinini vektori, a je polarizabilnost metala izraena kao:

a = ga 3 (2)

a g je definiran s:

eu - e v
g= (3)
(e u + 2e v )
u je dielektrina konstanta metalne nanoestice, dok je v dielektrina konstanta vanjskog
okruenja. Poja anje ovisi o valnoj duljini, budui su realni dijelovi dielektrine konstante
metalne nanoestice njena funkcija. Polje se pojaava kako se nazivnik u izrazu 3 pribliava
nuli (u -2v). Takoer, iz jednadbe 1 proizlazi kako se poja anje polja smanjuje s r3 , to
znai da postoji konani volumen oko nanoestice unutar kojeg se postie poja anje.
Prema Mie teoriji ekstinkcijski spektar E() nanoestice proizvoljnog oblika opisan je
sljedeim izrazom:

3/
2 3 2
24p Na e v e i (l)
E(l) = (4)
l ln(10) (e r (l) + ce v )2 + e i (l) 2

gdje su r i i realna odnosno imaginarna komponenta dielektrine funkcije metala u. Realni

dio dielektrine konstante metala ovisi o valnoj duljini. Ova je jednadba izvedena iz rjeenja
za malu sferu zamjenom faktora u jednadbi 2, koji se u jednadbi 3 pojavljuje kao v, s . je
faktor oblika koji uraunava razliku izmeu geometrija sferne estice i struktura s viim
omjerom duljine i irine. Ova se aproksimacija uvod i jer se Mie teorija ne moe primijeniti na
estice koje nisu sfernog oblika. Budui pojaava v, faktor oblika generalizira se kao
osjetljivost lokaliziranih povrinskih plazmona na dielektrino okruenje. Vrijednost veli ine
je 2 za sferu, no u sluaju drugih geometrija njegova vrijednost dosee i 2 0.
Uvjet dielektrine rezonancije (r -v) postie se u vidljivom dijelu spektra za estice s
visokim omjerom duljine i irine (visoka vrijednost ), a koje su od metala kao to su srebro i
zlato. Budui se ekstinkcijski spektri analitiki mogu rijeiti samo za sfere i sferoide, rjeenja
se za ostale geometrije moraju pretpostaviti.

2.1.1.2. Faktor pojaanja

U Ramanovoj spektroskopiji intenzitet rasprenog zr aenja linearno je ovisan o intenzitetu

polja pobudnog zraenja, E02. Budui se elektrina polja pojaavaju na povrini metalnih
nanoestica, apsolutna vrijednost kvadrata polja evaluiranog na povrini nano estice utjee
na Ramanov intenzitet. Iz jednadbi 1 -3 za malu metalnu sferu vanjsko polje je jednako:

2
Ev = E02 [ 1 - g 2
+ 3 cos 2 q (2 Re(g ) + g 2
)] (5)

gdje je kut izmeu vektora polja upadnog zraenja i vektora poloaja molekule na povrini.
Elektrino polje jae je okomito na metalnu povrinu, nego paralelno s njom. Prema tome se i
najvee pojaanje rasprenog zra enja opaa za molekule adsorbirane i polarizirane o komito
na metalnu povrinu. Ukoliko je vrijednost g velika, maksimalno se pojaanje polja
pribliava:

Ev 2
= 4E02 g 2 (6).

U Ramanovoj spektroskopiji polje pobudnog zraenja inducira oscilirajui dipol u molekuli

koja se nalazi na povrini. Dipol potom emitira zra enje te postoji vjerojatnost da e
emitirano zraenje biti frekvencije umanjene za vibracijsku frekvenciju molekule (Stokesovo
rasprenje). Iako jednadba 5 daje op i izraz za pojaanje pobudnog polja, zraenje koje
molekula emitira takoer moe biti poja ano.
Aproksimacija prvog reda za intenzitet pojaanog polja emitiranog zraenja slina je
izrazu 5, uz razliku evaluacije pri Stokesovoj frekvenciji:

2 2
E E 2 2
v v
g
EF = = 4g (7)
E0 4

gdje se crtano oznaeni simboli odnose na veliine polja pri frekvenciji rasprenja.
Jednadba 7 definira se kao teorijski faktor pojaanja EF (enhancement factor). Ukoliko je
Stokesov pomak malen g i g' su priblino jednake vrijednosti te je faktor pojaanja reda
veliine g4. U literaturi ovaj se izraz obino oznaava kao E4 odnosno etvrta potencija
pojaanog polja na povrini estice. Uz pretpostavku da je |g| otprilike 10 za malu sferu u
danom modelu, povrinsko pojaanje iznosi izmeu 104 i 105. Vrijednost |g| vea je za visoko
ureene srebrne nanostrukture za koje se faktor pojaanja uslijed elektromagnetskog
mehanizma moe pribliiti i 10 8. Uzrok visokog faktora pojaanja meusobne su rezonancije
povrinskih plazmona koje rezultiraju l okaliziranim tokama vrlo jakih polja, tzv. vruim
tokama. U vruim tokama polja su katkad jakosti dovoljne za detekciju jedne molekule
analita.
Teorijsko razmatranje povrinski pojaanog Ramanovog rasprenja svakako je korisno
za utvrivanje uzroka pojaanja E4, no u praksi je ee jednostavnije eksperimentalno,
analitiki procijeniti faktor pojaanja nego ga teorijski predvidjeti za odreeni SERS supstrat.
Faktor pojaanja promatranog SERS sustava moe se opisati sljedeom jednadbom:

[I /N
SERS

povrina ]

[I NRS /N

EF = vol ] (8)

Pri odreenoj valnoj duljini pobudnog zraenja izraz 8 opisuje prosjeno pojaanje
Ramanovog rasprenja koje ukljuuje pojaanje kako pobudnog tako i rasprenog zraenja.
Pri tome je ISERS intenzitet povrinski poja anog Ramanovog rasprenja, Npovrina broj molekula
na metalnom supstratu, INRS intenzitet normalnog Ramanovog rasprenja, a Nvol broj molekula
u mjerenom volumenu analita. Praktino, za dani supstrat i molekulu analita, potrebno je
izmjeriti ISERS i INRS neovisno, pri paljivo odabranim parametrima instrumenta.
2.1.1.3. Utjecaj udaljenosti izmeu molekule i metalne povrine

Udaljenost izmeu molekule analita i metalne povrine kritian je faktor pri opaanju
povrinski pojaanog Ramanovog rasprenja. Elektromagnetski mehanizam ne zahtijeva
direktnu vezu analita i metalne povrine kako bi se opazio SERS signal, ve smjetanje
molekule blizu povrine metala. Direktan kontakt analita i SERS supstrata esto nije niti
mogu zbog molekula receptora koje su primarno vezane na metalni supstrat. Molekule
receptora koriste se za postizanje biokompatibilnosti supstrata ili za specifino vezanje
odgovarajueg bioanalita.Uzimajui u obzir injenicu da se jakost polja oko male metalne
sfere smanjuje s r3 i aproksimaciju faktora pojaanja E4, jakost polja proporcionalna je s r12 .
S obzirom da je ukupna povrina metalne sfere razmjerna kvadratu ra dijusa sfere, r2,
eksperimentalno opaeno pojaanje intenziteta tada je proporcionalno s r10 :

-10
a+r
I
SERS
=
(9)
a

pri emu je ISERS intenzitet povrinski pojaanog Ramanovg rasprenja, a je prosjeni

parametar nanostrukture, a r je udaljenost analita od povrine. Ovisnost pojaanja
rasprenog zraenja o udaljenosti izmeu molekule i povrine metala jo je izraenija kod
spomenutih vruih toaka koje su izuzetno lokalizirane. Slika 4 prikazuje vruu toku dimera
metalnih nanoestica, pri emu minimalni pomak poloaja adsorbiranog analita moe
rezultirati drastino slabijim rasprenjem zra enja.

Slika 4. Faktori pojaanja rasprenog zraenja molekule na razliitim mjestima na

povrini dimera metalnih nanoestica.
2.1.1.4. Utjecaj pobudnog zraenja

Aproksimacija faktora pojaanja E4 predvia kako je u svrhu opaanja pojaanja rasprenog

zraenja idealno koristiti pobudno zraenje one valne duljine koja se podudara s frekvencijom
lokaliziranih povrinskih plazmona metalnog supstrata, tzv. rezonancijsku frekvenciju. U
praksi meutim to nije sluaj. Kako bi se postiglo maksimalno pojaanje potrebno je pojaati
pobudno, ali i raspreno zraenje, koja su u sluaju Ramanovog rasprenja razliitih valnih
duljina. U sluaju kada energija molekulskih vibracija odgovara podruju otiska prsta (500-
1500 cm-1) aproksimacija o zanemarivom Stokesovom pomaku vie ne vrijedi, kao niti
aproksimacija E4.
Slika 5 prikazuje apsorpcijski spektar povrinskih plazmona supstrata i profil faktora
pojaanja u ovisnosti o valnoj duljini pobudnog zraenja, za vrpce pri 1575, 1081 i 1009 cm-1
u spektru benzentiola.

Slika 5. a) Profil pojaanja u ovisnosti o valnoj duljini pobude za vrpcu pri 1081 cm1
benzentiola u usporedbi s apsorpcijskim spektrom povrinskih plazmona suptrata. Silicij je
koriten kao unutarnji standard. Apsorpcijski maksi mum povrinskih plazmona supstrata
iznosi = 690 nm. b)-d) Utjecaj Stokesovog pomaka na profil pojaanja za vrpce pri b) 1575
cm1 , c) 1081 cm1 i d) 1009 cm1 .
Apsorpcijski maksimum povrinskih plazmona supstrata iznosi = 734 nm.
Profili pojaanja ukazuju kako se najvei faktor pojaanja opaa kada je frekvencija
pobudnog zraenja vea od frekvencije povrinskih plazmona koritenog supstrata. Osim
toga, s poveanjem energije vibracije poveava se i razlika izmeu maksimuma profila
pojaanja i apsorpcije plazmona. U sluaju svakog pojedinog vibracijskog moda, maksimalno
pojaanje postignuto je pri energiji pobude koja je od energije povrinskih plazmona vea za
priblino polovinu vrijednosti energije vibracije. Sve opaeno je u skladu s
elektromagnetskim modelom pojaanja koji za maksimalno pojaanje predvia pojaanje i
upadnog i rasprenog zraenja. Polja pobudnog i rasprenog zraenja optimalno se pojaavaju
kada su frekvencije oba zraenja obuhvaene apsorpcijskim spektrom povrinskih plazmona.

2.1.2. Mehanizam prijenosa naboja

Mehanizam prijenosa naboja ili kemijski mehanizam pojaanja zahtjeva da je molekula

analita kemijski vezana na metalni supstrat. Ovaj je mehanizam predloen kako bi se
objasnile razlike u relativnim intenzitetima i poloajima vrpci u SERS spektru u odnosu na
vrpce odgovarajuih vibracijskih modova u normalnom Ramanovom spektru. Takoer,
kemijskom mehanizmu pripisuju se neslaganja opaeni h i izraunatih faktora pojaanja.
Kemijski mehanizam pojaanja rasprenog zraenja dogaa se uslijed prijenosa naboja
koji podrazumijeva prijelaze elektrona iz Fermijevog nivoa metala u nepopunjenu orbitalu
molekule (i obrnuto). Interakcijom pobudnog zraenja s metalom nastaje par elektron-
upljina, iz kojeg elektron prelazi u analit. Nakon kratkotrajne pobude nastalog kompleksa,
elektron se vraa natrag u metal, pri emu se zraenje raspruje.
Kemijskim vezanjem analita s metalom mogu nastati povrinski kompleksni spojevi
drugaijih svojstava od molekula analita. Pri tome novonastali kompleksi mogu imati
elektronska stanja odgovorna za mogunost rezonantnog Ramanovog rasprenja.

2.1.3. SERS supstrati

Paralelno s razvojem spektroskopije povrinski pojaanog Ramanovog rasprenja razvijaju se

i tehnike priprave pogodnih metalnih supstrata. Prvi SERS supstrat bila je srebrna elektroda
nepravilne povrine, pripravljena elektrokemijski, ciklikom voltammetrijom. Ubrzo nakon
otkria pojaanja rasprenog zraenja s povrine metala poeli su se koristiti metalni filmovi
pripravljeni naparavanjem metala u vakuumu, a nedugo nakon zamijenile su ih metalne
nanoestice razliitih oblika i iroke raspodjele veliina.
U usporedbi s metalnim filmovima ili metalnim elektrodama, priprava koloida ne zahtijeva
skupe komore za naparavanje niti postoji utjecaj oksidacijsko-redukcijskog ciklusa tijekom
pripreme supstrata na molekulu analita.
Nanoestice su strukture dimenzija izmeu 1 i 100 nm. U navedenom nano podruju
metali posjeduju specifino svojstvo rezonantnih povrinskih plazmona, te e se na njihovoj
povrini, uz uvjet da je ona nepravilna, rasprenje zraenja adsorbirane molekule analita
pojaati. Tijekom posljednjih tridesetak godina razvijene su razliite tehnike priprave SERS
supstrata kojima se pripremaju paljivo dizajnirane metalne nanostrukture koje osim svojstva
pojaanja rasprenog zra enja imaju i prednost reproducibilne izvedbe.Prema tehnikama
pripreme SERS supstrati mogu se podijeliti u tri skupine: metalne nanoestice u suspenziji,
metalne nanoestice imobilizirane na vrstoj povrini i nanostrukturirane metalne povrine
pripravljene primjerice nanolitografijom.Zahvaljujui jednostavnoj i financijski povoljnoj
pripravi, te jednostavnom rukovanju, unato nedostatku visoke reproducibilnosti metalni
koloidi (nanoestice u suspenziji) najee su koriteni SERS supstrati. Razliitim postupcima
pripravljaju se koloidne nanoestice razliitih oblika i veliina. Budui parametri veliine i
oblika nanoestice uvelike utjeu na rezonatnu frekvenciju povrinskih plazmona,
odgovarajuom tehnikom mogue je pripremiti pogodne supstrate za odabrani mjerni sustav.
Koloidi se mogu dodatno i agregirati u svrhu poveanja broja vruih toaka u kojima se opaa
najvee pojaanje rasprenja. Osim monometalnih nano estica mogue je pripremiti
kompozitne nanoestice od razliitih metala koje u odreenim mjernim sustavima bolje
pojaavaju raspreno zra enje. Pored jednostavne pripreme koloidi imaju i prednost mjerenja
nakon pobude zraenjem veih snaga, to u sluaju metalnih povrina kao SERS supstrata
moe uzrokovati spaljivanje uzorka. Takoer je vana i mogunost snimanja uprosjeenog
SERS spektra uslijed Brownovog gibanja u koloidnoj suspenziji.

2.1.3.1. Priprema, karakterizacija i stabilnost koloida metala

Sferne nanoestice zlata i srebra najee se pripremaju redukcijom kationa metala. Za

pripravu koloida srebra najvie se koriste AgNO 3 ili Ag2SO4, a za koloid zlata HAuCl4 ili
KAuCl4. U sluaju oba metala najee koriteni reducensi su natrijev citrat ili natrijev
borhidrid. Koloid srebra pripravljen redukcijom srebrova nitrata s trinatrijevim citratom
tijekom jednosatnog zagrijavanja uz refluks jedan je od najpopularnijih koloidnih SERS
supstrata (slika 6.)
 Slika 6. a) TEM slika i b) apsorpcijski spektar Ag koloida pripravljenog redukcijom
srebrova nitrata s trinatrijevim citratom.23

Koloidi pripravljeni opisanom redukcijskom metodom s trinatrijevim citratom stabilni su

mjesecima, no budui se svojstva povrine nano estica mogu promijeniti unutar nekoliko
dana, rasprenje zraenja s ranije pripravljenih koloida moe se razlikovati i biti slabije od
onog opaenog sa svjee pripremljenog supstrata. Za stabilnost koloidnih nanoestica
odgovorne su kemijske vrste prisutne na njihovoj povrini. Najee su to anioni zaostali na
povrini metala nakon redukcijskog postupka, primjerice citratni ioni, koji elektrostatskim
odbojnim silama sprjeavaju agregaciju nanoestica. U svrhu poveanja stabilnosti metalnih
koloida u suspenziju se mogu dodati tvari poput polivinil alkohola ili natrijeva dodecil sulfata,
koji okruuju nano estice i steriki sprjeavaju agregaciju.Dodatak razliitih surfaktanata za
stabilizaciju ima meutim i svoje nedostatke. Naime, u SERS spektru mogu se opaziti i
vibracije molekula surfaktanata, koje smjetene uz povrinu nano estica mogu oteati ili
potpuno onemoguiti adsorpciju molekula analita. Iz navedenih razloga, podruje istraivanja
molekula pogodnih za stabilizaciju koloida koje pritom ne ometaju adsorpciju analita i dalje je
vrlo aktivno.
Najvanija svojstva metalnih nano estica u ulozi SERS supstrata su njihova veliina,
morfologija, oblik, kristalna struktura, sastav te rezonantna frekvencija povrinskih plazmona.
Nanoestice se vizualiziraju elektronskom mikroskopijom, kao to su transmisijska
elektronska mikroskopija (TEM) ili skenirajua elektronska mikroskopija (SEM), koja prua
informacije o morfologiji, veliini i obliku estica. Uz SEM i TEM esto se koristi i
mikroskopija atomske sile (atomic force microscopy, AFM) budui je boljeg vertikalnog
razluivanja te se moe koristiti i na nevodljivim povri nama.
Za utvrivanje sastava nanoestica najee se koristi rendgenska disperzivna spektrometrija.
Uz sastav, primjenom difrakcije rendgenskih zraka na polikristalnom uzorku, dobiva se
informacija o kristalnoj strukturi supstrata. Spektralna svojstva nanoestica najlake se
procjenjuju UV/Vis apsorpcijskom spektroskopijom, kojom se odreuje pogodna valna
duljina pobude za odgovarajui SERS supstrat.
Osim sfernih metalnih nanoestica, variranjem uvjeta reakcija te koritenjem razliitih
surfaktanata pripremljene su koloidne estice razliitih oblika poput nanotapia, nanoploica,
prizmica, kockica, pa ak i nanocvijea. Tijekom priprave odreenih nanooblika esto se
koristi metoda cijepljenja reakcijske otopine pripremljenim nanoesticama koje usmjeravaju
specifinu kristalizaciju metalnih estica.

2.1.3.2. Agregacija metalnih nanoestica u koloidnoj suspenziji

Metalne nanoestice pojaavaju raspreno zraenje molekula analita na njihovoj povrini, no

pojaanje se znaajno poveava njihovom agregacijom. Agregiranjem pojedinanih
nanoestica u dimere ili grozdove omoguava se meusobna rezonancija povrinskih
plazmona i stvaranje vruih toaka u kojima je elektromagnetsko polje izrazito jako.
Koloidne nanoestice se najee agregiraju dodatkom anorganskih soli (KCl, NaCl, NaNO 3,
NaClO4), surfaktanata, organskih amina ili anorganskih kiselina u koloidnu suspenziju.
Takoer, vrlo esto sam analit moe agregirati koloid.

2.1.3.3. Bimetalni koloidi

Osim najee koritenih koloida srebra i zlata, redukcijskim p ostupcima pripremaju se i

bimetalni koloidi, najee u obliku estica sa srebrnom jezgrom i zlatnim omotaem i
obrnuto. Rezonantna frekvencija povrinskih plazmon a bimetalnih nanoestica razlikuje se
od one monometalnog koloida ovisno o debljini omotaa, odnosno omjeru koliina dvaju
metala. Bimetalne estice posjeduju kombinirana svojstva oba metala koja za odreeni mjerni
sustav mogu pojaati rasprenje vie od estica samo jednog metala.
Kompozitne nanoestice, osim od zlata i srebra, pripravljaju su i od drugih metala,
meu kojima su zanimljive one sa zlatnom jezgrom i vrlo tankim omotaem razliitih
prijelaznih metala. Upravo jezgra od zlata omoguava pojaanje rasprenog zraenja molekule
analita adsorbirane na omota od prijelaznog metala.
2.2. Primjena povrinski poja anog Ramanovog rasprenja

Spektroskopija povrinski pojaanog Ramanovog rasprenja primjenjuje se u razliitim

podrujima poput biologije, biokemije, ekologije, forenzike, kemije materijala i
elektrokemije. Uz injenicu da se radi o jednostavnoj i vrlo osjetljivoj metodi, koja uz
identifikaciju kemijske vrste prua i informacije o strukturi analita, njenoj popularizaciji
doprinio je i razvoj novih Ramanovih mjernih ureaja, od Ramanovih mikroskopa do
prenosivih Ramanovih spektrometara.

2.2.1. Primjena SERS spektroskopije u biologiji i biokemiji

SERS spektroskopija u biologiji se prije svega primjenjuje za fundamentalna istraivanja koja

se bave prouavanjem strukture, konformacije i prijenosa naboja biomolekula. Tako su
primjerice prouavane strukture razliitih fotoosjetljivih sustava pigment-protein kompleksa
koristei elektrodu od srebra. Praktina primjena spektroskopije povrinski pojaanog
Ramanovog rasprenja ukljuuje biomedicinsku dijagnostiku, primjerice dijagnostiku tumora,
te detekciju i kvantifikaciju proteina, DNA, pa ak i bakterija. Za detekciju biolokih
molekula koriste se biosenzori koji se sastoje od nanoestica biokompatibilnog metala na koje
su vezane molekule receptora odgovorne za specifino prepoznavanje i reakciju s analitom.
Pri tome nastaju SERS spektri drugaiji od onih kada reakcije s analitom nema. Opisanim
biosenzorima mogu se detektirati i kvantificirati razliite bioloki vane molekule u stanicama
ija prisutnost ili koliina upuuju na odgovarajua stanja organizma. Tako specifina
antitijela, hormoni i proteini mogu ukazati na razliite tumore, Alzheimerovu i Parkinsonovu
bolest.

Jedna od vanih primjena biosenzora na temelju povrinski pojaanog Ramanovog rasprenja

je odreivanje koncentracije glukoze u organizmu. Razvijen je naime biosenzor koji
omoguava in vivo mjerenje glukoze u krvi, bez uzorkovanja, ime se znaajno poboljava
kvaliteta ivota oboljelima od dijabetesa. Razvoj biosenzora kojim se specifino, bez
interferencija mnotva biomolekula prisutnih u krvi, moe pouzdano i u realnom vremenu
kvantitativno odreivati analit znaajan je napredak u bioanalitici.
 Biosenzori se koriste i za SERS oslikavanja ivih s tanica i tkiva. Kemijske slike
nastaju na temelju reakcija molekula receptora na povrini metalnih supstrata s razliitim
ciljanim biomolekulama ili uslijed promjena molekulske strukture molekula na povrini
metala uzrokovanim razliitim uvjetima u stanici. Primjer takvog biosenzora je agregat
nanoestica zlata na ijoj su povrini vezane molekule 4-merkaptobenzojeve kiseline, a iji je
SERS spektar pH ovisan. pH mapiranje ive stanice o moguava bolji uvid u metabolike i
fizioloke stani ne procese (Slika 7).

Slika 7. Shematski prikaz oslikavanja ive stanice, obzirom na pH vrijednost, biosenzorom na

temelju povrinski pojaanog Ramanovog rasprenja .

2.2.2. Primjena SERS spektroskopije u ekologiji i forenzici

Visoka osjetljivost spektroskopije povrinski pojaanog Ramanovog rasprenja omoguava

detekciju vrlo niskih koncentracija analita, do ak jedne molekule. Upravo je visoka
osjetljivost, uz brzinu tehnike i razvoj novih, manjih, prenosivih Raman spektrometara, razlog
primjene SERS spektroskopije u analizi okolia. Detektirati se naime mogu vrlo niske
koncentracije razliitih pesticida, herbicida, farmaceutski aktivnih molekula i drugih
zagaivala u vodi, zraku i tlu. Uzorci vode vrlo se jednostavno mogu analizirati na terenu na
prisutnost odgovarajuih zagaivala bez posebne pripreme uzorka, koristei posebno
dizajnirane membrane s koloidom srebra koje omoguavaju adsorpciju analita i opaanje
SERS spektara. Razliite molekule u zraku, opasne po zdravlje ljudi i okolia, detektiraju se
nakon direktne adsorpcije iz uzorka zraka na SERS supstrat ili, ukoliko se sam analit ne
adsorbira, koriste se specifino razvijeni supstrati s ve vezanim molekulama receptora koje
veu ciljane analite, kao to je sluaj i kod biosenzora. Koristei SERS supstrate s receptorima,
poput kaliksarena ili karbamata, u zraku se uspjeno mogu detektirati niske koliine razliitih
policiklikih aromatskih ugljikovodika kancerogenog djelovanja.

Srodna analizi uzoraka okolia, forenzika su istraivanja niskih koncentracija droga te

eksploziva i kemijskog oruja u uzorcima tla i zraka. Eksploziv poput dinitrotoluena moe se
detektirati SERS tehnikom u uzorku zraka, a njegova prisutnost u zraku koristi se pri lociranju
mina tijekom razminiravanja. Izrazito otrovni bojni plin iperit takoer se uspjeno odreuje u
zraku SERS metodom pomou prenosivog Ramanovog spektrometra koji omoguuje trenutnu
analizu na terenu.

Forenzika analiza ukljuuje i istraivanje tvari poput pigmenata u novanicama ili

umjetninama koje mogu uputiti na krivotvorenje. U svrhu zatite identiteta originala vrijednih
predmeta koriste se SERS nanooznake. To su funkcionalizirane sferne nanoestice zlata u
malim kapsulama od silikona koje se mogu inkorporirati u razliite materijale te koristiti za
autentifikaciju razliitih predmeta. Nanooznake se sve ee koriste iz sigurnosnih razloga za
oznaavanje luksuznih predmeta poput umjetnina i nakita. Takoer se mogu se uklopiti u
novanice u procesu tiskanja.

2.2.3. Primjena SERS spektroskopije u istraivanju farmaceutski aktivnih tvari

Cjelokupan razvoj lijeka, od sinteze i karakterizacije aktivne molekule do njene formulacije s

pomonim tvarima i istraivanja svojstava gotovog proizvoda, zahtjeva brzu i uinkovitu
analitiku podrku. Analiza sadraja malih doza aktivnih molekula u gotovom lijeku, kao i
praenje vrlo niskih koncentracija oneienja u aktivnoj tvari predstavljaju izazov analitikim
metodama. SERS spektroskopija, zahvaljujui detekciji analita pri iznimno niskim
koncentracijama i sve dostupnijim i bolje karakteriziranim supstratima, odgovara postavljenim
zahtjevima te se sve ee primjenjuje u farmaceutskoj industriji. Osim visoke osjetljivosti,
prednost pred konvencionalno koritenim kromatografskim metodama svakako je i brzina
SERS tehnike, vaan parametar u procesnoj analitikoj tehnologiji koja se ve standardno
primjenjuje za praenje tijeka sintetskih reakcija ili formulacijskih procesa. Takoer, SERS
spektroskopija prua informacije o molekulskoj strukturi analita, to kromatografske metode
ne omoguavaju.

Vaan aspekt istraivanja farmaceutski aktivnih tvari SERS spektroskopijom je i otkrivanje

naina adsorpcije farmaceutskog analita na supstrat, s obzirom na moguu korelaciju
interakcija s biolokim supstratom i spoznaje o mehanizmu biolokog djelovanja.
Naime prvi korak u biomedicinskim istraivanjima interakcija lijeka s primjerice molekulama
proteina u tijelu upravo je istraivanje same aktivne tvari SERS spektroskopijom, esto pri
razliitim pH uvjetima koji utjeu na oblik molekule i njezinu aktivnost u tijelu. Sve je vie
primjera SERS analiza farmaceutski aktivnih tvari u svrhu boljeg razumijevanja metabolizma i
djelovanja lijeka. Primjena SERS tehnike tako je uvelike rasvijetlila interakciju antitumorskog
lijeka emodina s proteinom albuminom.U prvoj fazi analizirani su SERS spektri emodina pri
pH vrijednostima 4, 7 i 12, pri kojima je molekula u neutralnom, monoaninskom odnosno
dianionskom obliku. Najznaajnije promjene u spektrima razliitih strukturnih oblika emodina
opaaju se za vrpcu pri 1673 cm1 koja se u spektru emodina u lunatom mediju nalazi pri
1641 cm 1 , dok se vrpce u podruju 1360-1250 cm-1 s porastom pH vrijednosti pomiu prema
veim valnim brojevima. S poveanjem pH medija primijeen je i pad intenziteta Ramanovog
rasprenja. U tu je svrhu evaluiran intenzitet vrpce pri 679 cm-1 koristei DMSO kao unutarnji
standard. Navedene vrpce analizirane su i interpretirane i u SERS spektrima kompleksa
emodin-albumin, u kojima su opaene zanimljive razlike u ovisnosti o koliini masnih kiselina
prisutnih u proteinu (Slika 8).

Na temelju spektralnih razlika zakljueno je da postoje dva razliita aktivna mjesta u albuminu
u koja se emodin vee te da na mjesto veza nja utjee prisutnost masnih kiselina. SERS
spektroskopijom prikupljeni su vani podaci o interakcijama antrakinonskih lijekova s
albuminima, te utjecaju liganada poput masnih kiselina na njihovo meudjelovanje.
 Slika 8. Strukturni oblici i kiselo-bazna ravnotea emodina. SERS spektri emodina pri a)
pH 4, b) pH 7 i c) pH 12. SERS spektri kompleksa: d) emodin/albumin 1/4, e)
emodin/albumin 1/2, f) emodin/albumin-masna kiselina 1/2, g) emodin/albumin-masna
kiselina 1/4.21

Na slian su nain analizirani SERS spektri razliitih farmaceutski aktivnih tvari poput 5-
fluoruracila, rivanola i vitamina B1.2,39,40 Primjer antitumorskog lijeka 5-fluoruracila iznimno
je zanimljiv. SERS spektri 5-fluoruracila vezanog na koloid srebra pri razliitim pH uvjetima
ukazali su kako se istraivani analit na metalni supstrat adsorbira preko razliitih
funkcionalnih skupina. Tako se u kiselom mediju molekula 5-fluoruracila na povrinu metala
adsorbira preko keto skupine i duika u prstenu, do k se u lunatom mediju samo keto
skupinom pribliava povrini srebra (Slika 9). Osim istraivanja na ina adsorpcije 5-
fluoruracila na metalne povrine, SERS tehnikom mog ue je odrediti njegovu koncentraciju u
slini pacijenta.
 Slika 9. Naini adsorpcije 5-fluoruracila na povrinu srebra.

Istraivanje adsorpcije aktivne farmaceutske tvari na odabrani SERS supstrat interpretacijom

SERS spektara, koristi se za stjecanje spoznaja o nainu vezanja u aktivno mjesto
biomolekula. No, osim o funkcionalnoj skupini koja sudjeluje u interakciji, SERS spektri
mogu pruiti i informaciju o konformaciji molekule na povrini SERS supstrata. Izborna
pravila na povrini, prema kojima se poja avaju vrpce onih vibracija molekule na povrini
metalnog SERS supstrata iji je vektor promjene polarizabilnosti okomit na povrinu metala,
omoguavaju interpretaciju pojaanja odnosno gaenja pojedinih vrpci u SERS spektru
ukazujui na poloaj molekule na povrini. Diklofenak natrij (natrijeva sol 2-(2-(2,6-
diklorfenilamino)fenil)octene kiseline) poznati je analgetik ija je konformacija na povrini
srebra istraena spektroskopijom povrinski poja anog Ramanovog rasprenja. SERS spektri
diklofenak natrija snimljeni su pri razliitim pH vrijednostima, pri emu su opaene zna ajne
razlike u spektrima molekule u mediju pH vieg i nieg od 6 (Slika 10).
 Slika 10. a) FT-Ramanov spektar diklofenak natrija u vrstom stanju. SERS spektri
diklofenak natrija na Ag koloidu pri b) pH 2, c) pH 6 i d) pH 10.
Znaajno pojaanje vrpce istezanja karboksilatnog aniona (1586 cm1 ) pri pH 2 upuuje na
blizinu i okomit poloaj karboksilne skupine u odno su na srebrnu povrinu. U spektrima
molekule pri pH > 6 ta je vrpca znaajno manjeg intenziteta, uslijed promjene poloaja
skupine prema povrini metala. Tako er, promjene u intenzitetu vrpci vibracija CH skupina
benzenskih prstenova upuuju na razliit poloaj aromatskih skupina uz povrinu srebra u
medijima razliite pH vrijednosti (Slika 11).

Slika 11. Shematski prikaz molekulske strukture diklofenak natrija na povrini srebra pri
a) pH < 6 i b) pH > 6.
Primjenom ciljano pripravljenih supstrata srebra za pojaanje rasprenog zraenja, razvijene
su i metode za detekciju tragova antipiretika poput paracetamola i acetaminofena, te razliitih
kemoterapijskih lijekova u samom organizmu pacijenta.
Osim to je mogu nost praenja koncentracije lijeka u organizmu vana za razumijevanje
njegova mehanizma djelovanja, testiranje sline na prisutnost razliitih farmaceutskih tvari
poput probenecida pri vrlo niskim koncentracijama korisno je za doping kontrolu sportaa.

Istraivanje aktivnih farmaceutskih tvari podrazumijeva istraivanje djelovanja aktivne tvari i

njenih svojstava, ali i razvoj i optimiranje sintetskog puta za njeno dobivanje. Sintetski
postupak farmaceutski aktivnih tvari, koje su uglavnom male organske molekule, nerijetko
ukljuuje katalizu. U svrhu razumijevanja katalitikih procesa na povrini metala,
prouavanje naina vezanja te konformacije molekule na metalnoj povrini moe biti od
velike koristi.
Glavna primjena SERS spektroskopije u farmaceutskoj industriji tijekom usavravanja sinteze
aktivne tvari ve je spomenuta analitika. Uz istaknute prednosti visoke osjetljivosti i brzine,
zahvaljujui kojima SERS spektroskopija predstavlja kvalitetnu alternativu kromatografskim
metodama, vaan faktor u kemijskoj industriji je i utroak otapala za analizu. Za razliku od
kromatografije, spektroskopija povrinski poja anog Ramanovog rasprenja zahtijeva
minimalan utroak kemikalija, to ju ini vrlo prihvatljivom u smislu zelene kemije.
3. LITERATURNI IZVORI

1. H. Gnzler i H.-U. Gremlich, Uvod u infracrvenu spektroskopiju, prijevod 4. izd.,

kolska knjiga, Zagreb, 2006.
2. S. Cnt Pnzaru, I. Pavel, N. Leopold i W. Kiefer. J. Raman Spectrosc. 35 (2004) 338-
346.
3. N. Leopold, S. Cinta-Pinzaru, M. Baia, E. Antonescu, O. Cozar, W. Kiefer i J. Pop, Vib.
Spectrosc. 39 (2005) 169-176.
4. S. Farquharson, A. Gift, C. Shende, F. Inscore, B. Ordway, C. Farquharson i J.
Murren,Molecules 13 (2008) 2608-2627.
5. T. Iliescu, M. Baia i W. Kiefer, Chem. Phys. 298 (2004) 167-174.
6. I. Izquierdo-Lorenzo, J. V. Garca-Ramos i S. Sanchez-Cortes, J. Raman Spectrosc.
(2013), dio posebnog izdanja u sklopu konferencije ECONOS 2012.
7. G. G. Huang, M. K. Hossain, X. X. Han i Y. Ozaki, Analyst 134 (2009) 2468-2474.
8. H. M. Routtienen i U. K. Rinne, J. Neurol. 245 (1998) 25-34.
9. D. kalec amec, E. Metrovi i A. Sander, Chem. Biochem. Eng. Q. 26 (2012) 163-
173.
10. J. Leppnen, E. Wegelius, T. Nevelainen, T, Jr vinen, J. Gynther i J. Huuskonen, J.
Mol.Struct. 56 (2001) 129-135.
11. D. kalec-amec, M. Marinkovi , Z. iljkovi i M. Horvat, Patentna prijava WO
2007/135406 A1.
12. M. Markovi, T. Biljan i D. kalec amec, Entacapone Isomer Quantification using
Raman Spectroscopy, Poster, XXIX EUCMOS 2008, Opatija, Hrvatska, 31.08.-
05.09.2008., Knjiga saetaka str. 244.
13. M. Yadav, P. Dixit, V. Trivedi, A. Gandhi, A. Senger, S. Guttikar, P. Singhal i P. S.
Shrivastav, J. Chromat. B 877 (2009) 533-540.
14. N. Soukhova, Z. Kassymbek, S. Bradby, A. Martin-Esker, P. White i S. Wahab. J.
Pharm.Biomed. Anal. 54 (2011) 860-865.
15. M. Ratkaj, T. Biljan i S. Miljani, Appl. Spectrosc. 66 (2012) 1468-1474.
16. P. Novak, A. Kii , T. Hrenar, T. Jednaak, S. Miljani i G. Verbanec, J. Pharm.
Biomed. Anal. 54 (2011) 660-666.
17. H. R. H. Ali, H. G. M. Edwards i I. J. Scowen, J. Raman Spectrosc. 40 (2009) 887-892.
18. Y. Hu, A. Erxleben, A. G. Ryder i P. McArdle, J. Pharm. Biomed. Anal. 53 (2010) 412-
420.
19. R. Aroca, Surface-enhanced Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, West Sussex,
2006.
20. G. Socrates, Infrared and Raman Characteristic Group Frequenscies: Tables and
Charts, John Wiley & Sons, New York, 2004
21. F.R. Dollish, W.G. Fateley i F.F. Bentley, Characteristic Raman Frequencies of Organic
Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1974
22. M. Dendisov-Vykovsk, V. Prokopec, M. lupek i P. Matjka, J. Raman Spectrosc.
(2012) 181-186.
23. J. H. Giles, D. A. Gilmore i M. Bonner Denton, J. Raman Spectrosc. 30 (1999) 767-771.