TRANSGENESIS Y CLONACION EN REPRODUCCIN PORCINA

ANGELA MILENA CORTES TORO

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.A

FACUTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
VICE-RECTORIA DE INVESTIGACIONES
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
BOGOT
2008
 TRANSGENESIS Y CLONACION EN REPRODUCCIN PORCINA

ANGELA MILENA CORTES TORO

Trabajo de grado
Requerido para optar al titulo de
Mdicos Veterinarios Zootecnistas

Director: Doctor David Pineda. MV. Patlogo Genital. Docente de

reproduccin U.D.C.A.

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.A

FACUTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
VICE-RECTORIA DE INVESTIGACIONES
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
BOGOT
2008
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 Nota de aceptacin

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______________________________
Firma del director

_____________________________
Firma del codirector

_____________________________
Firma del jurado

_____________________________
Firma del jurado

Bogot, mayo 2008

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 CONTENIDO

pg.

INTRODUCCION 8
1. OBJETIVOS 10
1.1 OBJETIVO GENERAL 10
1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 10
2. MARCO TEORICO 11
2.1 FISIOLOGA DE LA FECUNDACIN PORCINA 11
2.1.1 El ovocito 11
2.1.2 El espermatozoide 17
2.1.3 El oviducto 20
2.1.4 Desarrollo embrionario preimplantacional 22
2.2 PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS 25
2.2.1 Fecundacin in Vitro 25
2.2.2 Maduracin in vitro 30
2.2.3 Cultivo de Embriones 33
2.3 TRANSGENESIS Y CLONACION 39
2.3.1 Transgnesis en animales 39
2.3.2 Clonacin 55
3. METODOLOGIA 76
4. IMPACTO ESPERADO 77
5. CONCLUSIONES 78
BIBLIOGRAFIA 80

4
 LISTA DE TABLAS

pg.

Tabla 1. Animales transgnicos 40

Tabla 2. Mamferos transgnicos. 41

Tabla 3. Produccin de mamferos transgnicos en diferentes especies. 52

Tabla 4. Trasplantes de rganos de animales a humanos. 53

Tabla 5. Principales Tipos de Celulares Utilizados en las Tcnicas de

Clonacin 58

Tabla 6. Factores que Afectan las Tasas de Gestacin en La Particin de

Embriones 61

Tabla 7. Cronologa de la clonacin mediante transferencia Nuclear y

Separacin de blastmeros 63

Tabla 8. Principales ventajas de la particin o divisin de Embriones 68

Tabla 9. Comparacin entre la clonacin por separacin de Blastmeros y la

transferencia nuclear 69

5
 RESUMEN

Esta monografa se basa en la recopilacin de informacin de biotecnologas en

la reproduccin animal como es la transgnesis y la clonacin en porcicultura para
el mejoramiento gentico de esta especie.

Desde el principio de los tiempos, el hombre ha intentado modificar las

caractersticas de los animales domsticos intentando incrementar tecnologas
que mejoren condiciones de los animales de compaa, de produccin, de trabajo,
mediante la seleccin de los ms aptos y el cruzamiento de ejemplares que
presentan mejores caractersticas: mayor produccin de carne y leche o ms
fuerza y resistencia tanto a enfermedades, medio ambiente y consanguinidad.
El enorme avance de la investigacin biotecnolgica en los ltimos aos ha
favorecido el desarrollo de tcnicas que permiten introducir, eliminar o modificar de
forma especfica un gen, o determinados tipos genes, en el genoma de un
organismo para producir seres vivos (animales, plantas y microorganismos) con
nuevas y mejores caractersticas. Este tipo de tcnicas se denominas ingeniera
gentica y los seres vivos que as se obtienen son los llamados organismos
modificados genticamente. La ingeniera gentica incluye un conjunto de
mtodos que permiten aislar y fraccionar el DNA, y ensamblar los fragmentos
obtenidos con otras molculas de DNA.

Por tal motivo, la clonacin como la transgnesis representan una de las

tecnologas de gran inters mundial en la actualidad, debido a su aplicabilidad
tanto en los animales como en los seres humanos.

El sector porcino caracterizado por un alto nivel tecnolgico de alta competitividad

en el mercado ha impulsado un gran proceso de modernizacin del sector,
optimizando todos los recursos y factores que intervienen en la produccin
porcina. Estas importantes transformaciones en los sistemas de produccin
intensiva, hacen a la industria porcina sea muy receptiva al uso de las nuevas
tecnologas de la reproduccin, de modo que se puedan reducir costos y se
incremente la eficacia en la produccin.

En un futuro se podra llegar a disear genticamente, gracias a la tecnologa

transgnica, las caractersticas productivas del animal, de modo que se contara
con cerdos con un crecimiento ms rpido, menor cantidad de grasa en la canal,
mejores ndices de conversin o mayor resistencia a enfermedades.

6
Por lo tanto, el inters que despierta la tecnologa de la reproduccin, tanto en el
rea de la medicina como en la industria porcina, aumenta el afn por el desarrollo
de nuevos adelantos as como la puesta en marcha de las existentes. Uno de los
avances tecnolgicos que ms rpidamente se han desarrollado en esta dcada
ha sido la produccin in vitro (PIV) de embriones porcinos.

El objetivo del trabajo se basa en revisar literatura en las diferentes biotecnologas

de la reproduccin animal haciendo un enfoque en la clonacin y transgnesis en
el rea de porcicultura.

7
 INTRODUCCION

En los ltimos aos, la biotecnologa de la reproduccin en los animales

domsticos ha experimentado un gran crecimiento, aportando nuevas tcnicas
que han repercutido en el desarrollo de innovadoras vas de investigacin en el
campo de la medicina humana, as como de la industria animal. La biotecnologa
de la reproduccin incluye un conjunto muy diverso de tcnicas, entre las que se
encuentran: inseminacin artificial (IA), transferencia de embriones,
crioconservacin de gametos y embriones, citometra de flujo para el sexaje de
espermatozoides, produccin in vitro de embriones (PIV), transferencia nuclear y
microinyeccin de construcciones de ADN (Transgnesis y Clonacin). Algunas de
estas tecnologas, como es el caso de la IA, estn ampliamente implantadas en
porcino; sin embargo, el desarrollo de nuevas tecnologas de la reproduccin en
porcinos est todava retrasado respecto al bovino, a pesar del tremendo progreso
que ha experimentado en estos ltimos aos (Niemann y Rath, 2001).

Debido a las semejanzas fisiolgicas que comparte con los humanos, el cerdo se
considera la especie de eleccin como potencial donante xengrafo y como
productor de protenas de inters farmacutico secretadas por la leche de
animales transgnicos, obtenidos mediante microinyeccin de ADN en el
proncleo del zigoto. Adems, recientemente se ha conseguido clonar con xito
cerdos producidos por transferencia del ncleo de clulas somticas de animales
adultos al citoplasma de ovocitos maduros (Polejaeva et al., 2000). Debido a que
las tcnicas de produccin de cerdos clonados y transgnicos requieren ovocitos
maduros y zigotos, respectivamente, existe un creciente inters en la produccin
de ovocitos maduros y embriones porcinos a gran escala, mediante tcnicas de
maduracin y fecundacin in vitro (MIV/FIV), con el fin de ser empleados en el
campo de la investigacin bsica y biomdica.

Por ende, desde sus primeros inicios el hombre ha seleccionado plantas y

domesticado animales mediante el cruzamiento selectivo de individuos con el fin
de transferir los caracteres deseados. La principal limitante de este proceso radica
en la incompatibilidad sexual observada cuando los organismos son muy
divergentes genticamente, lo que impide esta transferencia entre especies. La
ingeniera gentica permite romper esta barrera posibilitando la incorporacin de
genes desde otras especies que de otra forma sera imposible con los mtodos de
mejoramiento tradicional. De esta forma los organismos genticamente
modificados o ms comnmente denominados transgnicos son organismos vivos

8
(plantas, animales o bacterias) manipulados genticamente mediante la insercin
de un gen que habitualmente no formaba parte de su repertorio gentico. La
finalidad de esto es proporcionar a la planta o animal nuevas caractersticas
productivas y hacerlos ms eficientes y competitivos (Clark, 2002).
A pesar de que actualmente es de baja eficiencia, muestra que constituye una
alternativa en la solucin de los problemas reproductivos. En la medida en que se
tenga mayor comprensin de sus deficiencias, en un futuro muy cercano permitir
seleccionar y reproducir animales de inters econmico y ecolgico a gran escala.
Actualmente se requieren grandes cantidades de material biolgico de alta calidad
para obtener resultados positivos lo que incrementa el costo de la tcnica (Singla y
col 1997)

Por otra parte, el sector porcino, caracterizado por un alto nivel tecnolgico,
supone un porcentaje muy importante de la actividad agraria europea. Este
mercado tan competitivo ha impulsado un gran proceso de modernizacin del
sector, optimizando todos los recursos y factores que intervienen en la produccin
porcina. Estas importantes transformaciones en los sistemas de produccin
intensiva, hacen a la industria porcina muy receptiva al uso de las nuevas
tecnologas de la reproduccin, de modo que se puedan reducir costos y se
incremente la eficacia en la produccin. En un futuro se podra llegar a disear
genticamente, gracias a la tecnologa transgnica, las caractersticas productivas
del animal, de modo que se contara con cerdos con un crecimiento ms rpido,
menor cantidad de grasa en la canal, mejores ndices de conversin o mayor
resistencia a enfermedades.

Por lo tanto, el inters que despierta la tecnologa de la reproduccin, tanto en el

rea de la medicina como en la industria porcina, aumenta el afn por el desarrollo
de nuevas tecnologas as como la puesta en marcha de las existentes. Uno de los
avances tecnolgicos que ms rpidamente se han desarrollado en esta dcada
ha sido la produccin in vitro (PIV) de embriones porcinos, la transgnesis y la
clonacin. Se han puesto a punto los procedimientos necesarios para la
produccin a gran escala de embriones: obtencin de ovocitos recogidos de
matadero, maduracin (MIV) y fecundacin (FIV) en el laboratorio. Adems, del
desarrollo de la ingeniera gentica en la utilizacin de diferentes especies adems
de los cerdos en pro del desarrollo de alternativas teraputicas para el ser humano
utilizando como mediadores a los animales a travs de la transgnesis y la
clonacin.

9
 1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL

Realizar una revisin de literatura actualizada sobre la importancia de la clonacin,

transgenesis y desarrollo embrionario in Vitro en la reproduccin porcina.

1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Determinar los factores que afectan la calidad de los ovocitos y su importancia

en la produccin in Vitro de embriones porcinos para as establecer los
procesos de fecundacin in Vitro, as como determinar los factores y efectos de
este mismo en la viabilidad del ovocito y del espermatozoide.

Identificar las tcnicas de clonacin de embriones utilizadas en porcicultura para

reproducir animales genticamente idnticos.

Conocer las ventajas y desventajas de las tcnicas de clonacin, para

determinar la viabilidad del donador y determinar con esto su valor gentico,
adems de, determinar la importancia de los xenotrasplantes como alternativa
en la produccin de rganos para transplantes en humanos.

Reconocer la importancia de los animales transgnicos en salud publica como

en reproduccin porcina y su aporte a la generacin de modelos para el estudio
de enfermedades que afectan a los humanos.

10
 2. MARCO TEORICO

2.1 FISIOLOGA DE LA FECUNDACIN PORCINA

El diseo de un sistema de produccin con uso de biotecnologas en reas de

produccin in vitro de embriones, transgnesis y clonacin precisa de un
conocimiento previo de los sucesos que acontecen en el proceso de fecundacin
in vivo y de las condiciones ambientales a las que van a estar sometidos los
gametos masculino y femenino dentro del aparato reproductor de la hembra en las
diferentes fases de dicho proceso. Como apunt Yanagimachi (1988): la madre
naturaleza ha hecho su trabajo durante millones de aos, mientras que nosotros
hemos comenzado a imitarla hace muy poco; por lo tanto, hay muchas cosas que
an debemos aprender de ella.

2.1.1 El ovocito

Ovognesis. Durante el desarrollo fetal, las clulas germinales primordiales del

ovario van a sufrir un proceso de diferenciacin. Primero se transforman en
ovogonias por sucesivas divisiones mitticas, las cuales dan lugar a los ovocitos
primarios al iniciarse la primera divisin meitica.

La meiosis es un tipo de divisin celular exclusiva de las clulas germinales

(ovogonias y espermatogonias) y su objetivo es doble: la reduccin a un nmero
haploide de cromosomas y la recombinacin de la informacin gentica (Polanski
y Kubiak, 1999). Antes de sufrir la meiosis, las clulas germinales replican su ADN
y contienen en ese momento 4 copias de ADN y un nmero 2n de cromosomas,
como cualquier clula diploide; mientras que entre las dos divisiones meiticas la
replicacin de ADN queda suprimido, lo que asegura que los gametos resultantes
sean haploides. La meiosis consiste en dos divisiones: en la primera, las dos
clulas hijas pasan a tener 1n cromosomas y 2 copias de ADN; y en la segunda,
las 2 clulas resultantes contienen 1n cromosomas y 1copia de ADN. As, con la
meiosis se obtienen 4 clulas hijas haploides y genticamente diferentes, en el
caso del macho; mientras que en la hembra slo da lugar a una clula, pues las
dos divisiones meiticas son asimtricas, y en cada una se forman una clula
grande y otra pequea abortiva (corpsculo polar). De este modo, se minimiza la
prdida de productos almacenados en el ovocito, necesarios para el posterior
desarrollo embrionario temprano.

En las hembras, toda la poblacin de ovocitos entra en meiosis sincrnicamente

en la vida fetal. La primera divisin meitica progresa hasta que el ovocito alcanza
el estadio de diploide difuso de la profase I (estado dictiato), donde se produce la

11
primera detencin de la meiosis, justo antes o poco despus del nacimiento. A
partir de este momento, el ovocito comienza a ser rodeado por clulas
pregranulosas, las cuales forman una membrana basal alrededor de ellas,
quedando formado el compartimento folicular. La primera parada de la meiosis se
mantiene hasta momentos antes de la ovulacin o de la atresia folicular (Tsafriri et
al., 1983), y es importante para asegurar que el ovocito disponga de tiempo
suficiente para crecer antes de la fecundacin, de modo que sea capaz de
mantener el proceso de la embriognesis.

Esta interrupcin se mantiene mediante un sistema de control mltiple en el que

estn implicados el adenosil monofosfato cclico (AMPc) (Schultz, 1991; Mattioli,
1994; Dekel, 1999), la hipoxantina (Stromstedt y Byskov, 1999; Dekel, 1999) y el
factor inhibidor de la maduracin del ovocito (Dekel, 1999), entre otros factores
(Thibault et al., 1987), y cuya finalidad es mantener inactivo al factor promotor de
la maduracin (MPF). Se ha comprobado que el MPF es un regulador universal
(desde las levaduras hasta el hombre) de la transicin de la fase G2 a metafase
tanto en la mitosis como en la meiosis, por lo que se ha propuesto llamarle factor
promotor de la metafase, manteniendo las mismas siglas. El MPF (Dekel, 1996)
est constituido por una proteinkinasa (p34cdc2) y una ciclina. Aunque no est
muy claro el mecanismo por el que el AMPc regula la detencin meitica, parece
ser que su accin en el ovocito viene mediada por la proteinkinasa A que, a travs
de una cascada de reacciones bioqumicas no conocidas, previene la
defosforilacin de la proteinkinasa p34cdc2, manteniendo al MPF en un estado
inactivo (Dekel, 1999)

En este estadio, los ovocitos se caracterizan por tener un ncleo prominente,

denominado vescula germinal (VG) (Franchi et al., 1962), y por estar rodeados
por una capa de clulas epiteliales (foliculares), lisas no proliferativas, conocidas
como clulas pregranulosas, que ejercen un efecto inhibidor sobre la meiosis y el
crecimiento folicular. En el momento del nacimiento, la mayora de los ovocitos
han alcanzado este estadio y se encuentran formando los folculos primordiales,
siendo la nica fuente de gametos femeninos en el animal sexualmente maduro.

Crecimiento del folculo y del ovocito. El ovocito y el folculo sufren un periodo

de crecimiento, que se caracteriza por ser una fase de intensa sntesis proteica y
de almacenamiento de macromolculas (Moor el al., 1990). El folculo primordial
se transforma en folculo primario, donde el ovocito est rodeado por una capa
unilaminar de clulas granulosas cuboides, derivadas de las pregranulosas. En el
folculo primario se produce un aumento del volumen del ovocito, sin divisin
celular del mismo, y una hiperplasia e hipertrofia de las clulas de la granulosa,
dando lugar al folculo secundario (un folculo preantral multilaminar). En el ratn
se ha identificado un factor de diferenciacin del crecimiento, conocido como GDF-
9, necesario en el inicio del crecimiento folicular al estimular la multiplicacin de
las clulas de la granulosa, y que solamente se expresa en el ovocito (Stromstedt

12
y Byskov, 1999; Dong et al., 1996). El crecimiento folicular va acompaado de la
formacin de una capa de clulas de la teca vascularizada alrededor de la
membrana basal.

Al alcanzar las clulas de la granulosa un nmero elevado, y en respuesta a la

FSH, se forma la cavidad antral repleta de fluido folicular (Canipari, 1994). Tras la
formacin del antro, las clulas de la granulosa se diferencian en dos
subpoblaciones: por una parte, las clulas de la granulosa que revisten la pared
del folculo y forman un epitelio estratificado en contacto con la lmina basal; y por
otra, las clulas del cumulus oophorus que forman varias capas de clulas
cilndricas alrededor del ovocito (Canipari, 1994). Cuando el folculo ha formado la
cavidad antral, pasa a llamarse folculo terciario, antral o de Graaf, y alcanza un
dimetro aproximado de 2,2 mm (Motlik et al., 1984).

El crecimiento del ovocito va unido a un aumento en el nmero de orgnulos

citoplasmticas, como mitocondrias, aparato de Golgi y ribosomas, y a la
formacin de los grnulos corticales a partir del complejo de Golgi (Stromstedt y
Byskov, 1999). Toda esta maquinaria celular, indicativa de una elevada actividad
metablica, permite la sntesis y almacenamiento de ARN, protenas y enzimas y,
en las ltimas etapas del crecimiento, el desarrollo de la red de microtbulos y
filamentos. Tambin durante la fase de crecimiento se forma la zona pelcida
(ZP), una cubierta extracelular glicoproteica que rodea a los ovocitos mamferos.
La capa de clulas del cmulus ms prxima a la ZP se conoce con el nombre de
corona radiata.

En esta etapa de crecimiento se van a establecer unas comunicaciones entre el

ovocito y las clulas del cmulus, mediante unos procesos citoplasmticos de las
clulas de la corona radiata que cruzan la ZP y conectan con el oolema, conocidos
como uniones tipo gap (Gilula et al., 1978). Las clulas de la granulosa tambin se
interconectan mediante uniones tipo gap (Albertini y Anderson, 1974). Este
entramado de uniones intercelulares posibilita el intercambio de molculas entre el
ovocito, las clulas de la granulosa y la circulacin sangunea, con una finalidad
nutritiva y reguladora, constituyendo el proceso de cooperacin metablica
(Canipari, 1994). Las clulas somticas proporcionan nuclesidos, aminocidos y
fosfolpidos, adems de mantener un balance inico y una estabilidad en el ARNm
en los ovocitos (Hunter, 2000). Esta cooperacin es bidireccional, de modo que los
ovocitos porcinos secretan un factor de expansin del cmulus (Nagyova et al.,
1997), adems de un(os) factor(es) soluble(s) que regula(n) la esteroidognesis de
las clulas del cmulus (Coskun et al., 1995), suprime(n) la luteinizacin y
promueve(n) la proliferacin de clulas de la granulosa en cultivo (Brankin et al.,
1999). No se han identificado estos factores solubles, aunque entre los candidatos
estaran varios factores de crecimiento, incluido el GDF-9.

13
Los folculos dominantes sern seleccionados de entre los folculos antrales para
continuar su crecimiento (Stromstedt y Byskov, 1999). La seleccin de los folculos
que producirn ovocitos maduros listos para ovular en cada ciclo estral est
determinada por la expresin de receptores para la hormona luteinizante (LH) y la
hormona folculo estimulante (FSH) en sus clulas de la granulosa (Espey, 1999).
Por ejemplo, en los folculos antrales pequeos, cuyas clulas de la granulosa no
poseen receptores para la LH, la reanudacin de la meiosis inducida por esta
gonadotropina no se podr producir; por lo tanto, los folculos seleccionados
debern disponer de estos receptores. Los receptores para la FSH, slo presentes
en la hembra en las clulas de la granulosa, aumentan de nmero en la fase de
crecimiento (Stromstedt y Byskov, 1999). Al actuar sobre las clulas de la
granulosa, la FSH va a desencadenar la expresin de una batera de genes que
codifican factores de crecimiento, enzimas y protenas involucradas en la
esteroidognesis y pptidos que regulan la liberacin de gonadotropinas; los
cuales se van a sintetizar y acumular en el fluido folicular (Stromstedt y Byskov,
1999). Adems las clulas de la teca, estimuladas por la LH, van a sintetizar
andrgenos que, posteriormente, sern transformados en estradiol por las clulas
de la granulosa (Stromstedt y Byskov, 1999). Los folculos dominantes tienen un
mayor nmero de receptores para la FSH y son ms sensibles a ella que el resto
de folculos antrales, por lo que van producir grandes cantidades de estradiol e
inhibina. El estradiol y la inhibina van a regular negativamente la secrecin de FSH
y, al disminuir su concentracin, los folculos menos sensibles a la FSH
degeneran, sufriendo el proceso de atresia (Stromstedt y Byskov, 1999).

Justo despus del pico preovulatorio de LH, los folculos seleccionados comienzan
una rpida expansin como resultado de la acumulacin de fluido folicular en el
antro. Las altas concentraciones de gonadotropinas en el fluido folicular cambian
el patrn de sntesis de esteroides de las clulas de la granulosa y la teca (Espey,
1999), y preparan al ovocito para la reanudacin de la meiosis y la maduracin.

Maduracin del ovocito. La maduracin del ovocito, dividida en maduracin

nuclear y citoplasmtica, hace referencia a todos los cambios nucleares,
citoplasmticos y de membrana que sufre el ovocito, con el fin de prepararse para
ser fecundado con xito y desarrollarse posteriormente.

El estmulo que desencadena el inicio de la maduracin del ovocito es el aumento

preovulatorio en los niveles de gonadotropinas, en especial de LH. Adems de la
reanudacin de la meiosis, el pico de la LH desencadena otras transformaciones
dentro del folculo, como alteraciones en la esteroidognesis folicular y cambios en
el complejo cmulus-ovocito (COCs) (Moor et al., 1990; Motlik et al., 1986). La
respuesta inmediata de las clulas de la granulosa a la interaccin con la LH es la
activacin de la adenilato ciclasa y la generacin de AMPc.

14
Por tanto, la reanudacin de la meiosis viene precedida por un aumento en el
AMPc; lo que parece estar en contradiccin con su actuacin en el manteniendo
del bloqueo meitico en el ovocito. La explicacin es que el AMPc desempea un
papel doble en la regulacin de la meiosis. Los niveles basales de AMPc
producidos por las clulas somticas en los folculos antrales pequeos son
transferidos de manera continua al ovocito, a travs de las uniones tipo gap, para
mantenerlo en la parada meitica, pues el ovocito no es capaz de producir AMPc a
los niveles necesarios. Sin embargo, a partir de la formacin de receptores para la
LH en las clulas del cmulus y granulosa del grupo de folculos dominantes,
stos pueden responder al pico preovulatorio de la LH produciendo grandes
cantidades de AMPc. Las elevadas concentraciones de AMPc en los folculos
dominantes median en la accin de la LH sobre la conexina 43, una protena que
forma parte de las uniones tipo gap ovricas. Mediante reacciones de fosforilacin/
defosforilacin, se producen cambios en la conformacin de la conexina 43 que
inducen una inmediata reduccin de las comunicaciones intercelulares en dichos
folculos y, por tanto, en la cooperacin metablica entre sus clulas (Gilula et al.,
1978; Sller y Schultz, 1980). Este fenmeno, conocido como expansin o
mucificacin del cmulus (Eppig, 1979), se produce 16 horas despus del pico de
gonadotropinas. Bajo esas condiciones, el flujo de AMPc desde las clulas del
cmulus hacia el ovocito desciende por debajo del umbral requerido para inhibir la
activacin del factor promotor de la maduracin (o de la metafase) (MPF) y el
ovocito reanuda la meiosis (Dekel, 1999). Esto explica porqu se produce una
reanudacin espontnea de la meiosis al extraer los ovocitos de los folculos y
cultivarlos in vitro, incluso en ausencia de hormonas, como consecuencia del
rpido deterioro de la integridad morfolgica de las clulas foliculares (Moor y
Crosby, 1987) que conlleva una disminucin en el flujo de AMPc hacia el ovocito
(Motlik et al., 1986).

La maduracin nuclear comienza tras la reanudacin de la meiosis. El paso de VG

a metafase II (MII) conlleva: la disolucin de la membrana nuclear conocida como
rotura de la vescula germinal, la formacin del huso meitico y la condensacin
de la cromatina en cromosomas homlogos que se alinean en el huso, alcanzando
entonces el estadio de metafase I; para continuar con la segregacin de los dos
grupos de cromosomas homlogos, dando lugar a la extrusin del primer
corpsculo polar (CP) y al paso del ovocito al estadio de MII. La maduracin
nuclear finaliza cuando el ovocito completa la primera divisin meitica con la
formacin del primer CP, alcanzando el estadio de MII, unas 36-40 horas despus
del pico de LH (Hunter, 1988), tras lo cual se produce la segunda detencin de la
meiosis.

El MPF en forma activa es necesario para la rotura de la VG, la condensacin de

la cromatina, y su actividad alcanza un pico en metafase I y II, para decrecer en
anafase I y II (KiKuchi et al., 1995), lo que indica que su inactivacin tambin es
necesaria para esta progresin. Por otra parte, la reorganizacin de los

15
 microtbulos y la apropiada orientacin del huso durante la MI parece estar
mediada por las MAP kinasas (MAPK), cuya actividad tambin est inhibida de
algn modo por el AMPc y aumenta con la reanudacin de la meiosis. A diferencia
del MPF, la actividad de las MAPK permanece elevada en los estadios de
anafase.

La maduracin citoplasmtica, en cambio, es un trmino ms amplio que abarca

una serie de acontecimientos no directamente relacionados con la progresin de la
meiosis pero que preparan al ovocito para la fecundacin y el desarrollo
embrionario posteriores (Abeydeera, 2002).

En el citoplasma del ovocito se produce una redistribucin de las mitocondrias y

de los grnulos corticales (GC) (Thibault et al., 1987; Cran, 1985). Tras la rotura
de la VG, las mitocondrias migran para situarse en una posicin perinuclear
durante la maduracin (Thibault et al., 1987; Cran, 1985), siendo este movimiento
mitocondrial necesario para la progresin de la maduracin (Moor et al., 1990).
Los GC son un tipo especial de lisosomas primarios, formados a partir del
complejo de Golgi y del retculo endoplsmico, compuestos por glicoprotenas y
enzimas hidrolticas. Los GC migran hacia la periferia del ovocito, aumentan de
nmero al final del periodo de maduracin (Cran, 1985) y se sitan debajo de la
membrana plasmtica formando una monocapa (Crang y Cheng, 1986);
circunstancia que ser fundamental para el bloqueo de la poliespermia.

Adems, la maduracin citoplasmtica implica una reprogramacin de la sntesis

proteica. Parte del ARNm que haba sido almacenado durante la fase de
crecimiento comienza a transcribirse, sintetizndose nuevas protenas que sern
esenciales en la progresin de la meiosis, la regulacin de la penetracin
espermtica y la descondensacin de la cabeza del espermatozoide (Moor et al.,
1990). Entre estas protenas, el factor de crecimiento del proncleo masculino, que
ser esencial para la formacin del proncleo masculino tras la penetracin del
espermatozoide.

Ovulacin. El pico preovulatorio de LH, inducido por el estradiol producido por

los folculos preovulatorios, desencadena finalmente la ovulacin (Stromstedt y
Byskov, 1999). La LH tambin estimula la luteinizacin de las clulas de la pared
de los folculos ovulados, es decir su transformacin de productoras de estrgenos
a productoras de progesterona, que ser la principal hormona esteroidea
producida por el cuerpo lteo tras la ovulacin (Geisert, 1999).

En la especie porcina, la ovulacin suele tener lugar 30-40 horas despus del
inicio del estro, tomando el pico preovulatorio de LH como da 0 del ciclo estral, y
dura de 1 a 3 horas (Geisert, 1999). Sin embargo, segn otros autores (Du Mesnil
Du Buisson, et al., 1970) el comienzo de la ovulacin es posterior (38-42 h),
debido a que tanto el inicio como la duracin de la ovulacin pueden variar

16
ampliamente (Flowers y Esbenshade, 1993). Los folculos preovulatorios tienen un
tamao de 7 a 11 mm de dimetro y, momentos antes de la ovulacin, sus tensas
paredes se vuelven pendulantes y flcidas como consecuencia de una
disminucin de la presin intrafolicular y los complejos cmulus-ovocito (COCs) se
desligan de la pared folicular (Hunter, 1967; Hunter, 1988).

El nmero de ovocitos liberados durante la ovulacin es variable, oscilando entre

10 y 24 (Geisert, 1999); y se encuentran en estadio de MII con el primer CP
separado y rodeados por las clulas del cmulus y por lquido folicular viscoso.

2.1.2 El espermatozoide. En los mamferos, el espermatozoide es la nica

clula diseada para abandonar el organismo y as poder completar su funcin
biolgica de unin al ovocito maduro durante la fecundacin, formando el zigoto.
Muchos de sus rasgos fsicos y bioqumicos han evolucionado de modo que se
asegure el paso a travs del tracto reproductivo masculino y femenino, la
proteccin del ADN de la cabeza espermtica durante este trnsito, la penetracin
de las envolturas del ovocito, y la fusin con la membrana plasmtica del ovocito.

Las especiales caractersticas presentes en el espermatozoide incluyen: un

genoma haploide, un contenido de ADN nuclear altamente condensado y
transcripcionalmente inactivo, protenas nucleares especficas (protaminas en
sustitucin de las histonas) relacionadas con la compactacin de este material
gentico, un compartimento acrosomal con enzimas hidrolticas localizado en la
parte anterior de la cabeza espermtica y de vital importancia en la fecundacin,
un axonema equipado para proporcionar movilidad con caractersticas
estructurales no vistas en los flagelos de otras clulas eucariotas o procariotas, y
una membrana plasmtica que presenta una polaridad extrema en la distribucin
de sus protenas y lpidos (Millette, 1999).

De este modo, el espermatozoide queda estructurado en cabeza y cola. La

cabeza, que en el caso del cerdo es de forma oval, contiene el acrosoma y el
ncleo; mientras que la cola, dividida en cuello, pieza intermedia y pieza principal,
contiene el axonema y una funda de mitocondrias localizada en la porcin
intermedia rodeando al axonema (Robl y Fissore, 1999).

Espermatognesis. La espermatognesis es el proceso de transformacin

gradual desde clula germinal hasta espermatozoide y consta de tres fases:
proliferacin, divisin reductora (o meiosis) y diferenciacin (o espermigenesis).
La espermatognesis tiene lugar en los tbulos seminferos de los testculos, cuyo
epitelio consta de dos tipos de clulas: las clulas germinales y las clulas
somticas o de Sertoli (Hess, 1999). A diferencia de los ovocitos, los
espermatozoides son producidos a partir de la pubertad y durante el resto de la
vida, en la mayora de los machos (Robl y Fissore, 1999).

17
En la fase de proliferacin, las clulas germinales masculinas se transforman en
espermatogonias por sucesivas divisiones mitticas. En la fase de meiosis, las
espermatogonias sufren dos divisiones meiticas que, como se explic en el
apartado son simtricas y dan lugar a 4 clulas hijas haploides y genticamente
diferentes, dos de ellas portadoras del cromosoma sexual X y las otras dos del Y,
llamadas espermtidas. Finalmente, las espermtidas sufren una fase prolongada
de diferenciacin, conocida como espermiognesis, en la que experimentan un
conjunto de modificaciones que les llevan a convertirse en una clula altamente
especializada, el espermatozoide.

Durante esta metamorfosis celular, los principales cambios estructurales que sufre
la espermtida son: elongacin del ncleo y condensacin de la cromatina,
formacin del acrosoma a partir del aparato de Golgi, formacin de una larga cola
que contiene el axonema (formado a partir del complejo centriolar) y mitocondrias
en su regin intermedia, y prdida del contenido citoplasmtico no necesario
(Hess, 1999; Oko y Clermont, 1999). Una vez completado el proceso, los
espermatozoides son liberados a la luz del tbulo seminfero (Robl y Fissore,
1999).

Maduracin final del espermatozoide

- Epiddimo. Los espermatozoides abandonan el testculo y pasan a travs del

epiddimo hasta el conducto deferente. Los espermatozoides testiculares, aunque
ya transformados en clulas altamente especializadas, no son todava capaces de
fecundar, sino que an deben experimentar una maduracin final, que va a tener
lugar durante su transporte a travs del epiddimo. A lo largo de su trayecto por el
epiddimo, se producen una serie de transformaciones en el espermatozoide que
le otorgan la capacidad de interaccionar con los gametos femeninos y fecundarlos
(Yanagimachi: 1988, 1994). Este proceso se conoce como maduracin
epididimaria.

Uno de los principales cambios que experimenta el espermatozoide es el

desarrollo de la capacidad de movimiento progresivo; ya que al abandonar el
testculo, los espermatozoides presentan una movilidad nula o muy dbil, debido,
en parte, a una falta de maduracin de su membrana plasmtica (Yanagimachi,
1994). Durante la maduracin epididimaria, los lpidos de la membrana de los
espermatozoides sufren diferentes alteraciones fsicas y qumicas (Wolf et al.,
1988), y se producen cambios en el patrn de distribucin de las protenas
intramembranosas (glicoprotenas) (Suzuki, 1990). Asimismo, se altera la
distribucin de los antgenos de la membrana acrosomal externa (Phillips et al.,
1991), que podra preparar al espermatozoide para la posterior fusin entre la
membrana acrosomal externa y la plasmtica que tendr lugar durante la reaccin
acrosmica. (Yanagimachi, 1994).

18
El epiddimo presenta una elevado nivel de sntesis de colesterol, que es
transferido a la membrana espermtica (Suzuki, 1990); por lo que se ha sugerido
que el colesterol sea una de las molculas claves en la alteracin de las
caractersticas de la mebrana plasmtica de los espermatozoides durante su
maduracin (Parks y Hammerstedt, 1985). La estabilizacin de la membrana por el
colesterol puede ser beneficiosa para el transporte de los espermatozoides a
travs de los diferentes, y a menudo hostiles, microambientes dentro del tracto
femenino antes de alcanzar al ovocito (Yanagimachi, 1994). Algunos
espermatozoides alcanzan su capacidad fecundante mucho antes (o en una
regin ms proximal del epiddimo) que otros; aunque es en la cola del epiddimo,
el principal reservorio de espermatozoides, donde la gran mayora de ellos
adquiere su completa capacidad fecundante (Yanagimachi, 1994). En el cerdo, el
transporte de los espermatozoides por el epiddimo dura 10 das, pudiendo
permanecer de 4 a 7 das almacenados en la cola del epiddimo antes de ser
eyaculados (Geisert, 1999).

- Eyaculacin. Durante la eyaculacin, los espermatozoides entran en contacto

con las secreciones de las glndulas accesorias del aparato genital masculino,
que constituyen el plasma seminal. El semen eliminado por la uretra consiste, por
tanto, en una suspensin de espermatozoides en plasma seminal.

En este proceso, los espermatozoides entran en contacto con unos factores

decapacitantes presentes en el plasma seminal. Estos factores, conocidos como
factores de decapacitacin o estabilizadores del acrosoma, se presentan en el
espermatozoide en forma de glicoprotenas de superficie. Los factores
estabilizadores del acrosoma evitan la capacitacin prematura de los
espermatozoides, de modo que stos no adquieran la capacidad fecundante final
mientras migran por el tracto genital femenino, antes de haber llegado al lugar
donde se llevar a cabo la fecundacin (Tpfer-Petersen et al., 1995).

La eyaculacin del verraco se produce en tres fases o fracciones: una fraccin

preespermtica, clara y constituida por plasma seminal libre o pobre en
espermatozoides; seguida por una fraccin rica o espermtica, de apariencia
cremosa debido a su elevada concentracin espermtica; y una fraccin pobre o
postespermtica, de color blanquecino o transparente, compuesta por plasma
seminal y una baja concentracin de espermatozoides.

Durante la eyaculacin, sobretodo al final, se secretan unos corpsculos

gelatinosos o tapioca procedentes de las glndulas de Cowper, que van a formar
un tapn para sellar el crvix de la hembra, evitando en la monta natural el reflujo
del voluminoso eyaculado del verraco (200-300 ml, aproximadamente) (Geisert,
1999).

19
2.1.3 El oviducto. El oviducto de los mamferos proporciona el microambiente
necesario para la captura, transporte y maduracin de los ovocitos ovulados; el
transporte, almacenamiento y capacitacin de los espermatozoides; la
fecundacin y finalmente, las primeras divisiones del embrin (Hunter, 1988). Este
microambiente apropiado se debe tanto a las caractersticas especiales de la
superficie celular del oviducto como al fluido oviductal.

Anatoma e histologa del oviducto. El oviducto se divide anatmicamente en

tres segmentos principales: el infundbulo, la ampolla y el istmo. El infundbulo
termina en unas fimbrias que conectan con el ovario para facilitar la captura del
ovocito en el momento de la ovulacin y est abierto hacia la cavidad peritoneal
por el ostium tubrico. El istmo conecta con el tero a travs de la unin tero
tubrica (UUT) (Beck y Boots, 1974).

La arquitectura histolgica del oviducto es muy sencilla, con una mucosa no

glandular (endoslpinx), cubierta por un epitelio pseudoestratificado de
revestimiento compuesto por clulas ciliadas y no ciliadas (o secretoras); dos
capas de msculo liso, una externa longitudinal y una interna circular (mioslpinx);
y una cubierta serosa (mesoslpinx) que se contina con la serosa peritoneal
(Rodrguez-Martnez et al., 1985).

El espesor de las capas mucosa y muscular no es homogneo a lo largo del

oviducto. Mientras que el grosor de la capa muscular interna disminuye hacia la
zona del ostium, los pliegues longitudinales de la capa mucosa adquieren mayor
complejidad, formando incluso pliegues secundarios y terciarios. Tambin vara la
proporcin de clulas ciliadas y secretoras a lo largo del oviducto, siendo en las
fimbrias y el infundbulo ms abundantes las clulas ciliadas, y disminuyendo a la
vez que se incrementan las clulas secretoras hacia el istmo (Hafez, 1972; Leese,
1983). Esta especial distribucin determina la presencia de compartimentos en la
superficie del oviducto con caractersticas especficas, que proporcionan el
ambiente ideal para soportar los procesos reproductivos que van a tener lugar
(Boatman, 1997).

Fluido oviductal. El fluido oviductal (FO) est constituido principalmente por una
mezcla compleja de sustancias derivadas del plasma sanguneo, a travs de
trasudacin selectiva, y de protenas oviductales especficas (Beier, 1974; Harper,
1988; Leese, 1988). El FO est compuesto por protenas, enzimas, aminocidos,
compuestos energticos, hormonas y electrolitos (Romar, 2001). La composicin
del FO vara en las distintas fases del ciclo ovrico. Estas variaciones estn
controladas por las hormonas ovricas esteroides (Cox y Leese, 1997). Tambin
se observan variaciones en las caractersticas fisicoqumicas del FO, tales como el
volumen, pH, osmolaridad, etc. Adems, la composicin y caractersticas del FO
no son homogneas en todo el oviducto, sino que varan segn la regin,
constituyendo diferentes microambientes (Biggers y Borland, 1976).

20
 Transporte del ovocito. En el momento de la ovulacin, el extremo fimbriado del
oviducto abraza al ovario, capturando el contenido de los folculos ovulados, es
decir, los ovocitos rodeados por un espeso agrupamiento de clulas del cmulus
(Hunter, 1989) y con una pequea cantidad de fluido folicular viscoso. Los ovocitos
se disponen en la ampolla oviductal, donde se forman agregados entre los COCs,
de ah son transportados hacia el lugar de la fecundacin, en la unin ampular
stmica, proceso que dura unos 30-45 minutos (Hunter, 1989).

En el transporte de los ovocitos intervienen las ondas de contraccin peristltica

del mioslpinx, el continuo batido hacia el tero de los cilios que revisten la
ampolla y los movimientos del mesoslpinx (Hunter, 1989). Durante el transporte
de los ovocitos, parece que se produce una maduracin final del ovocito
secundario debido al cambio de microambiente que experimenta al pasar del
folculo al oviducto (Hunter, 1989).

En el oviducto los ovocitos se denudan, es decir, pierden el revestimiento de

clulas del cmulus mediante la propia accin mecnica y por la accin enzimtica
de la hialuronidasa de las cabezas de los espermatozoides (Harper, 1988). Los
ovocitos permanecen en el lugar de la fecundacin durante 24-48 horas y aqullos
que han sido fecundados pasan al tero en estadio de embriones de 4 clulas
(Harper, 1989), mientras que los no fecundados degeneran en el tero por
reblandecimiento y degeneracin de la zona pelcida.

Transporte del espermatozoide. El transporte de los espermatozoides a travs

del tracto genital femenino se divide en tres etapas: 1) un rpido transporte
transuterino inmediatamente despus de la deposicin del semen, 2) la
colonizacin de un reservorio de espermatozoides en la UUT y en el inicio del
istmo (Hunter, 1995), y 3) una lenta liberacin de espermatozoides desde el
reservorio hacia el lugar de la fecundacin, en la unin ampular stmica, en
relacin con la ovulacin (Barrat y Cooke, 1991).

De los miles de millones de espermatozoides depositados en la cerda durante la

cubricin o IA, slo de cien a doscientos mil colonizan el reservorio de la UUT en
1-2 horas (Hunter, 1984). En l, los espermatozoides contactan con los cilios por
su regin apical (Rodrguez-Martnez et al., 1990; Mburu et al., 1997),
permaneciendo la mayora de ellos viables (Mburu et al., 1997). La detencin de
los espermatozoides en el reservorio se ve favorecida por la presencia de una
gran cantidad de secreciones mucosas muy viscosas (Rodrguez-Martnez et al.,
1998a), ricas en mucopolisacridos y glicoprotenas especficas, unido a la
reduccin de la luz del oviducto en la UUT y el istmo provocada por el edema de la
lmina propia (Hunter, 1984). Adems, parece que existe una unin selectiva de
espermatozoides al epitelio (Mburu et al., 1997), teniendo mayor afinidad aqullos
no capacitados (Fazelli et al., 1999). Mientras los espermatozoides permanecen

21
en el reservorio, se produce una disminucin de su metabolismo, y por tanto de su
movilidad, debido a las especiales condiciones fsico- qumicas que se dan en este
lugar (Smith, 1998).

Las funciones que va a desempear el reservorio espermtico son las de: prevenir
la poliespermia, gracias a la retencin de espermatozoides que evita que un
nmero elevado llegue a la zona de fecundacin; y modular la capacitacin
espermtica, mediante un mecanismo de retraso (Smith, 1998). Queda por
determinar si el retraso de la capacitacin es debido a las secreciones
intraluminales y/o a la unin de los espermatozoides a la membrana apical de las
clulas epiteliales del istmo (Murray y Smith, 1997).

2.1.4 Desarrollo embrionario preimplantacional

Vnculos materno embrionario. Durante los primeros estadios de la gestacin,

las interacciones maternas embrionarias en porcino tienen una gran importancia,
ya que en esta especie, como en otros ungulados domsticos, el periodo
preimplantacional es bastante prolongado. La importancia de esta estrecha
relacin entre el desarrollo embrionario y el ambiente uterino queda patente en la
sincrona necesaria entre el estadio del embrin y del tero en las transferencia de
embriones.

Periodo preeclosion

Divisin embrionaria. La fecundacin tiene lugar en el oviducto, en la unin

ampular stmica. La primera divisin se produce de 17 a 19 horas tras la ovulacin
(Hunter, 1974). Los embriones se mantienen en el estadio de 2 clulas slo de 6 a
8 horas; sin embargo el estadio de 4 clulas se prolonga durante 20-24 horas
(Flint, 1981), por lo que la mayora de los embriones entran en el tero en este
estadio (Harper, 1988; Davis, 1985). Segn Hunter (1974), los embriones y los
ovocitos no fecundados pasan al tero 46- 48 horas tras la ovulacin, aunque esta
entrada se puede prolongar hasta 3 das despus de la ovulacin.

Tras ese periodo de 2 das en el que los embriones son retenidos en el oviducto,
las concentraciones crecientes de progesterona van a causar la dilatacin del
oviducto y, como resultado, el paso de los embriones hacia el tero (Dziuk, 1985).
La retencin de los embriones en el oviducto permite que el ambiente uterino sufra
una serie de modificaciones, tales como el paso de granulocitos
polimorfonucleares a travs del epitelio uterino durante el estro (Stroband et al.,
1986). El oviducto secreta sustancias que podran modificar la composicin de la
ZP (Hedrick et al., 1987), y adems afectar a la tasa de divisin (Fukui et al., 1988)
o a la viabilidad embrionaria (Gandolfi y Moor, 1987). Asimismo, el ambiente

22
oviductal tambin provoca una demora en la digestin enzimtica de la ZP de los
embriones e influencia su funcin de barrera selectiva (Broemann et al., 1988).

El tero va a ser el compartimento en el que se desarrollarn los embriones

porcinos desde el estadio de 4 clulas hasta el nacimiento (Stroband y Van der
Lende, 1990). La pared uterina est constituida por la serosa, el miometrio y el
endometrio; y este ltimo est formado por una tnica propia y dos tejidos
epiteliales: el epitelio luminal y las glndulas, que reposan sobre la tnica propia
(Stroband y Van der Lende, 1990). El tero no es un simple saco en el que los
embriones flotan ms o menos libres, sino que su pared est plegada de tal modo
que los pliegues opuestos se entrelazan y la luz uterina queda reducida a un
espacio angosto. Las clulas epiteliales del tero sufren cambios en su altura a lo
largo del ciclo estral (Sidler et al., 1986), al igual que tambin se ven modificados
los pliegues de la pared (Sidler et al., 1986). Por otra parte, es posible que los
embriones tambin cambien su propio microambiente uterino al liberar hacia el
tero esteroides, que se encuentran a altas concentraciones en los embriones
tempranos, los cuales actuaran sobre la permeabilidad vascular local y la
liberacin de protenas endometriales; ya que la sntesis y secrecin de protenas
uterinas est modulada por el estrgeno y la progesterona (Simmen et al., 1988).
El concepto de que los embriones no estn flotando en un ancho lumen uterino,
sino que se encuentran en un espacio limitado entre los pliegues de la pared da
ms credibilidad a las consideraciones sobre el potencial de los embriones
jvenes de cambiar su propio microambiente uterino.

El epitelio y endotelio endometrial funcionan como una barrera de intercambio

selectivo entre la circulacin sangunea y la luz uterina (McRae, 1988). Adems, el
fluido uterino de los mamferos, incluido el cerdo, parece ser que contiene factores
estimulantes e inhibidores de la sntesis de ADN embrionaria (Flint, 1981). En un
estudio realizado en ovino, en el que se transfirieron asincrnicamente embriones,
aqullos que estaban retrasados en relacin con el tero se desarrollaron ms
rpido, mientras que los que estaban adelantados respecto al estadio uterino lo
hicieron ms lentamente (Wilmut et al., 1985), lo que indica la importancia del
ambiente uterino. Parece ser que el ambiente uterino cambiante va a influir en el
desarrollo embrionario y la viabilidad de los embriones.

El estadio de mrula de 8-16 clulas se alcanza alrededor del da 4, tomando el

momento de la ovulacin como da 0 (Stroband y Van der Lende, 1990). Durante
el proceso de divisin, las organelas citoplasmticas son escasas y estn
concentradas alrededor del ncleo, mientras que las inclusiones de vitelo llenan
las zonas perifricas del citoplasma. Las mitocondrias, que son globulares durante
los primeros estadios de divisin, se elongan en el estadio de mrula, lo que
sugiere un incremento en su actividad metablica. Los nucleolos se observan a
partir de las 8 clulas y su desarrollo se acompaa de un incremento en el nmero
de ribosomas. Todo ello indica la activacin del genoma embrionario, es decir, el

23
 punto a partir del cual el genoma embrionario comienza a ser
transcripcionalmente activo y pasa a ser el que controla el desarrollo del embrin
(Exley y Carol, 1999); y corresponde en el cerdo al inicio de la sntesis de ARN en
el estadio de 4 clulas (Freitag et al., 1988). Antes de esta activacin genmica, el
desarrollo embrionario est controlado por protenas y ARN maternos, sintetizados
y almacenados en forma inactiva por el ovocito (Exley y Carol, 1999). El bloqueo
en el estadio de 4 clula, que supone un obstculo para el cultivo in vitro,
corresponde al momento de la activacin del genoma embrionario, y es anlogo al
que sufren los embriones ovinos en 8-16 clulas o los bovinos en 8 clulas.

Formacin del Blastocisto. A partir del estadio de mrula compactada, los

blastmeros internos se diferenciarn en la masa celular interna, que a su vez
dar lugar al futuro embrin verdadero; mientras que los blastmeros externos se
transformarn en el trofoblasto, que ser el origen de parte de los anejos
embrionarios y que participar especialmente en la formacin de la placenta
(Johnson, 1981).

Durante el proceso de compactacin, los blastmeros exteriores forman una capa

de clulas polarizadas en estrecho contacto (Dulcibella, 1977). Ms tarde se
forman entre estas clulas vecinas unos complejos de unin, que incluyen uniones
hermticas y desmosomas, y a partir de aqu el trofoblasto queda formado
(Borland, 1977; McLaren y Smith, 1977). Las clulas del trofoblasto tienen
permeabilidad selectiva, lo cual va a favorecer el transporte de sodio y agua que
contribuir a la formacin del blastocele (Borland, 1977); momento a partir del cual
el embrin alcanza el estadio de blastocisto.

Los blastmeros internos, sin embargo, se diferenciarn ms tarde.

En el cerdo las primeras seales de compactacin se observan en el da 4, en el

estadio de 8 clulas (Hunter, 1974), la diferenciacin entre las clulas o
blastmeros interiores y exteriores comienza a partir de las 12-16 clulas en
adelante y los primeros complejos de unin aparecen en el estadio de mrula
compactada alrededor del da 5 (Barends et al., 1989). El estadio de blastocisto se
alcanza en el da 5-6 y el nmero de clulas en el momento de la formacin del
blastocele es normalmente de 16-32 (Papaioannou y Ebert, 1988).

Durante la formacin del blastocele, las clulas del trofoblasto estn bien
desarrolladas y polarizadas, contienen un nmero creciente de mitocondrias y
algunas hebras de retculo endoplsmico y aparato de Golgi, y presentan
numerosas microvellosidades orientadas hacia la luz uterina; mientras que las
clulas de la masa celular interna presentan formas desiguales, no muestran
polaridad y sus organelas apenas estn desarrolladas. Sin embargo, ambos tipos
celulares contienen grandes glbulos de vitelo y algunas gotas lipdicas en este
estadio.

24
Antes de la eclosin, los blastocistos sufren un fenmeno de expansin, de modo
que ocupan por completo el espacio perivitelino. La media de clulas en los
blastocistos porcinos expandidos es de 65-120. La proporcin de clulas que
constituyen la masa celular interna en este estadio es como mximo del 25% del
total de clulas del embrin (Papaioannou y Ebert, 1988).

Eclosin y periodo post eclosin. Hasta el momento de la eclosin, la ZP

desempea una importante funcin en la regulacin osmtica (Bronson y
McLaren, 1970), la contencin de los blastmeros en el embrin (Modlinski, 1970)
y la mejora de la supervivencia del ovocito y el embrin en el oviducto y en el tero
(Dumont y Brummett, 1985). La rotura de la ZP en los embriones porcinos se
produce en el da 6-7, y este proceso parece ser independiente del nmero de
clulas del blastocisto, al menos en estudios realizados in vitro (Niemann et al.,
1983). No se conocen con exactitud los factores que causan la lisis de la ZP, pero
podran estar involucrados fenmenos mecnicos, enzimas embrionarias o
factores uterinos. En el momento de la eclosin, los blastocistos porcinos
contienen prostaglandina E (Stone et al., 1986), que podra estar implicada en la
regulacin del transporte de agua. Este efecto mecnico del agua, como ocurre en
los embriones bovinos (Betteridge y Flechon, 1988), podra colaborar en la rotura
de la ZP, previa a la eclosin del blastocisto.

Tras la eclosin, los blastocistos porcinos permanecen en la luz del tero hasta el
da 13 (Dantzer, 1985), lo que constituye un periodo preimplantacional muy largo
si se le compara con el de los humanos o los animales de laboratorio. El dimetro
de los blastocistos recin eclosionados es de 0.2 mm aproximadamente.

Entre la eclosin y la implantacin, el desarrollo embrionario es peor soportado por

los sistemas in vitro que en estadios ms tempranos. Por ejemplo, la elongacin y
expansin de los blastocistos eclosionados, al ser dependiente de factores
uterinos, no tiene lugar in vitro. Hay, por lo tanto, una palpable evidencia de la
interrelacin entre los embriones y el tero durante este periodo posterior a la
eclosin. Pero no nos vamos a extender ms en este estadio, pues el desarrollo
embrionario in vitro se da por concluido tras la eclosin de los blastocistos.

2.2 PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS

2.2.1 Fecundacin in Vitro. La fecundacin in vitro (FIV) se ha definido como la

unin o cocultivo de espermatozoides capacitados y ovocitos maduros de forma
que la penetracin espermtica ocurra fuera del tracto genital femenino (Martnez
et al., 1989). La produccin in vitro de embriones (PIV) es un proceso ms amplio
que comprende: la obtencin y maduracin in vitro (MIV) de los ovocitos, la
capacitacin in vitro de los espermatozoides, el cocultivo de ambos gametos o

25
FIV, y el cultivo in vitro de los embriones resultantes (CE) hasta alcanzar el estadio
de blastocisto.

En 1974, Motlik y Fulka (1974) consiguieron fecundar in vivo ovocitos porcinos que
haban sido madurados in vitro y, cuatro aos ms tarde, Iritani et al. (1978)
lograron la primera MIV-FIV en porcino, utilizando espermatozoides incubados en
tractos reproductivos aislados de hembras. Nagai et al. (1984) fueron los primeros
en capacitar in vitro espermatozoides porcinos con xito. Un ao despus, Cheng
(1985) obtuvo el nacimiento de cras a partir de ovocitos porcinos madurados in
vivo y fecundados in vitro y, finalmente, Mattioli et al. (1989) lograron producir
lechones a partir de ovocitos MIV y FIV.

La posibilidad de predecir la capacidad fecundante de un eyaculado mediante los

anlisis in vitro es un problema que hasta la fecha no ha sido resuelto
adecuadamente (Hammerstedt, 1996). Algunos autores proponen como causa de
la inconsistencia de los resultados conseguidos, la evaluacin de un nmero
relativamente reducido de clulas, la gran influencia de la subjetividad del
observador y la alta variabilidad que presentan muchos anlisis seminales
(Graham y cols., 1980; Evenson y cols., 1994; Saacke y cols., 1994). Adems, el
nmero de espermatozoides aplicados en cada inseminacin es un factor muy
importante a la hora de evaluar la fertilidad y su relacin con los parmetros de
calidad seminal (Saacke, 1984; Saacke y cols., 1988; Fearon y Wegener, 2000).

Factores que afectan la capacidad espermtica y /o fecundacin in vitro

Procedencia de los espermatozoides. En muchos laboratorios, el semen

eyaculado no congelado es la principal fuente de espermatozoides utilizada como
rutina en los estudios de FIV porcina (Abeydeera, 2002). El semen refrigerado, es
decir, semen fresco eyaculado diluido en medio de conservacin y mantenido a
15-16C, tambin ha sido empleado para la FIV porcina por diversos autores
(Grupen et al., 1997; Grupen y Nottle, 2000). El empleo de semen refrigerado
permite la utilizacin de verracos no alojados en las proximidades del laboratorio
donde se va a realizar la fecundacin in vitro, sin necesidad de que el semen
tenga que ser congelado.

Al utilizar semen congelado procedente de un slo eyaculado a lo largo de un

mismo experimento se elimina la variabilidad entre eyaculados (Abeydeera y Day,
1997a; Wang et al., 1991). Sin embargo, se ha demostrado que al emplear semen
congelado para la FIV, el proceso de capacitacin y de prdida espontnea del
acrosoma se acelera en los espermatozoides congelados-descongelados (Wang
et al., 1995); y que tras la descongelacin, los espermatozoides sufren un rpido
descenso de la movilidad (Nagai et al., 1988). Adems, el protocolo de FIV que

26
funciona bien para el semen congelado de un macho, puede no dar buenos
resultados con otros verracos, por lo que para cada lote determinado de semen
congelado se ha de ajustar el protocolo de FIV.

Al evaluar el porcentaje de espermatozoides mviles tras la descongelacin y

dilucin final, observaron que el de los espermatozoides de epiddimo congelados
(72%) era similar al de los eyaculados frescos (76%) y mejor que el de los
eyaculados congelados (40%); observando menor variabilidad entre verracos en el
caso de los espermatozoides epididimales. As mismo, las tasas de divisin
embrionaria fueron mejores al utilizar espermatozoides de epiddimo (60%) que
eyaculados (15% con frescos y 16% con congelados).

Preincubacin espermtica. La composicin del medio en el que se preincuba

a los espermatozoides afecta a los parmetros de la fecundacin (Nagai et al.,
1984; Funahashi y Day, 1993). En ausencia de PFF (Nagai et al., 1984), se vio
que la preincubacin estimulaba la capacitacin e incrementaba las tasas de
penetracin y poliespermia. Al aadir PFF durante la preincubacin, Funahashi y
Day (1993) observaron que se estimulaba la capacitacin y la prdida espontnea
del acrosoma, de modo que durante la FIV se reduca la proporcin de
espermatozoides capacitados y la incidencia de poliespermia. La preincubacin
durante 90 minutos en medio TCM199m con 0,4% de BSA enriquecido con 0,1% y
1% de PFF reduca significativamente los niveles de poliespermia (36% y 32%,
respectivamente), comparado con la no adicin (77%), manteniendo las mismas
tasas de penetracin. Pero al aumentar la concentracin de PFF a un 10%, la
proporcin de ovocitos penetrados se reduca hasta el 37% debido a un marcado
incremento de reacciones acrosmicas espontneas durante la preincubacin
(Funahashi y Day, 1993b). Sin embargo, la sustitucin en el medio de
preincubacin de la BSA por 10% de FCS bloqueaba el efecto beneficioso del PFF
sobre la poliespermia. Segn Cran y Cheng (1986), la presencia de FCS durante
la FIV reduce la disponibilidad de calcio en el medio, de modo que la reaccin
cortical no puede ser inducida.

Concentracin espermtica. La concentracin de espermatozoides presentes

durante el cocultivo con los ovocitos afecta a la penetracin y la poliespermia
(Abeydeera y Day, 1997a); ya que a mayor concentracin de semen, se va a
capacitar un mayor nmero de espermatozoides. Sin embargo, la reduccin de la
concentracin espermtica suele venir acompaada de unas bajas tasas de
penetracin. Los protocolos de FIV deben disearse de modo que durante el
cocultivo, los ovocitos estn expuestos a un nmero adecuado de
espermatozoides capacitados, manteniendo as un equilibrio entre la penetracin y
la poliespermia; ya que si el nmero es inferior, la tasa de penetracin se ver
reducida, mientras que si es demasiado elevado, se incrementar la poliespermia.

27
En este diseo tambin se han de tener en cuenta las variaciones en la calidad del
semen, debidas tanto a diferencias individuales entre los verracos como a los
daos causados por los procesos de congelacin del semen (Nagai, 1996), as
como diferencias en la composicin del medio de FIV (Kidson et al., 2001;
Martnez-Madrid et al., 2001; Funahashi y Nagai, 2001), pues todo ello puede
modificar el patrn de capacitacin; por lo que la concentracin espermtica va a
tener que ser ajustada para cada situacin concreta.

Tiempo de cocultivo de los ovocitos en el semen. Al igual que ocurre con la

concentracin espermtica, una vez se ha alcanzado el nivel mximo de
penetracin, la extensin de la duracin del cocultivo slo va a dar lugar a un
incremento en la tasa de poliespermia (Abeydeera, 2001); por lo que se
recomienda que el tiempo de cocultivo no exceda de aqul en el que la mayora de
ovocitos han sido penetrados.

En un trabajo realizado por Abeydeera y Day (1997a), se evaluaron varios tiempos

de cocultivo (3, 6, 9 y 12 h), comprobndose que la prolongacin del cocultivo por
encima de las 6 h no incrementaba la tasa de penetracin (81% a las 6h vs 81% y
88% a las 9 y 12 h), pero s la poliespermia (39% vs 59% y 70%,
respectivamente). La coincubacin por un periodo de 3 h dio una tasa de
poliespermia muy adecuada (14%), pero se acompa de una penetracin
excesivamente baja (31%).

La duracin ptima del cocultivo de los ovocitos con el semen va a depender de

las condiciones a las que sean sometidos los espermatozoides. Por ejemplo, los
tratamientos de lavado, centrifugacin o seleccin previos a la FIV (Mats et al.,
2002), as como las diferencias en la composicin del medio de fecundacin
(Funahashi y Nagai, 2001), pueden dar lugar a variaciones en el estado de
capacitacin de los espermatozoides que, segn Funahashi y Nagai (2001),
podran influir en el tiempo que precisan stos para penetrar al ovocito. De modo
que el tiempo ptimo de cocultivo va a depender de las caractersticas de cada
estudio.

Sistema de cocultivo de espermatozoides-ovocitos. En un reciente trabajo,

Grupen y Nottle (2000) propusieron una sencilla modificacin en el sistema de
cocultivo de los gametos durante la FIV, con la que lograron mayores tasas de
penetracin (80% vs 57%) y un incremento en el desarrollo hasta blastocisto (30%
vs 8%), comparado con el sistema convencional. El protocolo de cocultivo
convencional (control) consista en la incubacin de los ovocitos con los
espermatozoides a una concentracin constante de 0.5-1x105 spz/ml durante 5 h.
En el sistema modificado, los ovocitos fueron expuestos a la misma concentracin
de espermatozoides que en el control durante 10 min y, a continuacin, se
transfirieron junto con los espermatozoides unidos a su superficie a una segunda

28
gota con medio de FIV libre de espermatozoides, donde se incubaron durante 5 h
ms.

A mayor tiempo de exposicin de los ovocitos con los espermatozoides a la

concentracin total, sera de esperar un incremento en la tasa de penetracin; sin
embargo, en este experimento ocurre lo contrario. Una posible explicacin
apuntada por Abeydeera (2002) es que, como en el sistema modificado los
espermatozoides muertos o daados se quedan en la primera gota, las especies
reactivas del oxgeno generadas por su degradacin, que daaran a los ovocitos
y los espermatozoides viables a lo largo de las 5 h de incubacin, no les van a
afectar.

Medios de fecundacin in vitro. En la FIV de ovocitos porcinos se han empleado

diferentes medios de fecundacin, segn el equipo de trabajo y/o el propsito del
estudio; siendo los ms utilizados el medio TCM-199 (Tissue Culture Medium;
Yoshida et al., 1990; Funahashi et al., 1994a; Nagai y Moor, 1990; Funahashi y
Day, 1993b), el medio BO (Brackett and Oliphant Mdium; Wang et al., 1995;
Kikuchi et al., 1993; Nagai et al., 1988), la solucin KRBm (Krebs Ringer
Bicarbonato modificada) (Naito et al., 1988), el medio TBM modificado
(Trisbuffered Mdium; Abeydeera y Day, 1997a, 1997b) y el medio TALP
modificado (Tyrode-albumin-lactate-piruvate Medium; Rath et al., 1999). Es difcil
establecer una comparacin entre los medios de fecundacin segn los resultados
obtenidos en diversos trabajos, pues los protocolos empleados por cada equipo
nunca son exactamente iguales. Asimismo, las variaciones en la composicin de
los medios afectan a ms de un componente, por lo que las diferencias en los
resultados no pueden ser atribuidas a un solo factor.

Comparado con los medios TCM199, BO o la solucin KRBm, el medio TBMm

(Abeydeera y Day, 1997a) contiene una mayor concentracin de Ca2+ (7.5 mM) y
no presenta iones bicarbonato, entre otras diferencias. En dos estudios diferentes,
la misma concentracin de Ca2+ aadida al medio BO (Mori et al., 1996) o al
TBMm (Abeydeera y Day, 1997b) tuvo un comportamiento diferente sobre la
penetracin y poliespermia. Al utilizar el medio BO (Mori et al., 1996), la mayor
tasa de penetracin se alcanz con 1,125 y 2,25 mM de CaCl2, aumentando
tambin la poliespermia en el segundo caso; mientras que al elevar la
concentracin de CaCl2 a 4,5 mM, se redujo tanto la tasa de penetracin como la
de poliespermia. Sin embargo, al emplear el medio TBMm (Abeydeera y Day,
1997b), el porcentaje de penetracin y de poliespermia aument a la vez que se
increment la concentracin de CaCl2, siendo mximas para 7,5 y 10 mM de
CaCl2. Adems de la diferente composicin en calcio y bicarbonato entre el medio
BO y el TBMm, otros factores diferenciales en cada uno de los trabajos fueron el
pH del medio de FIV (7,6 vs 7,2-7,3), el tiempo de cocultivo de ovocitos y
espermatozoides (4 vs 12 h), la concentracin espermtica (5x104 vs 1x106
spz/ml) y la fuente de espermatozoides (fresco vs congelado). Estas diferencias en

29
la metodologa han podido contribuir en las variaciones obtenidas en los
resultados. Esto es slo un ejemplo de la gran variabilidad que existe en los
protocolos de FIV empleados por cada equipo y para cada estudio, que hace muy
difcil su comparacin.

Por otra parte, Rath et al. (1999) estudiaron el efecto de dos medios modificados
respecto al TALP, que se diferenciaban en que el primero contena CaCl2 como
fuente de calcio, mientras que el segundo presentaba lactato clcico; en que el
contenido de NaH2PO4 en el segundo era un 24% superior que en el primero; y
en el empleo de dos antibiticos diferentes: kanamicina y amikacina. Con el
segundo medio modificado se obtuvo una tasa de divisin mayor (43% vs 18%), y
se sugiri que la presencia de una mayor concentracin de fosfato junto con la
disponibilidad de calcio podan ser los responsables de la mejora.

Lo descrito anteriormente hace suponer, en relacin con el medio de FIV

empleado, que la fecundacin de los ovocitos porcinos va a depender no slo de
cada uno de los componentes que constituyen el medio en cuestin, sino tambin
de la interrelacin entre ellos.

2.2.2 Maduracin in vitro. El proceso de maduracin del ovocito se suele dividir

en maduracin nuclear y citoplasmtica. El ovocito maduro a nivel nuclear puede
ser claramente identificado como aqul que reanuda la meiosis y alcanza el
estadio de MII; mientras que la maduracin citoplasmtica, trmino que abarca
una serie de acontecimientos no directamente relacionados con la progresin de la
meiosis pero que van a preparar al ovocito para la fecundacin y el desarrollo
embrionario posteriores (Abeydeera, 2002), se ha de estimar de un modo
indirecto.

El ovocito que no ha completado su maduracin citoplasmtica no es capaz de

reaccionar de manera correcta con la cromatina del espermatozoide penetrado e
inducir los cambios moleculares necesarios para la formacin del PNM, pues este
proceso est controlado por el factor de crecimiento del proncleo masculino, que
se sintetiza durante la fase final de la maduracin del ovocito. El GSH, sintetizado
tambin durante la maduracin del ovocito, es un factor citoplasmtico necesario
para la descondensacin de la cromatina espermtica y, por tanto, para la
formacin del PNM (Perreault et al., 1988; Yoshida, 1993).

Esto explica la estrecha relacin que existe en el porcino entre la maduracin

citoplasmtica y la formacin del PNM (Moor et al., 1990); y por esta razn, tanto
el porcentaje de formacin de PNM como el contenido intracelular de GSH de los
ovocitos (Day et al., 2000) pueden ser tomados como indicadores de la
maduracin citoplasmtica del ovocito. Asimismo, se ha demostrado una alta
correlacin entre el contenido de GSH del ovocito al final de la MIV y la incidencia
de formacin de PNM tras la FIV (Funahashi et al., 1994). Al mismo tiempo, el

30
GSH est involucrado en la proteccin del ovocito contra el fenmeno de
apoptosis, inducido por la presin oxidativa generada bajo las condiciones de
cultivo in vitro (Tatemoto et al., 2000).

El fallo en la maduracin citoplasmtica de los ovocitos MIV puede deberse a

deficiencias inherentes a los propios ovocitos y/o condiciones subptimas de
cultivo (Abeydeera, 2002). Para resolverlo es preciso realizar una buena seleccin
y manipulacin de los ovocitos, as como mejorar el sistema de MIV.

Factores que afectan a la calidad de los ovocitos

Condiciones de transporte de los ovarios al laboratorio. La duracin y

temperatura del transporte de los ovarios desde que son recogidos en el matadero
hasta que se comienzan a procesar en el laboratorio puede influir en la calidad de
los ovocitos. Walters y Graves (1998) compararon el efecto de varias temperaturas
(5, 16, 25, 30 y 37C) y tiempos (2, 6, 10, 14 y 26 h) de transporte en la posterior
maduracin de ovocitos porcinos. Al incrementarse el tiempo de transporte se
redujo la maduracin de los ovocitos, en todas las temperaturas valoradas. Los
transportes de ms de 5 h de duracin o a temperaturas inferiores a 25C
comprometieron seriamente la maduracin de los ovocitos.

Presencia de cuerpos lteos y folculos qusticos en el ovario. Ocampo et al.

(1993) han apuntado que la presencia de cuerpos lteos en los ovarios afecta a la
calidad de los ovocitos recuperados, por lo que es conveniente no utilizar ovarios
con cuerpos lteos en los protocolos de PIV de embriones porcinos. As mismo, es
recomendable desechar aquellos ovarios que presentan folculos qusticos.

Tamao del folculo. El tamao del folculo determina la capacidad de desarrollo

del ovocito. Los ovarios porcinos contienen folculos antrales con una amplia gama
de dimetros, que se clasifican como pequeos (menores de 3 mm), medianos
(entre 3-7 mm) y grandes (de ms de 7 mm). Los ovocitos utilizados en la
produccin de embriones de cerdo se suelen recuperar de folculos de tamao
medio.

Yoon et al. (2000) utilizaron ovocitos porcinos aislados de folculos de mayor (de 3
a 8 mm) y menor (<3 mm) dimetro y determinaron que los ovocitos de folculos
ms grandes daban mejores tasas de maduracin nuclear, formacin de PNM y
desarrollo hasta estadio de blastocisto, que los procedentes de folculos ms
pequeos. Por lo que se deduce que slo los ovocitos que han alcanzado un
grado adecuado de desarrollo pueden responder al estmulo de maduracin,
experimentando los cambios morfolgicos y funcionales necesarios para alcanzar
una total capacidad de desarrollo. Y al ser el compartimento folicular el que
sostiene el crecimiento del ovocito, el desarrollo del ovocito va a estar supeditado
al estadio de desarrollo del folculo en el que se encuentra.

31
 Mtodo de recuperacin de los ovocitos. Aunque la recuperacin de ovocitos
por diseccin de los folculos es ms laboriosa que por aspiracin, asegura la
recuperacin de ovocitos exclusivamente de folculos no atrsicos (Ding et al.,
1992a). Cuando se compararon los estadios de vescula germinal en ovocitos
obtenidos de ovarios de matadero y recuperados tanto por puncin de los folculos
seleccionados como por aspiracin folicular, se observ que los ovocitos
recuperados por puncin se encontraban detenidos en el estadio de VG1 en
mayor proporcin que los aspirados (Ebihara et al., 1993). Esto sugiere que con el
mtodo de aspiracin tambin se recuperan ovocitos de folculos cuyas clulas
foliculares no son adecuadas para mantener el arresto meitico en VG1,
permitiendo al ovocito reanudar la meiosis.

En nuestro laboratorio, hemos observado que la aspiracin de folculos con jeringa

de 10 ml conectada a aguja de 18G provoca una denudacin mecnica de las
clulas del cmulus que rodean al ovocito, cuya presencia va a ser fundamental
en el proceso de maduracin del ovocito.

Sistema de maduracin in vitro de los ovocitos: condiciones de cultivo y medios

de maduracin. Las condiciones fsicas especficas del ambiente en el que se
maduran los ovocitos (osmolaridad, pH y composicin inica del medio;
temperatura y tensin de CO2 y O2 el incubador; volumen de cultivo; y tiempo de
incubacin), as como la mayor o menor definicin del medio de maduracin
utilizado (suero, clulas somticas, etc.) van a influir en la maduracin de los
ovocitos (Holm y Callesen, 1998).

Condiciones de cultivo. La duracin del cultivo durante la MIV de los ovocitos

porcinos oscila desde 36 horas (Yoshida et al., 1993b) hasta 48 h (Naito et al.,
1988), pasando por 40 h (Funahashi y Day, 1993c) y 44 h (Wang et al., 1997a).
Segn Ka et al. (1997) un cultivo de 36 h es suficiente para completar los procesos
de maduracin nuclear y citoplasmtica, mientras que Yamauchi et al. (1996)
apuntan que el periodo ptimo de cultivo es de 42-44 h.

La temperatura de incubacin ms utilizada, tanto en la MIV, la FIV y el CE es de

38,5C 39C. En un reciente estudio, Abeydeera et al. (2001) analizaron el efecto
de dos temperaturas, 35 y 39C, y de dos duraciones de cultivo, 44 y 68 h, durante
la MIV de ovocitos porcinos sobre la maduracin nuclear, la fecundacin y el
desarrollo embrionario posterior. El cultivo a 35C durante 44 h redujo
significativamente la tasa de maduracin nuclear (12% vs 79%), comparado con la
incubacin a 39C durante el mismo tiempo. La extensin del cultivo a 35C hasta
68 h aument la tasa de maduracin nuclear a 58%, mientras que en el caso del
cultivo a 39C, se increment la activacin espontnea de los ovocitos. Respecto
al desarrollo embrionario hasta blastocisto, el tratamiento que dio mejor resultado
fue el cultivo a 39C durante 44 h (31%), comparado con el cultivo a 35C (13%) y

32
a 39C (3%) durante 68 h. Aunque se confirm que la temperatura y el tiempo
ptimos de cultivo durante la MIV son 39C y 44h, respecto a 35C y 68h, la
extensin del tiempo de incubacin a una menor temperatura permiti alcanzar
tasas aceptables de desarrollo embrionario.

La atmsfera de cultivo empleada como rutina en los protocolos de PIV de

embriones porcinos es de 5% de CO2 y 95% de humedad. La utilizacin de
incubadores con baja tensin de oxgeno (5-7%), no es frecuente en porcino.

Medios de maduracin. Para la maduracin in vitro de ovocitos porcinos se han

empleado distintos medios de cultivo, segn el grupo de trabajo o el propsito del
estudio. Los medios se pueden clasificar en sencillos o complejos, dependiendo
de la cantidad de productos incluidos en su composicin. Ejemplos de medios
sencillos ampliamente utilizados en la MIV de ovocitos porcinos son el medio
Whitten (Funahashi et al., 1994b), el medio KRB (Krebs Ringer Bicarbonato) (Naito
et al., 1988), y el medio NCSU23 (North Carolina State University) (Abeydeera et
al., 1998b, 1998c), que se suelen preparar en el propio laboratorio. Entre los
medios complejos ms utilizados estn el TCM199 (Tissue Culture Medium 199)
(Zheng y Sirard, 1992) y el Waymouth (Yoshida et al., 1993b), que debido al
elevado nmero de componentes, se suelen adquirir en preparados comerciales.
A su vez, los medios de cultivo se dividen en definidos o indefinidos, conforme al
tipo de suplementos que contengan. La tendencia actual es, en la medida de lo
posible, la eliminacin de suplementos no definidos, pues contienen factores
desconocidos que dificultan la identificacin de los mecanismos involucrados en la
regulacin de los procesos en estudio (Abeydeera, 2002). Adems, en el caso de
suplementos como el PFF, el FCS o las clulas somticas, entre otros, se ha
observado mucha variabilidad entre lotes y entre laboratorios, que impide la
estandarizacin de los protocolos y la repetibilidad de los experimentos.

Pero la presencia de determinados suplementos no definidos en los medios, como

el PFF (Yoshida et al., 1990, 1992) o el cocultivo con clulas somticas
(Abeydeera et al., 1998b), ha mejorado de forma notable los rendimientos de la
tcnica, que compensan las desventajas de su utilizacin. En la actualidad se
estn tratando de identificar y purificar los factores activos, presentes en los
suplementos no definidos, responsables de estos efectos beneficiosos.

2.2.3 Cultivo de Embriones. En los primeros estudios sobre cultivo in vitro (CE)
de embriones porcinos, no se logr sobrepasar el estadio de 4 clulas a partir de
embriones de una clula obtenidos in vivo (Davis, 1985). Este bloqueo en 4
clulas coincide con la transicin del control gentico de la madre al embrin
(Jarrell et al., 1991). Adems, el estadio de 4 clulas se prolonga durante 24 h in
vivo, y es la fase en la que se produce el paso de los embriones porcinos del
oviducto al tero (Davis, 1985).
Posteriormente se consigui superar el bloqueo en 4 clulas gracias al uso de

33
Oviductos de ratn en cultivo (Kriser et al., 1989), al cocultivo con clulas
epiteliales (Archibong et al., 1989) o al enriquecimiento con fluido oviductal
(Archibong et al., 1989) durante el CE. En cambio, el cultivo in vitro de embriones
recogidos de hembras donantes a partir del estadio de 4 clulas hasta blastocisto
si se poda llevar a cabo en un medio de cultivo simple basado en el medio Krebs-
Ringer bicarbonato (Davis, 1985), sin necesidad de cocultivo.

En estudios ms recientes, ms del 70% de los embriones porcinos obtenidos in

vivo y cultivados in vitro se han desarrollado hasta el estadio de blastocisto en
diferentes medios: medio Whittens modificado (Beckmann y Day, 1993), medio
NCSU23 (North Carolina State University 23; Petters y Wells, 1993), medio Iowa
State University (Youngs et al., 1993) y medio BECM-3 (Beltsville Embryo Culture
3; Dobrinsky et al., 1996). Sin embargo, al comparar la eficacia de estos medios
para soportar el desarrollo embrionario de embriones MIV-FIV se encontr un
amplio rango (desde 5% a 30%) en la proporcin de blastocistos obtenida con
cada uno de ellos (Abeydeera et al., 1999a).

Por otra parte, la transferencia embrionaria de zigotos MIV-FIV al oviducto de

hembras receptoras y su posterior recogida, por lavado retrgrado, 5 das ms
tarde dio lugar a blastocistos con un nmero de clulas notablemente ms elevado
(106-136 vs 10- 21) que los controles cultivados in vitro (Funahashi et al., 1994d).
Asimismo, al cultivar in vitro e in vivo embriones de 1-2 clulas obtenidos in vivo,
los blastocistos desarrollados in vivo tambin presentaban un mayor nmero de
clulas (55 vs 25) que los cultivados in vitro (Machaty et al., 1998).

Segn Bavister (1995), el ambiente de cultivo utilizado para el desarrollo de los

embriones preimplantacionales, incluso en ausencia de efectos visibles, puede
afectar profundamente a los procesos que acontezcan tras la implantacin.
Asimismo, el cultivo in vitro afecta a la expresin gnica de los embriones, tanto en
estadios tempranos como avanzados del desarrollo, aunque su efectos se
observen a largo plazo (Duranthon y Renard, 2002). Incluso siendo compatible con
el desarrollo a blastocisto, las modificaciones en la concentracin salina del medio
de cultivo pueden provocar importantes alteraciones en la expresin de
determinados genes (Ho et al., 1994). Del mismo modo, la adicin al medio de
cultivo de aminocidos (Ho et al., 1995), factores de crecimiento (Babalola y
Schultz, 1995) o suero (Wrenzycki et al., 1999) puede afectar a la transcripcin
gnica maternal y embrionaria. En general, el desarrollo de los embriones en
cultivo es ms lento que in vivo, dando lugar a blastocistos con un menor nmero
de clulas unido a una progresiva prdida de viabilidad y a un metabolismo
reducido (McKiernan y Bavister, 1994).

Segn lo expuesto hasta este momento, se podra afirmar que el limitado

desarrollo hasta blastocisto de los embriones porcinos MIV-FIV-CE y su menor
calidad, comparada con los obtenidos in vivo, no se debe a un fallo puntual en el
sistema de PIV de embriones, sino a la combinacin de una maduracin
34
citoplasmatica inadecuada o incompleta, una elevada poliespermia, una
formulacin inadecuada de los medios de cultivos y unas condiciones de cultivo
embrionario subptimas.

Condiciones del cultivo de embriones

Tensin de oxgeno. Las condiciones convencionales de incubacin de los

embriones durante el CE son las mismas que las empleadas para la MIV y la FIV,
es decir, 5% de CO2 en atmsfera saturada de humedad a una temperatura de
38,5-39C.

Sin embargo, Berthelot y Terqui (1996) afirmaron que el desarrollo de embriones

porcinos obtenidos in vivo y cultivados en NCSU23 modificado (sin glucosa pero
enriquecido con lactato, piruvato, vitaminas y mayores niveles de glutamina,
NaHCO3 y BSA) a baja tensin de O2 era ptimo. En contraste con estos
resultados, Machaty et al., (1998) no observaron mejora en el desarrollo hasta
blastocisto al comparar el cultivo de embriones obtenidos in vivo en NCSU23 bajo
tensin reducida (5%) de O2 o en condiciones convencionales (20% O2). No
obstante, estos trabajos no son comparables, al haber diferencias en el medio de
cultivo empleado.

Recientemente, Machaty et al. (2001) han observado un incremento en el

desarrollo a blastocisto y en el nmero de clulas al cultivar mrulas MIV/FIV bajo
tensin reducida (5%) de O2. La explicacin propuesta para esta mejora es que la
inhibicin parcial de la fosforilacin oxidativa a partir del estadio de mrula tiene
efectos beneficiosos sobre el desarrollo y el nmero de clulas de los blastocistos.
Fischer y Bavister (1993) indicaron que el nivel de O2 en la cavidad uterina era
menor que en el oviducto. Esta menor tensin de oxgeno podra ser en parte
responsable del cambio en la va de produccin de ATP (adenosil trifosfato) de
fosforilacin oxidativa a gliclisis en el momento de la compactacin/blastulacin.
Como en condiciones in vivo, los embriones porcinos alcanzan los cuernos
uterinos antes del estadio de mrula compacta (Davis, 1985), podramos pensar
que una reduccin en la fosforilacin oxidativa en beneficio de la gliclisis sera
positiva en el estadio de peri-compactacin.

Se ha propuesto el establecimiento de un CE secuencial: en atmsfera

convencional (20% O2) hasta el estadio de mrula y a partir de ah bajo tensin
reducida (5%) de O2.

Relacin: embriones/volumen de medio. Se ha demostrado que el cultivo de

embriones en volmenes reducidos de medio o en grupos incrementa
significativamente el desarrollo a blastocisto, as como el nmero de clulas de los
blastocistos en varias especies: ratn (Paria y Dey, 1990), mujer (Lane y Gardner,
1992), vaca (Palma et al., 1992) y oveja (Gardner et al., 1994). Adems, el cultivo

35
de embriones en volmenes reducidos aumenta la viabilidad del embrin tras la
transferencia embrionaria (Lane y Gardner, 1992). Asimismo, la disminucin de la
relacin volumen de cultivo/embrin estimula el desarrollo de la masa celular
interna de los blastocistos sin afectar el nmero de clulas del trofoblasto, en
embriones de ratn (Gardner et al., 1997) y vaca (Ahern y Gardner, 1998). Sin
embargo en un estudio reciente realizado sobre embriones humanos (Rijnders y
Jansen, 1999), no se observ ninguna mejora en el desarrollo embrionario al
cultivar en grupo o al reducir el volumen de cultivo.

En el porcino, los estudios en los que se valor el efecto del volumen de cultivo
sobre el desarrollo de los embriones se realizaron hace ms de dos dcadas. En
el ms reciente, de 1982 (Menino y Wright, 1982), se compar el efecto de dos
sistemas de cultivo: en microgota de 50 L en placas de Petri de cristal y en 4 ml
en tubos Falcon de plstico, con unos 28-29 embriones por placa o tubo, sobre el
desarrollo de embriones de 1 clula obtenidos in vivo; alcanzndose un mayor
ndice de divisiones completadas en cultivo con el sistema de 4 ml de medio,
aunque sin apreciarse diferencias significativas en el porcentaje de mrulas y de
blastocistos entre los dos sistemas. Mientras que en dos estudios previos (Pope y
Day, 1977; Davis y Day, 1978), el desarrollo embrionario de embriones de 1 clula
obtenidos in vivo fue superior en los cultivados en microgotas frente al cultivo en
tubos.

Una de las hiptesis propuestas para el efecto beneficioso del cultivo en grupo y/o
en pequeo volumen de medio es la produccin de factores autocrinos y/o
paracrinos por parte del embrin en cultivo (Paria y Dey, 1990; ONeill, 1998), que
estimularan el desarrollo del propio embrin que los genera y el de los embriones
vecinos. Segn esto, el cultivo en volmenes grandes dara lugar a la dilucin de
los factores beneficiosos producidos por el embrin, de tal modo que la
concentracin presente en el medio de cultivo no sera suficiente para ejercer el
efecto (Gardner, 1994).

Entre los posibles factores autocrinos y/o paracrinos implicados se han descrito los
siguientes: factores con propiedades mitognicas o de diferenciacin, como los
factores de crecimiento PDGF (Platelet-derived Growth Factor) (Thibordeaux et al.,
1995) e IGF II (Insulin-like Growth Factor II) (ONeill, 1997); y factores anti-
apoptticos o de supervivencia, como el TGF (Transforming Growth Factor )
(Brison y Schultz, 1997) y el PAF (Platelet-activating Factor) (ONeill, 1998), los
cuales actuaran reduciendo los niveles de apoptosis dentro de la masa celular
interna del embrin (Colon y Raff, 1999).

Paria y Dey (1990) sugirieron que el efecto de estos factores de crecimiento o de

supervivencia producidos por el embrin de ratn empezaba a ser operativo a
partir del estadio de 8 clulas o mrula, momento en el que comienzan a
detectarse en la superficie del embrin receptores para el factor de crecimiento
epidrmico (EGF); mientras que, recientemente, ONeill (1998) ha propuesto que
36
los factores de supervivencia autocrinos slo son requeridos por el embrin de
ratn antes o durante el estadio de 2 clulas.

Otra de las hiptesis, ofrecida por Bavister (1995), es que el incremento en el

nmero de embriones por unidad de volumen podra resultar beneficioso debido,
simplemente, a un agotamiento por parte de los propios embriones de sustancias
embriotxicas o inhibidoras en el medio, o por una disminucin en la prdida de
compuestos endgenos importantes, como aminocidos, entre otras posibilidades.
Segn este autor, el efecto del tamao de la gota de cultivo sobre el desarrollo
embrionario va a depender, entre otros factores, de la composicin del medio de
cultivo y de las condiciones fsicas empleadas.

Para apoyar esta hiptesis, Bavister compar dos trabajos en los que se estudi el
efecto del nmero de embriones por unidad de volumen, en embriones de
hmster. En uno de ellos (Schini y Bavister, 1988), al aumentar el nmero de
embriones por microlitro de medio de 0,24 a 35 se increment ampliamente el
porcentaje de embriones de 2 clulas que se dividieron al menos una vez (de 1%
a 34%). El medio de cultivo empleado contena glucosa y fosfato, que bloquean el
desarrollo de los embriones de hmster en cultivo; lo cual hace pensar que la
mejora se debi, en parte, a un consumo de estos compuestos por los embriones,
que redujo su concentracin en el medio. En cambio, en el otro trabajo descrito
(McKiernan y Bavister, 1994) se emple un medio sin glucosa ni fosfato, no
encontrndose diferencias en el desarrollo a mrula y a blastocisto al cultivar 2, 4
u 8 embriones por gota de medio.

Medios de cultivo de embriones. Como hemos visto, el desarrollo hasta el

estadio de blastocisto de embriones obtenidos in vivo se logr con xito (>70%) en
varios medios de cultivo. Sin embargo, al comparar la eficacia de estos medios
sobre el CE de embriones MIV-FIV, se observ un amplio rango de resultados
(Abeydeera et al., 1999a). El medio con el que se obtuvo el mejor desarrollo
embrionario fue el NSCU23 (30% de blastocistos) seguido por el medio Iowa State
University (14%) y el BECM-3 (12%), siendo el medio Whitten el que dio peores
resultados (5%). Se puede afirmar que, hasta la fecha, el NCSU23 es el medio de
eleccin para el cultivo de embriones MIV-FIV, mientras que para el cultivo de
embriones obtenidos in vivo tambin son adecuados los otros 3 medios citados.

De todos modos, la capacidad de los embriones de desarrollarse en un medio de

cultivo determinado no indica necesariamente que este medio le proporcione un
ambiente beneficioso o deseable; sino que podra reflejar simplemente su
capacidad para tolerar las condiciones artificiales, quizs a expensas de su
viabilidad (Bavister, 1995). Por lo tanto, el diseo del medio de cultivo es crucial
para el posterior desarrollo embrionario pre- y postimplantacional. En la actualidad
hay dos tendencias a la hora de formular los medios de cultivo: una tendencia ms
pragmtica, cuyo principal objetivo es la produccin de embriones viables, que
puede emplear medios de cultivo no definidos para este fin; y otra tendencia, cuya
37
meta es el conocimiento de los requerimientos bsicos de los embriones en
cultivo, para lo cual es fundamental el empleo de medios cuya composicin est
totalmente definida (Bavister, 1995).

Morfologa y calidad de los embriones producidos in Vitro. A pesar de los

notables avances en la PIV de embriones porcinos, la morfologa de los embriones
PIV, incluidos los blastocistos, difiere de la de los embriones obtenidos in vivo
(Wang et al., 1999a). Asimismo, el nmero de clulas que constituyen los
blastocistos PIV es menor que la de los obtenidos in vivo (Papaioannou y Ebert,
1988).

Wang et al. (1999a) evaluaron la morfologa y los filamentos de actina de

embriones producidos in vitro e in vivo, y comprobaron que in vivo los blastocistos
presentaban una masa celular interna ms prominente y que los blastmeros de
los embriones tempranos tenan un aspecto ms definido que los de los
producidos in vitro. Asimismo, sugirieron que las divisiones anmalas y el bajo
nmero de clulas en los blastocistos, que aparecen en los embriones PIV, se
poda deber a las alteraciones observadas en la distribucin de los filamentos de
actina en el citoplasma, ya que stos estn involucrados en el proceso de divisin
celular.

Valoracin de la capacidad de desarrollo embrionario. El parmetro por el que

se valora la capacidad de desarrollo de los embriones MIVFIV- CE en la mayora
de laboratorios es el desarrollo hasta el estadio de blastocisto. Por otra parte, un
mayor nmero de clulas en el blastocisto se considera un signo de calidad
embrionaria, ya que, como hemos visto, el nmero de clulas de los blastocistos
obtenidos in vivo suele superar al de los embriones PIV. Tambin se ha empleado
el parmetro del porcentaje de blastocistos eclosionados en cultivo como indicador
de la calidad embrionaria, aunque este hecho no est comprobado.

Sin embargo, hemos visto que el sistema de produccin in vitro ocasiona

alteraciones en el embrin, que pueden llegar a ser compatibles con el desarrollo
a blastocisto (Duranthon y Renard, 2002). Por lo tanto, la prueba definitiva que va
a medir la viabilidad embrionaria es el establecimiento de gestaciones y el
nacimiento de cras vivas tras la transferencia de los embriones a una hembra
receptora. Actualmente, el xito alcanzado en las transferencias de embriones PIV
segn diferentes autores ha sido muy variable, y como mucho slo el 20% 30%
de los embriones sobrevive tras la transferencia (Abeydeera, 2002).
Desgraciadamente, la transferencia de embriones tiene un costo elevado, tanto en
tiempo como econmico, que no hacen posible su ejecucin de manera rutinaria.

La divisin embrionaria a las 48 h es un parmetro bastante subjetivo, debido a la

dificultad de distinguir entre un embrin dividido correctamente y otro fragmentado

38
o dividido partenogenticamente, slo mediante criterios morfolgicos. En un
estudio en el que se analizaron las alteraciones en la divisin se observ que, de
los embriones producidos in vitro, slo el 73% de los embriones de 2 clulas, el
26% de 3 clulas, el 49% de 4 clulas y el 26% de 5 a 8 clulas eran
morfolgicamente normales (con un ncleo por blastmera), presentando el resto
una divisin citoplasmtica y nuclear asincrnica, que dio lugar a embriones
fragmentados o con blastmeras bionucleadas; mientras que en los embriones
obtenidos in vivo no se observ ninguna alteracin en la divisin (Wang et al.,
1999a).

2.3 TRANSGENESIS Y CLONACION

2.3.1 Transgnesis en animales. Desde sus primeros inicios el hombre ha

seleccionado plantas y domesticado animales mediante el cruzamiento selectivo
de individuos con el fin de transferir los caracteres deseados. La principal limitante
de este proceso radica en la incompatibilidad sexual observada cuando los
organismos son muy divergentes genticamente, lo que impide esta transferencia
entre especies. La ingeniera gentica permite romper esta barrera posibilitando la
incorporacin de genes desde otras especies que de otra forma sera imposible
con los mtodos de mejoramiento tradicional. De esta forma los organismos
genticamente modificados o ms comnmente denominados transgnicos son
organismos vivos (plantas, animales o bacterias) manipulados genticamente
mediante la insercin de un gen que habitualmente no formaba parte de su
repertorio gentico. La finalidad de esto es proporcionar a la planta o animal
nuevas caractersticas productivas y hacerlos ms eficientes y competitivos (Clark,
2002).

El gen a ser introducido consiste bsicamente de una construccin de ADN que

contiene una regin promotora y la regin codificante para la protena de inters,
los que se insertan en el genoma en forma artificial mediante alguna de las
tcnicas disponibles como se detalla ms adelante. Esta regin de ADN es
denominada comnmente transgen y puede provenir de otro animal de la misma
especie o desde una bacteria o planta. El lugar del animal donde se expresa el
transgen est dirigido por la regin promotora o las regiones reguladoras de la
regin promotora. As por ejemplo, si se utiliza el promotor del gen de la -
Lactoglobulina se podra dirigir la expresin y secrecin de una protena
recombinante exclusivamente en la leche del animal.

Hasta muy recientemente, la tecnologa para generar animales de granja

modificados genticamente involucraba la microinyeccin pronuclear, en la cual

pequeas cantidades del ADN de inters (transgen) eran inyectadas en el

proncleo de un embrin al estado de dos clulas. Aunque ampliamente aceptada
y utilizada en forma rutinaria en muchos laboratorios, ha habido muy poco
progreso para mejorar su eficiencia, la que se mantiene en el orden 0.1-5%,
39
dependiendo de la especie considerada (Wall y col., 1997). Al mismo tiempo que
la microinyeccin pronuclear se estaba desarrollando, en animales de granja, las
clulas madre embrionarias (ES cells) estaban siendo desarrolladas y utilizadas
para experimentos de recombinacin homloga en el ratn. Esta tecnologa ha
sido tremendamente eficiente para explotar la capacidad de las clulas en
contribuir a la lnea germinal y realizar recombinacin homloga con ADN
exgeno, permitiendo la introduccin de cambios precisos en el genoma del
animal (para revisin ver Hooper, 1992). Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de
muchos laboratorios, no se han descrito an clulas madre embrionarias en otras
especies distintas al ratn (Stice, 1998), lo que ha frenado muchas aplicaciones
potenciales de esta tecnologa en animales de granja. Esta situacin se revirti
recientemente despus del nacimiento de Dolly, el primer animal obtenido por
transferencia nuclear de una clula adulta (Wilmut y col., 1997). Sin embargo
Polly, la primera oveja transgnica obtenida por transferencia nuclear (Schnieke y
col., 1997), y George y Charlie, los primeros terneros transgnicos obtenidos de la
misma forma (Cibelli y col., 1998), son los que han marcado el curso de las
investigaciones en este campo y conducirn el camino en el futuro. Hoy en da, la
transferencia nuclear se ha convertido en una alternativa real a la microinyeccin
pronuclear debido a que permite un acortamiento del tiempo entre la obtencin de
un animal transgnico fundador y el establecimiento de un rebao transgnico.
Adems, la transferencia nuclear abri las puertas a la recombinacin homloga
de animales de granja que haba sido restringida slo al ratn mediante la
tecnologa de clulas madre embrionarias. Esto posibilita la eliminacin de genes
endgenos en animales de granja (gene knock out) y/o la insercin de genes
especficos en regiones transcripcionalmente activos del genoma, favoreciendo
altos niveles de expresin de la protena de inters.

En la tabla 1, se indican algunas especies en las que se han obtenido animales

transgnicos:

Tabla 1. Animales transgnicos

ANIMALES TRANSGNICOS
MAMFEROS AVES PECES
Ratn Pollo Salmn
Rata Codorniz Trucha
Conejo Tilapia
Vacuno Carpa
Cerdo Pez gato
Oveja Medaka
Cabra Dorada
( revisiones por Clark et al., 1987; Chen y Powers, 1990; Bialy, 1991; Sangh, 1994;
Velander et al.,1997)

40
Por su especial importancia, en lo que sigue solamente se har referencia a la
obtencin y utilizacin de animales transgnicos en especies de mamferos de
valor econmico.

Mamferos transgnicos. Como se indicaba anteriormente, las investigaciones

llevadas a cabo a principio de los aos ochenta no fueron ms que el lanzamiento
de una serie ininterrumpida de avances, tanto en la investigacin bsica como en
la utilizacin prctica de los animales transgnicos. En el cuadro adjunto se
incluyen los principales hitos relacionados con la obtencin y desarrollo de los
mamferos transgnicos:
Tabla 2. Mamferos transgnicos.

MAMFEROS TRANSGNICOS: ANTECEDENTES Y CRONOLOGA

1938: Spemann propone experimento de transferencia nuclear
1949: Hammond mantiene embriones de ratn en cultivo in vitro
1961: Tarkowski obtiene ratones quimricos agregando embriones
1966: Lin describe la tcnica de microinyeccin de embriones de ratn
1980: Gordon, Ruddle y col. obtienen los primeros ratones transgnicos por
microinyeccin de ADN en el proncleo de cigotos de ratn
1981 Gordon y Ruddle obtienen ratones transgnicos por microinyeccin de
ADN en el proncleo de cigotos de ratn
1981: Evans y Kaufman obtienen clulas embrionarias totipotentes de ratn
1982: Palmiter y col. obtienen ratones transgnicos gigantes mediante
transgenes de la hormona del crecimiento de la rata
1983 Palmiter y col. obtienen ratones transgnicos gigantes mediante
transgenes de la hormona de crecimiento humana
1983: McGrath y Solter desarrollan una nueva tcnica para experimentos de
transferencia nuclear en ratn
1985: Hammer y col. obtienen animales de granja transgnicos (conejos,
ovejas, cerdos) con el transgn de la hormona del crecimiento humano
1987: Thomas y Capecchi obtienen los primeros ratones knockout por
recombinacin homloga
1989 Clark y col. obtienen ovejas transgnicas con el gen humano del factor
IX de coagulacin de la sangre mediante microinyeccin de ADN en el
proncleo del cigoto
1991 Wright y col. obtienen ovejas transgnicas con el gen humano de la -
1-antitripsina mediante microinyeccin de ADN en el proncleo de
cigotos
1991 Ebert y col. obtienen cabras transgnicas con el gen AtPH humano
(activador tisular de plasmingeno) mediante microinyeccin de ADN
en proncleo de cigoto
1991 Krimpenfort y col. obtienen vacas transgnicas con el gen humano de
la lactoferrina mediante microinyeccin de ADN en el proncleo de
41
 cigotos
1993: Nagy y Rossant obtienen ratones quimricos por co-cultivo de
embriones
1993: Schedl y col. obtienen ratones transgnicos con cromosomas
artificiales de levaduras
1994: Brinster y col. obtienen ratones transgnicos por transplante de
espermatogonias
1996: Campbell y col. obtienen ovejas clnicas por transferencia nuclear de
clulas embrionarias en cultivo
1997: Wilmut y col. obtienen ovejas clnicas por transferencia nuclear de
clulas diferenciadas fetales y adultas en cultivo
1997: Schnieke y col. obtienen ovejas clnicas transgnicas por transferencia
nuclear a partir de clulas fetales diferenciadas
1998: Cibelli y col. obtienen vacas clnicas transgnicas por transferencia
nuclear a partir de clulas fetales diferenciadas
1999 Baguisi y col. obtienen cabras transgnicas por transferencia nuclear
1999 Yanagimachi y col. obtienen ratones transgnicos mediante la co-
inyeccin de cabezas de espermatozoides y ADN exgeno
( revisiones por Clark et al., 1987; Chen y Powers, 1990; Bialy, 1991; Sangh, 1994;
Velander et al.,1997)

Mtodos de transformacin gentica en animales

Transformacin gentica mediante el uso de vectores retrovirales. Contrario a

la percepcin de muchos, los primeros animales transgnicos fueron producidos
hace ya casi 30 aos mediante la microinyeccin de ADN viral (SV40) en la
cavidad del blastocele de embriones de ratn (Jaenish y Mintz, 1974). Los
prximos intentos involucraron embriones de ratn infectados con el retrovirus
Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), lo que result en la transmisin estable
hacia la lnea germinal (Jaenish, 1976). Esto se logr reemplazando genes que no
son esenciales para el virus por genes heterlogos, aprovechando as la
capacidad de los virus de infectar un amplio espectro de clulas y con una gran
eficiencia. Una de las grandes desventajas de este mtodo radica en que la
integracin del ADN se produce en diferentes etapas del embrin en desarrollo, lo
que implica que el ADN no se integra en todas las clulas somticas o en la lnea
germinal y por lo tanto no hay transmisin del transgen a la descendencia.
Adems, los animales generados por este mtodo tienen a menudo ms de un
sitio de integracin, lo cual ocurre cuando ms de una clula del embrin es
infectada por el virus (Palmiter y Brinster, 1985). Esto implica que las lneas de
ratones transgnicos deben ser cruzadas para segregar los diferentes loci
conteniendo el transgen y poder as aislar lneas con un sitio de insercin nico.
Finalmente, los vectores retrovirales poseen una limitada capacidad de ADN

42
forneo que puede ser acomodado, alrededor de 8 kb, lo cual imposibilita muchos
experimentos especialmente con secuencias genmicas humanas que pueden
superar ampliamente este tamao.

Transformacin gentica mediante microinyeccin pronuclear. En la dcada del

80 ocurri un importante avance en la tecnologa de animales transgnicos que
marc el curso de la investigacin en este campo por al menos dos dcadas.
Gordon y colaboradores describieron una tcnica donde el ADN desnudo fue
inyectado en el proncleo de un ovocito de ratn recientemente fertilizado, el que
posteriormente se transfiri a hembras receptoras sincronizadas (Gordon y col.,
1981). Este experimento demostr que era posible usar un plsmido recombinante
como vector para transferir genes forneos directamente hacia el embrin. El ADN
inyectado de esta forma se integr en el genoma y pudo ser heredado por la
descendencia de los animales transgnicos fundadores. La inyeccin de
embriones al estado de una clula fue clave para obtener una integracin
temprana del transgen, permitiendo al ADN forneo contribuir en el genoma de
todas las clulas somticas y la lnea germinal. En ciertos casos la integracin del
transgen tambin ocurri despus de la primera divisin del zigoto, lo que result
en animales fundadores mosaicos. Estos animales mosaicos an transmiten el
transgen a la descendencia pero lo hacen a una frecuencia menor al 50%.
Desgraciadamente, la eficiencia para generar animales transgnicos utilizando
esta tecnologa es baja, particularmente en animales de granja. La eficiencia de la
inyeccin pronuclear est controlada por una serie de factores como quedara
demostrado por los trabajos de Brinster y colaboradores, quienes entregaron
valiosa informacin sobre la integracin de los transgenes y permitieron establecer
que la concentracin y la forma (circular o linear) del ADN eran los factores ms
crticos para una eficiente integracin (Brinster y col., 1985). No se encontraron
diferencias significativas cuando el proncleo femenino o masculino era utilizado
para la inyeccin, aunque este ltimo es preferido por ser ms grande. Por otro
lado, el cruzamiento de ratones hbridos (por ejemplo C57BL x SJL) fue ms
exitoso en la produccin de animales transgnicos que las lneas cosanguneas
(C57Bl x C57Bl). El descubrimiento de la inyeccin de proncleos como un nuevo
mtodo para modificar el genoma de los animales revolucion la forma en que los
investigadores pudieron analizar la expresin de los transgenes y paviment el
camino para la generacin de los primeros animales transgnicos de granja hace
ya 18 aos (Hammer y col., 1985). Desde entonces, la tecnologa ha sido
implementada con xito en la mayora de los animales domsticos como en
conejos (Buhler y col., 1990), ovejas (Wright y col., 1991), cabras (Ebert y col.,
1991), vacas (Krimpenfort y col., 1991) y cerdos (Wall y col., 1991). Sin embargo,
adems de los problemas asociados con la integracin de los transgenes hay
ineficiencias asociadas con la recoleccin, cultivo de los huevos fertilizados y
transferencia de los embriones hacia las hembras receptoras. Otros factores como
el largo perodo de gestacin y el bajo nmero de animales por generacin,
sumado al costo extra de cuidado de los animales, han contribuido a la lenta

43
adopcin de estas tecnologas, especialmente en los pases menos desarrollados.

Los primeros estudios realizados en animales de granja se enfocaron hacia el uso

de genes que controlan la productividad del animal, por ejemplo genes de la
hormona del crecimiento para incrementar la tasa de crecimiento y la eficiencia de
conversin (Pursel y Rexroad, 1993). Estos estudios mostraron los problemas de
la inyeccin pronuclear con relacin al control de los niveles de expresin del
transgen. Se encontr una gran variacin de expresin en las lneas de animales
transgnicos generados, siendo sta en general muy pobre, especialmente si no
todos los elementos reguladores del transgen eran incluidos en la construccin
gentica (plsmido). Esto llev a que muchos investigadores dedicaran mayores
esfuerzos a entender la forma en que los transgenes se insertan en el genoma del
animal y los factores que afectan la expresin de los mismos. Esto explica por qu
la mayora de los experimentos dirigidos a alterar la composicin de la leche han
sido realizados principalmente en el ratn, aunque existen algunas notables
excepciones tales como la secrecin de protenas de valor teraputico como el
factor IX de la coagulacin en la leche de ovejas (Wright y col., 1991), el activador
de plasmingeno de tejido en la leche de cabras (Ebert y col., 1991) y la lisozima
humana en la leche de bovinos (Krimpenfort y col., 1991). Sin embargo, dada la
baja eficiencia de esta tecnologa (Clark y col., 1994), sumado a los costos
involucrados, es que ha habido una bsqueda constante por nuevas alternativas.
As, la manipulacin de las clulas madre embrionarias de ratn (ES cells)
apareci como una potencial solucin para muchos de los problemas encontrados
con la tcnica de microinyeccin pronuclear.

Transformacin gentica mediante recombinacin homloga en clulas madre

embrionarias (ES cells). El aislamiento de clulas madre embrionarias de ratn,
en 1989, abri nuevas posibilidades para estudiar la funcin gnica en animales
transgnicos (Thompson y col., 1989). Las clulas madres embrionarias se
obtienen desde el macizo celular interno de blastocistos y se pueden mantener en
cultivos sin perder su estado indiferenciado gracias a la presencia en el medio de
cultivo de factores inhibitorios de la diferenciacin. Estas clulas pueden ser
manipuladas in vitro va recombinacin homloga, permitiendo as alterar la
funcin de genes endgenos. Las clulas as modificadas pueden ser entonces
reintroducidas en blastocistos receptores contribuyendo eficientemente a la
formacin de todos los tejidos en un animal quimrico incluyendo la lnea germinal
(Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981). Esta tecnologa posibilita modificaciones
genticas muy finas en el genoma del animal, tal como la introduccin de copias
nicas de un gen. La incorporacin de una copia nica de un gen en un sitio
predeterminado del cromosoma tiene las ventajas de permitir controlar el nmero
de copias del transgen y se puede controlar la insercin de este en un sitio
favorable (transcripcionalmente activo) para su expresin tejido-especfica.
Utilizando esta tecnologa ha sido posible anular la funcin de genes endgenos
del ratn mediante la integracin de un marcador de seleccin, lo que ha permitido

44
la generacin de varios cientos de ratones llamados knock out que han servido
como modelos de enfermedades genticas en humanos y como modelos para
analizar la funcin de genes endgenos (Melton, 1994; Shastry, 1998; Kolb y col.,
1999; Wallace y col., 2000). Lamentablemente, la generacin de animales
modificados genticamente a travs de esta ruta ha sido limitada slo al ratn,
fundamentalmente por la imposibilidad de aislar clulas madre embrionarias de
otras especies que conserven la capacidad de totipotencialidad que caracteriza a
estas clulas (Clark y col., 1992; Niemann y Reichelt, 1993; Cibelli y col., 1998).
Aunque clulas parecidas a las clulas madre embrionarias (ES-like cells) han
sido descritas en otras especies (lo que ha contribuido a la formacin de vacas y
cerdos quimricos a partir de ellas), en ningn caso se ha demostrado que puedan
transmitir las modificaciones a su descendencia, lo cual ha impedido el
establecimiento de lneas de animales transgnicos a travs de esta ruta
(Niemann y Reichelt, 1993; Cibelli y col., 1998).

Transformacin gentica mediada por semen. En 1989 Lavitrano y col.

describieron la produccin de ratones transgnicos mediante inseminacin
artificial, utilizando semen que haba sido incubado con ADN exgeno. Aunque
atractivo por su simplicidad, este procedimiento ha sido muy cuestionado por su
poca reproducibilidad, ya que a pesar de los esfuerzos de los principales
laboratorios del mundo estos experimentos no pudieron ser repetidos en el ratn
(Brinster y col., 1989). Ms recientemente, el mismo grupo clama haber producido
cerdos transgnicos con una muy alta eficiencia de 54-60% (Lavitrano y col.,
1997); sin embargo, la integridad del transgen no fue analizada y otros estudios
demuestran que el ADN internalizado por esta ruta sufre re-arreglos y
recombinacin con el ADN genmico, lo que dificulta la formacin de lneas de
animales transgnicos con niveles de expresin estable (Zoraqi y Spadafora,
1997).

Transformacin gentica mediante transformacin de clulas somticas y

transferencia nuclear (clonacin). La transferencia nuclear se describi por
primera vez en 1952 en anfibios y consiste en extraer el material gentico de un
ovocito para posteriormente introducirle el material gentico de una clula del
animal a clonar. Los trabajos pioneros de Briggs y King (1957) demostraron que
los ncleos de clulas al estado de blastocisto eran capaces de dirigir el desarrollo
embrionario normal de ovocitos reconstituidos y generar una rana adulta a partir
de estas clulas. En la dcada de los ochenta se realizaron exitosamente
transferencias nucleares en la mayora de los mamferos como conejos (Stice y
Robl, 1988), cerdos (Prather, y col., 1989), bovinos (Prather y col., 1987) y ovejas
(Willadsen, 1986; Smith y Wilmut, 1989). Estos experimentos se realizaron por
medio de la disociacin de blastmeros embrionarios (clulas embrionarias no
diferenciadas) y su posterior transferencia nuclear. Sin embargo, los intentos por
realizar transferencia nuclear con clulas ms diferenciadas fueron infructuosos, lo
que llev a pensar que el ADN de clulas diferenciadas no poda reprogramarse,

45
surgiendo entonces el dogma de que el proceso de diferenciacin celular era
irreversible. Este dogma se derrumb el 27 de febrero de 1997, fecha en que Ian
Wilmut y sus colegas del Instituto Roslin, en Edimburgo, Escocia, explicaron en la
revista Nature cmo haban creado a la oveja Dolly. Dolly fue el resultado de la
fusin de un ncleo procedente de una clula mamaria extrada de una oveja
adulta con un vulo al que previamente se le haba extrado el material gentico
(proceso conocido como enucleacin). El equipo escocs demostraba as que las
clulas adultas y especializadas podan ser reprogramadas. La etapa clave de
este proceso fue la coordinacin del ciclo celular de la clula receptora y el de la
clula donante de ncleos que se logr mediante la deprivacin de suero de estas
ltimas (Campbell y col., 1996; Wilmut y col., 1997). La deprivacin de suero,
previo a la transferencia nuclear, induce a las clulas a salir del ciclo de
crecimiento y entrar en un estado de arresto celular o quiescencia (G0/G1 en el
ciclo celular), que se ha propuesto potenciara el desarrollo embrionario,
permitiendo a los factores en el ooplasma reprogramar el ncleo donante
(Campbell y col., 1996). Siguiendo los hallazgos de Campbell y Wilmut muchos
grupos han reproducido exitosamente estos experimentos (Schnieke y col., 1997;
Wells y col., 1997; Baguisi y col., 1999; Zakhartchenko y col., 1999a; Reggio y col.,
2001), con la excepcin de un grupo en Estados Unidos, quienes han
recomendado el uso de clulas proliferando activamente, esto es, clulas en G1
en el ciclo celular en vez de deprivadas de suero (Cibelli y col., 1998). Sin
embargo, ninguno de estos estudios compar directamente la eficiencia de ambos
tratamientos para producir animales clonados y estudios recientes, utilizando
fibroblastos fetales, han demostrado que la induccin del estado de quiescencia
en las clulas mejora significativamente el desarrollo a la etapa de blastocisto
comparado con clulas proliferativas, aunque no se evalu la tasa de xito de la
transferencia de estos embriones en receptoras sincronizadas (Hill y col., 2000;
Zakhartchenko y col., 1999b).

Problemas de la transgnesis. La introduccin de una nueva informacin

gentica (el transgn) dentro del genoma de un organismo puede presentar
algunos problemas en relacin a dnde y cundo expresar el transgn, tal como
se indica a continuacin:

- Integracin mltiple (en tndem o no)

- Lugar de integracin indeterminado (efecto de posicin)
- Metilacin y falta de expresin
- Mosaicismo (germinal y somtico)
- Expresin especfica/ectpica
- Expresin variable
- Expresin variable dentro de lneas (variegacin)

46
En cualquier caso, el ideal sera poder dirigir con total precisin el lugar de
integracin del transgn. As, por ejemplo, en 1999 se obtuvieron en el Roslin
Institute de Edinburgo las ovejas transgnicas Cupid y Diana a partir de la
clonacin de cultivos celulares modificados mediante recombinacin homloga
(gene targeting).

- Potenciales usos de la tecnologa de transferencia nuclear y recombinacin

homologa en produccin animal

- Clonacin de animales elite. Adems de proporcionar una ruta para la

generacin de animales transgnicos, la transferencia nuclear podra utilizarse
para realizar la imagen ms popular de la clonacin, esto es, la produccin de
cantidades ilimitadas de animales genticamente idnticos. La posibilidad de
multiplicar razas de animales seleccionados podra aumentar la eficiencia de la
productividad pecuaria. Sin embargo, la principal ventaja de la clonacin no sera
en los programas de seleccin, sino en la diseminacin ms rpida del progreso
gentico desde rebaos elite hacia los productores. Hasta la fecha esto se ha
venido realizando mediante la inseminacin artificial, la cual suministra slo la
mitad de los genes. Con la clonacin, los productores que pudieran pagar este
servicio recibiran embriones que seran clones de las vacas ms productivas de
los rebaos elite, con lo que incrementaran la performance de sus rebaos en tan
slo una generacin. En este escenario las empresas venderan embriones
clonados de la misma forma en que hoy comercializan el semen. Estos embriones
tendran la ventaja de un transporte ms fcil de los genotipos entre pases,
evitndose los inconvenientes de la cuarentena. Un potencial riesgo de esta
prctica estara en la posibilidad de prdida de diversidad gentica; sin embargo,
esto se podra evitar restringiendo la venta de un nmero limitado de clones de
cada genotipo a cada productor. Aunque los rebaos de algunos productores
pudieran consistir slo de animales clonados, el hecho de que estos fueran clones
de diferentes animales elite incrementara la diversidad gentica en estos predios.

- Conservacin gentica. Aunque la transferencia nuclear se asocia en la mente

de la gente con una prdida de la diversidad gentica, esta tcnica tambin
proporciona nuevas alternativas para la conservacin gentica. Con una cada vez
ms creciente presin comercial, muchas razas indgenas o criollas adaptadas a
las condiciones locales (a modo de ejemplo la raza Overo Negro en nuestro pas)
estn siendo reemplazadas por razas comerciales sujetas a sistemas intensivos
de produccin. Estas razas locales pueden contener importantes genes que
confieran resistencia a enfermedades y resistencia a las condiciones climticas
(fro/calor). Hay, por tanto, una urgente necesidad por prevenir su extincin. Los
mtodos actuales de conservacin consisten en almacenar semen o embriones
congelados, procesos que son largos y costosos. Como consecuencia, el futuro de
slo unas pocas razas est asegurado. La tecnologa de clonacin puede
47
proporcionar una forma ms simple y efectiva de conservar estas razas, por
cuanto muestras de sangre, biopsias de piel o incluso pelo pueden ser utilizadas
como fuentes de clulas que podran ser crecidas brevemente en el laboratorio,
mantenidas y congeladas mediante su almacenamiento en nitrgeno lquido para
ser luego utilizadas en experimentos de transferencia nuclear. El mejor ejemplo
del potencial de esta tecnologa lo demuestran los recientes experimentos en
diversas especies en peligro de extincin mediante transferencia nuclear
interespecies (Lanza y col., 2000; Kitiyanant y col., 2001; Loi y col., 2001; Lee y
col., 2003).

- Eliminacin de genes (gene knock out). La posibilidad de recombinacin

homloga (gene targeting) en clulas somticas previo a la transferencia nuclear
ha captado la atencin de las principales compaas biotecnolgicas que desean
capitalizar los frutos de esta tecnologa (Pollock y col., 1999; Reggio y col., 2001).
La modificacin gentica que conduce a la prdida de funcin de un gen, o ms
comnmente conocida como gene knock out, ha sido utilizada extensivamente en
el ratn para obtener un mayor entendimiento de la funcin gnica y como modelo
para ciertas enfermedades (Shastry, 1998; Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000).
Actualmente existe una gran carencia de rganos para trasplantes humanos que
no es cubierta por las donaciones. El trasplante de rganos de animales hacia
humanos (xenotrasplantes) podra ser la solucin. Sin embargo, existen muchas
barreras de rechazo entre especies que limitan su uso. La principal barrera
consiste en el fenmeno de rechazo hiperagudo debido a la presencia de
anticuerpos naturales contra eptopes del disacrido galactosa 1-3 galactosa
presente en las superficies celulares de mamferos, pero que estaran ausentes en
las superficies celulares de humanos y monos (Gallili y col., 1985). Este es uno de
los principales usos donde la tecnologa de recombinacin homloga acoplada con
transferencia nuclear est siendo explotada. La reciente generacin de cerdos
transgnicos en los que se elimin el gen 1-3 galactosiltransferasa y que permitira
la produccin de animales que carecen del eptope responsable del rechazo
hiperagudo, es una clara demostracin del poder de esta tecnologa (Phelps y col.,
2003).

Otra de las aplicaciones de esta tecnologa est en la creacin de animales

resistentes a ciertas enfermedades. Las enfermedades ocasionadas por priones
han tenido un enorme impacto econmico en algunos pases de Europa y la
utilizacin de productos animales para su uso en humanos es una preocupacin
constante. Este es el caso de la encefalopata espongiforme bovina (EEB) o ms
comnmente conocida como enfermedad de las vacas locas que sera la causa de
una nueva forma de enfermedad de Creuzfeldt Jacob en humanos denominada
vCJD (Hill y col., 1997). Experimentos realizados en ratones (Prusiner y col., 1993)
y ms recientemente en ovejas (Denning y col., 2001), demuestran que es factible
eliminar el gen para los priones (PrP) mediante recombinacin homloga y que los
animales producidos son resistentes al Scrapie. Dado que las ovejas y vacas

48
estn siendo utilizadas para producir protenas humanas de uso farmacolgico y
que estos animales poseen genes funcionales PrP, sera apropiado producir
poblaciones de animales resistentes a estos priones.

La tecnologa de recombinacin homloga ha sido ampliamente utilizada en el

ratn para producir varios modelos de enfermedades humanas. Sin embargo,
debido a las diferencias fisiolgicas sera ms apropiado disponer de modelos
animales que se asemejen ms al humano. Este es el caso del modelo para
fibrosis qustica creado en el ratn, donde se elimin el gen Cftr (Cystic fibrosis
transmembrane responder). Este modelo no present las caractersticas tpicas de
la enfermedad en humanos debido a las diferencias en la fisiologa del pulmn del
ratn (Davidson y col., 1995). La eliminacin del gen Cftr en la oveja se esperara
produjera un modelo animal para fibrosis qustica ms exacto debido a las
similitudes de la fisiologa pulmonar entre ovejas y humanos (Harris, 1997).

Las modificaciones en los animales que pudieran influir rasgos de produccin tales
como el crecimiento y la eficiencia de alimentacin son uno de los principales
objetivos en el mejoramiento animal. Ratones en donde el gen de la miostatina se
elimin mediante recombinacin homloga desarrollaron mayor musculatura
esqueltica que los controles no modificados (McPherron y col., 1997). Adems, el
fenotipo de doble musculatura de algunas razas bovinas, por ejemplo Belgian
Blue, ha sido asociado a modificaciones (mutaciones naturales) del gen de la
miostatina (Grobet y col., 1997). Por lo tanto, la eliminacin de este gen en
bovinos, ovejas y cerdos podra producir animales con mayor masa muscular, lo
cual sera de enorme importancia econmica. Tal es as que actualmente existe
una empresa biotecnolgica en USA (http:// www.prolinia.com) cuyo objetivo es
proporcionar la clonacin a los mejoradores de razas registradas, para luego
mediante ingeniera gentica proveer a estas razas elite de caractersticas
deseables como la mutacin para el gen de la miostatina.

Otra caracterstica productiva que se podra mejorar a travs de esta tecnologa es

la leche. La leche aporta cerca del 30% de las protenas consumidas en los pases
desarrollados. Por esta razn, la lactancia ha sido objeto de diversos estudios en
el campo de gentica, fisiologa y nutricin. La recombinacin homloga podra ser
utilizada para reemplazar genes de las protenas de la leche de los animales de
granja con la respectiva contraparte de los genes humanos para utilizarlos como
fuentes de protenas. Por ejemplo, la seroalbmina humana es utilizada
ampliamente para el tratamiento de quemaduras y como reemplazo de fluidos
corporales en ciruga. La escala de requerimiento de esta protena (~ 600
toneladas al ao) la hacen un muy buen candidato para su produccin a escala
comercial en la leche de vacas transgnicas. Desafortunadamente, la
seroalbmina bovina es muy similar a la humana, lo que genera problemas para
su purificacin. Una solucin sera reemplazar el gen bovino con su contraparte
humana, as la protena bovina sera eliminada sin alterar o comprometer la

49
viabilidad del animal. Otro ejemplo lo constituye la -Lactoglobulina que est
presente slo en la leche de rumiantes y no tiene una funcin conocida en el
proceso de secrecin de leche (Clark y col., 1998). Su presencia confiere algunas
propiedades de elaboracin indeseadas y se cree es la responsable de la mayora
de las alergias a la leche bovina, situacin que afecta a una considerable parte de
la poblacin mundial. Por lo tanto, la eliminacin de esta protena podra
proporcionar nuevas propiedades tecnolgicas a la leche (Richardson, 1985).

Adems, su eliminacin no slo ayudara con el problema de las alergias, sino que
tambin, debido a la compensacin que se producira en la concentracin de las
otras protenas de la leche, probablemente incrementara la concentracin de
casenas, lo que tendra un efecto directo para la industria quesera. De la misma
forma, la sobreexpresin de casenas en la leche se esperara que alterara
significativamente las propiedades tecnolgicas de la misma como fuera
demostrado recientemente por Brophy y col., (2003) y la expresin de proteasas
podra generar resistencia a enfermedades de gran impacto en el sector lechero
como la mastitis (Kerr y col., 2001).

- Aplicaciones de la transgnesis. La biotecnologa incluye cualquier tcnica que

utilice organismos vivos o parte de los organismos para fabricar o modificar
productos, mejorar plantas, animales o desarrollar microorganismos para usos
especficos (Rodrguez-Villanueva, 1986).

La potencialidad de la biotecnologa estriba en producir cantidades ilimitadas de:

Substancias de las que nunca se haba dispuesto con anterioridad

Productos que se obtenan en pequeas cantidades
Abaratamiento de los costes de produccin
Mayor seguridad en los productos obtenidos
Nuevas materias primas, ms abundantes y menos caras

Dentro de este contexto general, la Biotecnologa ha incorporado la transgnesis

animal con los fines que se indican a continuacin:

Mejora de caracteres productivos

Resistencia a enfermedades
Modelos animales de enfermedades humanas (por ejemplo, ratones knockout)
Animales transgnicos como biorreactores para la sntesis de protenas de alto
valor (protenas teraputicas): Las granjas farmacuticas o granjas
moleculares
Donacin de rganos: Xenotransplantes

- Las granjas farmacuticas. La Biotecnologa ha aplicado estas tcnicas

experimentales de transgnesis y ya hoy se estn estableciendo las primeras

50
granjas farmacuticas en las que se cran ovejas, cabras, vacas o cerdos
transgnicos que producen en su leche protenas teraputicas humanas (
Velander et al., 1997).

La manipulacin gentica de un mamfero domstico transgnico consiste, en

primer lugar, en preparar el fragmento de ADN que contiene el gen humano,
unindolo a otro fragmento de ADN correspondiente a un elemento regulador
(promotor) procedente de un gen que promueve la sntesis de una protena de la
leche (por ejemplo, la -lactoglobulina, la casena, etc.). De esta manera se
asegura que el gen humano slo se expresar en las clulas de las glndulas
mamarias del animal transgnico (oveja, cabra, vaca, cerdo) obtenido tras la
inyeccin del ADN manipulado en el proncleo masculino de un cigoto producido
por fecundacin in vitro. Sin embargo, actualmente, la utilizacin de la tcnica de
clonacin por transferencia de ncleos de clulas genticamente modificadas
resulta ms ventajosa. Con esta ltima tcnica, los investigadores del Roslin
Institute de Edinburgo obtuvieron por vez primera en 1997 ovejas transgnicas
procedentes de ncleos de fibroblastos fetales a los que se les haba introducido
el gen humano que codifica para el factor IX de coagulacin de la sangre
(Schnieke et al., 1997). Los resultados de estos autores demostraron adems que
la utilizacin de la tcnica de clonacin de los ncleos modificados genticamente
es mucho ms eficaz que la tcnica original de microinyeccin de ADN en los
proncleos de los cigotos.

Posteriormente, con estas tcnicas se ha conseguido que la leche de las hembras

transgnicas contenga tambin otras protenas teraputicas humanas (-1-
antitripsina, protena C, factor VIII de coagulacin, antitrombina III, etc.) que
pueden luego ser fcilmente separadas de las restantes protenas propias del
animal. Adems es importante sealar que el animal transgnico no se ve
perjudicado en su desarrollo porque el gen humano slo se expresa en las clulas
de las glndulas mamarias debido al regulador especfico al que se le ha asociado
y, por tanto, en las restantes clulas del animal no se sintetiza la protena humana
al estar silenciado el gen humano. En consecuencia, el animal domstico ha sido
convertido en un gran biorreactor sin perjuicio aparente para l.

Las primeras granjas farmacuticas fueron establecidas por compaas

biotecnolgicas como Pharmaceutical Proteins Ltd (PPL) en Escocia (1500
ovejas), Genzyme Transgenics en Estados Unidos (1000 cabras), Gene Pharming
Europe en Holanda (vacas), etc. Otros grupos de investigacin son partidarios de
la utilizacin de las granjas de cerdos transgnicos dado su corto tiempo de
gestacin (cuatro meses), el intervalo generacional (un ao) y el mayor tamao de
las camadas (10 a 12 lechones), teniendo en cuenta adems que una cerda
lactante produce unos 300 litros de leche al ao.

51
Las cifras econmicas demuestran la importancia futura de las granjas
farmacuticas: el mercado de protenas teraputicas, que actualmente se obtienen
principalmente mediante fermentacin o cultivo celulares, se estima en unos 7.600
millones de dlares anuales y se calcula que podr llegar a ser de 18.500 millones
de dlares el ao 2000 (ver Postel-Vinay y Millet, 1997 para una versin
divulgadora de los experimentos de clonacin y de animales transgnicos).

Las cifras expresadas pareceran justificar las enormes inversiones que es

necesario hacer para obtener animales transgnicos, tal como se indica en el
cuadro adjunto:

Tabla 3. Produccin de mamferos transgnicos en diferentes especies.

Animales transgnicos
producidos
Meses Coste en $ Protena
Especie % % embriones para estimado de producid
descendencia inyectados y obtener la cada animal a en la
transferidos F2 transgnico leche
(por
lactacin)
Ratn 17,3 2,6 7,5 $ 121 1g
Conejo 12,8 1,5 17 1 Kg
Porcino 9,2 0,9 38 $ 25.000
Ovino 8,3 0,9 52 $ 60.000 100 Kg
Bovino 3,6 0,7 100 $ 546.000 1.000 Kg
Fuente: A. Snchez Bonastre, 1999

De la ltima columna del cuadro anterior se deduce el valor econmico de los

rebaos de animales transgnicos. Indicaremos a continuacin algunas
realizaciones prcticas:

- Xenotrasplantes. Desde que el Doctor Christian Barnard hiciera su primer

trasplante de corazn, la tcnica de trasplante de rganos se ha generalizado en
la prctica mdica, habiendo alcanzado altsimos niveles de perfeccin. Sin
embargo, uno de los retos pendientes es el de la oferta y la demanda:
desgraciadamente muchos pacientes mueren antes de tener acceso al trasplante
deseado. Por ello la posibilidad de recurrir a especies animales como donantes de

52
rganos se plante hace ya muchos aos. De hecho, entre los aos 1964 y 1995
se han realizado 32 xenotrasplantes de rin, corazn, hgado y mdula sea
procedentes mayoritariamente de chimpanc y mandril con un resultado negativo
en todos los casos, tal como se indica en el cuadro adjunto:

Tabla 4. Trasplantes de rganos de animales a humanos.

TRASPLANTES DE RGANOS DE ANIMALES A HUMANOS

Donante rgano Supervivencia Nmero de Autor Ao
trasplantes
Chimpanc Rin Un paciente, 12 Reemtsma 1964
nueve meses
Mono mico Rin 10 das 1 Reemtsma 1964
Mandril Rin 4 das y medio 1 Hitchcok 1964
Mandril Rin Un paciente, dos 6 Starzl 1964
meses
Chimpanc Corazn Extirpado 1 Hardy 1964
Chimpanc Hgado Un paciente, 14 3 Starzl 1969-74
das
Mono Corazn Fracas (sin 1 Yacoub 1975
datos)
Mandril Corazn Rechazo agudo 1 Barnard 1977
Chimpanc Corazn 4 das 1 Barnard 1977
Mandril Corazn 3 semanas 1 Bailey 1985
Mandril Hgado 70 das 1 Starzl 1992
Cerdo Hgado 34 horas 1 Nakowka 1992
Mandril Hgado 26 das 1 Starzl 1993
Mandril Mdula El paciente vive, 1 Deeks e 1995
sea pero el Ildstat
trasplante
fracas
Fuente: Unidad de trasplantes del Total: 32
Hospital General de Massachussetts,
USA

La utilizacin de rganos procedentes de monos tena la lgica de su proximidad

evolutiva con la especie humana, pero la diferencia de tamaos de los rganos
entre las especies supona un serio inconveniente. Por eso se pens en el cerdo
como posible donante. Por otro lado, una causa importante del fracaso de los
xenotrasplantes es el rechazo hiperagudo que se produce cuando el organismo
humano reconoce la presencia del rgano de otra especie. De ah surgi la idea
de utilizar cerdos transgnicos como posibles donantes.

53
Respecto a la utilizacin de cerdos transgnicos como reservorio de rganos para
posibles trasplantes (xenotrasplantes) de corazn, rin o hgado a pacientes
humanos hay que ser todava muy cauto en relacin con las expectativas creadas.
El primer paso que se ha dado ha consistido en la obtencin de cerdos
transgnicos capaces de expresar el antgeno regulatorio del complemento
humano, evitando as el rechazo hiperagudo (Dr. David J.G. White, en Cambridge,
en 1992). No obstante, quedan por resolver an numerosos interrogantes, entre
ellos la posibilidad de que se transmitan al hombre infecciones virales de origen
animal (Le Tissier et al. 1997). De ah la importancia que tendra la posible
utilizacin de cerdos transgnicos ante la demanda creciente de rganos y las
correspondientes listas de espera. Para una revisin de los xenotrasplantes ver
Lanza et al. (1997) y Cooper et al. (1997).

- Aspectos bioticos. En un contexto biotico quiz podra ser conveniente hacer

una valoracin general sobre lo que significa la introduccin de genes humanos en
organismos no humanos. Habra que distinguir dos situaciones diferentes: la
primera, cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se
hace en beneficio del propio hombre, y la segunda cuando la transferencia del gen
humano al organismo no humano se hace exclusivamente en beneficio (o
perjuicio) de este ltimo.

Desde el punto de vista biotico, la situacin creada por la obtencin de

mamferos transgnicos portadores de genes humanos para la obtencin de
protenas teraputicas humanas no es esencialmente nueva ya que, desde los
primeros tiempos de la ingeniera gentica molecular, se han introducido genes
humanos en clulas bacterianas para obtener protenas humanas (insulina,
hormona de crecimiento, interfern, etc.). Tanto en el caso de las bacterias como
de los animales transgnicos que se convierten en factoras naturales
(biorreactores) de protenas humanas, la valoracin tica es positiva. En este
ltimo caso es importante sealar adems que, al quedar restringida la expresin
del gen humano a las clulas de la glndula mamaria, la fisiologa y desarrollo del
animal no se ven alterados y por tanto se evita cualquier dao a ste, quedando
protegidos as los derechos de los animales.

En el segundo caso planteado, cuando la transferencia del transgn humano se

realiza con el nico propsito de influir en el desarrollo del animal, la valoracin
tica puede ser negativa si se producen anomalas importantes en su fisiologa,
como ocurri en los cerdos que haban incorporado el gen humano de la hormona
del crecimiento. Finalmente, en este contexto podra decirse que algn gen
humano concreto en definitiva, un trozo de ADN merecera un tratamiento o
valoracin tica diferente al resto? La respuesta lgica sera negativa, so pena de
caer en una sacralizacin del ADN humano.
Cul es la valoracin tica de los xenotrasplantes? En primer lugar, habra que
tener la garanta suficiente de que no hay problemas de transmisin viral. An

54
sentada esta premisa, hay que reconocer que a muchas personas les repugna, en
principio, la idea de que alguien pueda llevar un rgano animal. Sin embargo
habra que recordar que desde hace mucho tiempo se realiza la implantacin de
vlvulas de cerdo a personas con ciertas insuficiencias cardiacas y todo el mundo
ha aceptado esta prctica mdica. Por otro lado, la existencia de prtesis de
material inerte (plstico, metales, etc.) podra ser igualmente rechazado y no lo es.
Ciertamente, desde el punto de vista tico parece que no habra razn para
rechazar los xenotrasplantes en la medicina del futuro, siempre que se solucionen
todos los aspectos tcnicos que son muchos que an quedan por resolver.

2.3.2 Clonacin. Despus de la exitosa clonacin de ovinos, bovinos y caprinos

numerosos laboratorios intentaron clonar cerdos. A pesar de los esfuerzos, en
esta especie los resultados no fueron buenos inicialmente. Esto motivo que
numerosos grupos hayan continuado con la produccin de cerdos transgnicos
por microinyeccin pronuclear. As se han generado cerdos con un incremento de
la conversin alimenticia, originados por la introduccin de la construccin
compuesta por metalotioneina + hormona del crecimiento (Nottle et al,.1999).
Recientemente tambin se han obtenido cerdos destinados a aumentar la
asimilacin del fsforo y reducir la concentracin de este elemento en las heces,
mediante la expresin de la fitasa bacteriana en la glndula salivar de cerdos, esto
tendra beneficios al reducir la polucin ambiental. La fitasa es una enzima que
desdobla el cido ftico liberando el fsforo del mismo (Golovan et al., 2001).
Tambin se ha alterado la leche de los cerdos para incrementar la salud y el
desarrollo de los lechones esto se ha logrado sobreexpresando alfa-globulina
bovina (Wheeler et al 2001). Estas tcnicas de modificacin gentica se realizaron
en estos trabajos basadas en la introduccin del DNA forneo por microinyeccin
en la cigotas. Esta metodologa es altamente ineficiente (1-2% de insercin
estable) y produce un alto grado de mosaiquismo debido a la insercin tarda
durante el desarrollo embrionario temprano.

El primer cerdo producido por clonacin de clulas somticas fue producido en el

ao 2000 (Polejaeva et al) desde esta fecha se han hecho importantes progresos.
Entre ellos la produccin del los primeros cerdos por incorporacin de genes al
azar (Park et al., 2000; Lai et al., 2001 y 2002). Si bien esta modificacin aumenta
la eficiencia en la obtencin de animales transgnicos, la integracin del transgen
contina siendo al azar, por lo cual la expresin del mismo es esencialmente
impredecible. Para solucionar este problema se han estado reclonando los
animales con expresin adecuada (Salamone et al., 2004) para tener animales de
produccin predecible, pero aun son necesarias futuras mejoras.

La tcnica de recombinacin homloga permite la modificacin precisa de los

genes existentes, evita los problemas derivados de los efectos posicinales y de
inactivacin por insercin y permite adems la inactivacin de genes especficos
as como el reemplazo de un gen por otro. La utilizacin de la tcnica de

55
recombinacin homloga permite aplicaciones sumamente atractivas en el campo
de la produccin animal (Piedrahita, 2000). En cerdos la transgnesis en sitio
especifico o recombinacin homologa ha sido lograda exitosamente (Day et al.,
2002; Lai et al., 2002; Ramsoondar et al., 2003; Sharma et al., 2003).

Los cerdos son fisiolgicamente similares a humanos y ha habido intenso inters

en utilizarlo para transplante de rganos, as como, para modelo de
enfermedades. La produccin de rganos y tejidos animales humanizados para
ser utilizados en transplante ha despertado tambin un inters enorme. Esto
implicar la expresin de ciertas protenas humanas y el silenciamiento de
algunas protenas de origen animal. Esto puede lograrse creando cerdos por
recombinacin homologa mediante el llamado knockout de la alfa-1,3-
galactosiltransferasa. La obtencin de productos para transplantes es probable
que se requieran sucesivas modificaciones genticas.

La expresin de protenas de valor biolgico especialmente de inters

farmacolgico usando como biorreactores animales transgnicos, ha demostrado
ser un sistema muy eficiente de produccin en numerosas especies. Las
limitaciones han sido el nivel de expresin, modificaciones post-transcripcionales
y el efecto biolgico de las protenas exgenas sobre el animal que las produce.
Una vez que el animal fundador ha sido obtenido tambin es una limitante llegar
a tener un buen nmero de animales a escala comercial. En el porcino se ha
seleccionado las vesculas seminales como rgano de expresin de dichas
molculas. Las ventajas que tienen dichas glndulas incluyen el hecho que el
semen luego de producida la pubertad, es generado constantemente y por lo
tanto tambin el fluido seminal, adems se puede colectar en una forma no
invasiva, no dolorosa y que no requiere gran entrenamiento. Un cerdo
transgnico puede producir por muchos aos y ser reemplazado por
reproduccin simple en forma no muy costosa. El plasma seminal es una
secrecin externa y una vez producida no es reabsorbida, es mas, el exceso de
secrecin prosttica es eliminada por uretra a travs de la orina. Esto permitira
expresar molculas con fuerte actividad biolgica y estara ofreciendo ventajas
frente a la glndula mamaria donde ya se ha observado la reabsorcin linftica
de protenas secretadas. Por otro lado ha sido demostrado que en ratones a los
que se le incorporo el transgen de la hormona del crecimiento para ser
expresado en vesculas seminales, no se incrementan los niveles en sangre de
dicha hormona cuando se llega a la pubertad. Incluso cuando se expresan
niveles de 500 ug/ml en el fluido seminal (Sirad et al., 2002). Adems los
espermatozoides son muy sensibles a cambios de pH y a las proteasas y el
fluido seminal esta preparado para proteger a los espermatozoides a travs de
anti-proteasas, esto es interesante porque probablemente sera posible
aprovechar esta caracterstica para preservar protenas frgiles. Las protenas
estn en el plasma seminal en forma soluble y no forman micelas como en la
leche donde las protenas pueden ser atrapadas en las mismas. Los

56
espermatozoides pueden ser centrifugados y el plasma seminal diluido y
purificado usando todo tipo de columnas sin problemas de formacin de
cogulos.

Los cerdos son una especie con una eficiencia reproductiva importante, un
macho heterocigoto puede inseminar unas 50 cerdas por mes utilizando
inseminacin artificial y cada una de estas puede dar origen a 10 lechones, 5 de
los cuales sern machos y 2-3 transgnicos, originando un grupo de 150
lechones en 5 meses, por lo que al ao habra un numero suficiente de machos
para empezar a producir a escala industrial.

A la pregunta cuales sern sus aplicaciones agropecuarias en nuestro sistema

de produccin? La respuesta es que nuestra capacidad de imaginacin e
innovacin es insuficiente. La aplicacin ms inmediata ser la multiplicacin de
animales de elite. La utilizacin de animales clonados facilitara la produccin y
difusin de animales transgnicos. Por ejemplo, existe inters en Europa en
reemplazar el gen PrP que torna a los bovinos susceptibles al virus de la vaca
loca por otro que le otorgue mayor resistencia. Numerosas compaas ya han
producidos animales transgnicos y clonados especialmente expresando nuevas
protenas en leche de valor farmacutico (Baguisi et al., 1999, Salamone et al.
2005). Hay proyectos que intentan producir cerdos modificados genticamente
para producir semen de un solo sexo, o utilizar cerdos como modelo para
enfermedades humanas como la arteriosclerosis, etc. (Forsberg, 2005). Todo
esto indica la enorme potencialidad de esta tcnica y el futuro desarrollo que
pueda alcanzar en la especie porcina.

- Tcnicas de clonacin de embriones. Con base en los conceptos de la

clonacin descritos anteriormente, se observa que existen tres tcnicas que han
sido utilizadas en animales de granja o de laboratorio para producir embriones
genticamente idnticos. Dos de ellas cabran en el concepto de la clonacin en
un sentido horizontal: la particin o divisin de embriones por microciruga, y la
separacin y cultivo de blastmeros aislados por mtodos enzimticos o
mecnicos (Agca y col 1998; Rexroad y Powell 1997). La tercera entra en el
concepto de la clonacin en un sentido vertical: la transferencia nuclear a partir de
clulas somticas de adulto o embrionarias (Campbell y col 1996) o de
blastmeros de embriones (Prather y col 1987; Savoir y col 1997; Tanaka y col
1997) entre otras clulas (Tabla 5).

57
Tabla 5. Principales Tipos de Celulares Utilizados en las Tcnicas de
Clonacin.
METODOLOGIA TIPOS CELULARES
a) Particin de Embriones Mrulas o blastocitos
tempranos o tardos (15,38).
b) Separacin y cultivo de Blastmeros de embriones en
blastmeros aislados diferentes etapas, desde 2
clulas hasta mrula
cultivndose in Vitro fuera o
dentro de la zona pelcida
(65,66,67).
Partenogenotes (ovocitos
activados qumicamente para
dividirse) para reagregar
blastmeros. (52,68).
c) Transferencia nuclear

Como carioplastos (clulas Blastmeros obtenidos de

donadoras de ncleos). embriones con diferentes
etapas de segmentacin
(desde 2 clulas hasta
blastocitos) (52,69)
Clulas somticas de
embriones (fotroectodermo o
masa celular interna o MCI,
fibroblastos fetales clulas de
Como citoplastos (clulas rin, piel, msculo, gandula
receptoras de ncleos) mamaria, y clulas cmulo o
espermatogenias de animales
adultos
(3,4,15,39,44,54,70,71,72)
Ovocitos enucleados
Cigotos
Embriones de 2 blastmeros
(19,54,71)

- Particin o divisin de embriones. En la dcada de los 70 se pensaba que los

embriones en fases tempranas de la segmentacin no sobreviviran despus de
una microciruga. Fue en los aos ochenta cuando se demostr que las mrulas y
blastocistos de los animales domsticos eran capaces de desarrollarse despus
de una particin y producir nacimientos viables (Rorie y Godke 1987). Actualmente

58
la particin de embriones permite la produccin de gemelos idnticos al dividir el
embrin original por mtodos microquirrgicos. Las evidencias experimentales
indican que existe una relacin inversa entre el nmero de secciones que se le
hagan al embrin y el porcentaje de xito. Las tasas de produccin de gemelos
monocigticos van desde poco mas de 30% en bovinos y ovinos (Edwards y
Beard 1998; Herman y col 1998; Williams y col 1983) siendo hasta casi 70% en
bovinos, con porcentajes de gestacin superiores a 60% (14) e incluso, en algunos
casos, equivalentes a 100% (Williams y col 1983).

El nmero de clulas que tenga el embrin no solo limita el nmero de segmentos

en que pueda dividirse, sino que tambin tiene incidencia sobre otros aspectos.
Tpicamente se utilizan embriones en etapa de mrula o blastocisto (Baker 1985;
Seidel 1993). Esta estrategia permite utilizar una de las secciones para otros fines
experimentales como la determinacin del sexo del embrin, mientras que el resto
se cultiva o congela para despus transferirse a hembras receptoras previamente
sincronizadas para mantener la gestacin (King y col 1992; Schmidt y col 1992;
Palma y col 1995).

Los embriones en etapa de blastocisto son seccionados de manera que se dividan

en dos partes iguales tanto la masa celular interna (MCI como el trofoectodermo).
Es recomendable emplear soluciones que deshidraten ligeramente al embrin (por
ejemplo, sacarosa 200mM), con lo que se reduce el dao al trofoectodermo
durante su particin. Una vez cortadas, las mrulas compactas y los blastocistos
no necesariamente deben ser introducidos a zonas pelcidas, teniendo una
sobrevivencia aceptable al ser transferidas en hembras receptoras; aunque
existen informes que indican tasas de supervivencia de 15% en medios embriones
(demi-embriones) sin zona pelcida y de 35% cuando se transfieren con zona
pelcida. En este ltimo caso las tasas de gestacin van de 55% a 65% en
bovinos (Baker 1985). Willadsen y Godke en 1995, obtuvieron tasas de gestacin
de 80% en bisecciones de embriones de ovino indistintamente si tenan zona
pelcida o no. En la tabla 6 se muestran algunos de los factores principales que
afectan las tasas de xito con esta tcnica.

- Separacin y cultivo de blastmeros aislados. En algunas especies, como los

equinos, se ha utilizado la separacin de blastmeros de embriones previos a su
implantacin para efectuar estudios de diagnstico de enfermedades genticas.
En ellos se ha determinado la viabilidad de los embriones analizados despus de
su transferencia en hembras receptoras, encontrndose tasas de gestacin de
21% (Huhtinen y col 1997).

En humanos la separacin y cultivo de blastmeros aislados tambin han sido

utilizados en estudios de biopsias de embriones en diferentes etapas de
segmentacin con la finalidad de dar alternativas a los estudios de diagnstico
prenatal, evaluando a su vez el desarrollo embrionario in vitro con el propsito de
que se seleccionen los mejores embriones capaces de desarrollarse en
59
blastocistos y congelarlos mientras se evalan sus blastmeros aislados (Geber y
col 1995; Pierce y col 1997; Geber y Sampaio 1999).

La tcnica de separacin de los blastmeros implica la remocin de la zona

pelcida, ya sea por mtodos qumicos, mecnicos o enzimticos, para
posteriormente obtener los blastmeros mediante aspiracin, extrusin o
disminucin de sus interacciones en soluciones libres de Ca2+ y Mg2+ (Savoir y
col 1997; Saito y Niemann 1991; Cheong y col 1993; Reicheit y Niemann 1994).
Los blastmeros de rata aislados en la etapa de dos clulas, son capaces de
formar embriones completos (Matsumoto y col 1989). En el ratn se han obtenido
gemelos idnticos removiendo la zona pelcida de embriones de dos clulas y
cultivndolos separadamente previo a su transferencia (Williams y col 1984). En
otras especies, el xito del experimento se ha determinado como dependiente de
diversos factores. As, por ejemplo, en porcinos y ovinos la baja eficiencia en la
obtencin de fetos se debe a la baja sobrevivencia in vivo.

En embriones libres de zona pelcida en fases previas a la compactacin

(Williams y col 1984). Esta tasa de nacimientos puede aumentarse si se utilizan
embriones encapsulados en gel de azarosa (Herman y col 1998; Lehn-jensen y col
1983). De manera que algunas estrategias para suplir a la zona pelcida son el
empleo de capsulas artificiales de azarosa (Willadsen 1979) o de alginato de sodio
(Eaton y col 1990; Adaniya y col 1993), o matrices extracelulares como la
fibronectina y laminina (Saito y niemann 1991; Wilton y Trounson 1989).

EI nmero de clulas que forman al embrin separado constituye otro factor

importante en la probabilidad de xito. Willadsen en 1989, demostr que la tasa de
gestacin en ovinos y bovinos se reduca conforme se hacan grupos de clulas
de nmeros menores. La mayor tasa de gestacin que obtuvo este autor fue del
66% al utilizar embriones de dos clulas o dos grupos de clulas provenientes de
embriones de hasta ocho clulas. Cuando utiliz embriones de cuatro clulas o
pares de clulas de embriones de ocho clulas, la tasa de gestacin se redujo a
50%. Cuando se utilizaron los blastmeros individuales provenientes de embriones
de ocho clulas, la tasa de gestacin fue de slo 5%. En todos los casos en los
que se separaron las clulas embrionarias, el nmero de clulas formando el
blastocisto se reduca linealmente con el nmero de "divisiones" a la que era
sometido el embrin. Un dato importante de este estudio es que cuando se
utilizaron las clulas individuales de los embriones de ocho clulas, el desarrollo
de la MCI se vea fuertemente comprometido al extremo de formarse slo
vesculas sin la presencia de este grupo de clulas.

60
Tabla 6. Factores que Afectan las Tasas de Gestacin en La Particin de
Embriones

FACTORES CONSIDERACIONES
Calidad morfolgica Mejores de grado 1 a 2 (14)

Fase de segmentacin de embriones Mejores resultado (30) y con mayor

tasa de gestacin (16) en blastocito
con mrula

Numero se secciones en las que se Los medios embriones (demi-

divide el embrin embriones) sobreviven mejor en el
tero que los 4 embriones (14), los 4
embriones carecen de MCI funcional,
viabilidad reducida (30)

Presencia de zona pelcida Resultados controversiales, necesaria

en algunos casos (66) o con escasa
diferencia (16)

Sistema de cultivo de los embriones Mejor en oviducto ligados que in Vitro

partidos

Numero de demi-embriones Relacin directa entre el numero de

trasferidos a hembras receptoras demi-embriones trasferidos y la tasa
de gestacin

Preservacin Menor probabilidad de supervivencia

de demi-embriones congelados (14,
23)

Sexo Afectado por la manipulacin y el

cultivo de embriones, mayor prdida
de embriones femeninos (20)

Aparentemente, en los blastmeros aislados se promueve ms fcilmente la

apoptosis y se afecta preferentemente a las clulas de la MCI. Este proceso
contribuye a la incidencia de abortos debido a que la poca cantidad de clulas de
la MCI reduce la viabilidad fetal (Chan y col 2000).

En monos esta misma tcnica ha sido aplicada a partir de embriones de ocho

clulas, en la que se separan los blastmeros mientras son mantenidos en medio

61
libre de Ca2+ y Mg2+ ,y luego se reagrupan por pares que se introducen en zonas
pelcidas para que puedan desarrollarse hasta la fase de compactacin y as
transferirlos a hembras receptoras. El 8% de los embriones tratados brindaron
cras vivas (Chan y col 2000).

- Transferencia nuclear. Una tcnica que incrementa el potencial de desarrollo

de los blastmeros aislados de embriones de ocho clulas o de etapas mas
tardas de la segmentacin es la transferencia nuclear (Willadsen 1989). Esta
tcnica permite la produccin de individuos genticamente idnticos originados a
partir de un solo donador de ncleos (Romo 1994). Implica la insercin por
mtodos qumicos, fsicos, biolgicos o mecnicos del ncleo de una clula
donadora que puede ser tomada de varios tejidos a la cual se le llama carioplasto,
con un ovocito activado y carente de ncleo, o con un huevo fertilizado al que se le
hayan extrado los proncleos (Edwards 1998; Wlladsen 1989; Meng y col 1997;
Bromhall 1975). Contrariamente a lo que pudiera pensarse, el desarrollo de esta
metodologa es ms bien antiguo, si bien hasta hace poco ha acaparado el inters
no slo de la comunidad cientfica, sino del pblico en general. En la tabla 7 se
muestra una cronologa de los eventos ms importantes en la obtencin de
organismos clonados por transferencia nuclear.

Es importante destacar que tanto el citoplasma que recibir al ncleo transferido

como el propio ncleo deben tener caractersticas fisiolgicas especficas para que
se realice con xito tanto la transferencia nuclear como el desarrollo posterior de la
clula reconstituida y, eventualmente, el desarrollo del nuevo organismo. La clula
que contiene al ncleo que ser transferido (carioplasto) debe tener caractersticas
particulares que permitan cierto porcentaje de xito antes de ser colocado en el
espacio perivitelino adyacente a la membrana del ovocito (citoplasto) y se fusione.
Experimentalmente el uso de citocalacina B para bloquear la polimerizacin de
microfilamentos, y de colchicina para la de los microtbulos, permiten controlar los
movimientos del citoesqueleto en el carioplasto, provocar una elasticidad de la
membrana plasmtica y favorecer as la enucleacin mediante el uso de
micropipetas, sin romper la membrana plasmtica (Edwards 1998; Prather y col
1987; Cheong y col 1993; McGrath 1983; Prather 1990; Yong 1998).

Si se utiliza un embrin en segmentacin como carioplasto, tambin requerir de

la micromanipulacin para obtener sus blastmeros. Uno de estos ltimos se
transfiere dentro del ovocito en metafase II desprovisto previamente de su ncleo,
y se fusiona con l. Mediante este proceso, el ovocito se activa y da inicio a su
desarrollo como un nuevo embrin. En algunas especies la sola transferencia del
carioplasto inicia la activacin del ovocito (Edwards 1998; Prather 1990; Bromhall
1975; McLaren 1984).

62
Tabla 7. Cronologa de la clonacin mediante transferencia Nuclear y
separacin de blastmeros

AO EVENTO
Hans Speman divide un cigoto de salamandra con un cabello; mantiene
al ncleo en una de sus mitades que continua su segmentacin. Al
1938
retirar la barrera, uno de los nuevos ncleos llega al interior de la mitad
que careca de l y se segmenta hasta convertirse en otro embrin.
Robert Briggs y Thomas King demuestran que los ncleos de
1952 blastocistos de rana (rana pipiens), son capaces de desarrollar
renacuajos al ser transferidos a ovocitos enucleados.
Di Bernardino observa que los ncleos aislados de embriones en etapa
1967
de gstrula, desarrollan renacuajos anormales.
Se efectan algunos experimentos parcialmente exitosos con ncleos de
1970 clulas intestinales de sapos. Estos clones se desarrollan hasta alcanzar
el estado de renacuajos, sin llegar a adulto.
Primer reporte al nacimiento de ratones provenientes de la transferencia
de ncleos de clulas somticas en ovocitos enucleados, al intentar
1981
repetir estos experimentos otros investigadores no pudieron lograrlo.

Clonacin de ovinos utilizando ncleos de blastmeros de embriones

1984 por fusin con virus Sendai o campo elctrico con ovocitos enucleados.
Ovejas al trmino de su desarrollo.
Nacimientos de dos terneros a partir de cigotos reconstituidos con
ncleos de blastmeros de embriones electrofusionados con ovocitos
1987 enucleados.
Cultivo in vivo en oviductos de oveja hasta blastocisto y transferencia a
una vaca receptora hasta que llegaron al trmino de su desarrollo.
Uso de color ante Hoechst para monitorear el proceso de enucleacin
1992
de ovocitos de bovino. Nacimiento de 32 terneros.
Electrofusin de ncleos de ratn a partir de blastmeros de embriones
1993 en estado de 2 ,4 y 8 clulas con ovocitos, con nacimiento de cras
vivas.
Nacimiento de ovejas vivas partiendo de ovocitos enucleados por
1996 transferencia de ncleos de clulas epiteliales de embriones de 9 das
de gestacin mantenidas en etapa Go.
Nacimiento de Dolly utilizando el ncleo de clulas derivadas de
glndula mamaria de oveja adulta arrestada en la fase G por reduccin
1997
de suero en el medio.los ncleos fueron electrofusionados a ovocitos
enucleados. La tasa de xito es inferior al 1 %.
Nacimiento de Neti y Dite dos monos Rhesus obtenidos por
electrofusin de ncleos derivados de fertilizacin in vitro y ovocitos
1997 madurados in vitro, enucleados y activados con cicloheximida. Tasa de
xito de 3,77%.
Obtencin de cerdos clonados mediante electrofusin y microinyeccin
2000
de ncleos. Tasa de xito inferiores al 8 %.

63
La primera etapa de esta metodologa es la obtencin del citoplasma adecuado
para que sirva de aceptor del ncleo. A los ovocitos en metafase II se les retira el
ncleo, en el caso de huevos fertilizados, se les extraen los proncleos en
microscopa de contraste de fases. Para confirmar que el material cromosmico
haya sido totalmente extrado, se aplican tinciones de ADN en el citoplasma del
ovocito. El colorante ms utilizado para esta etapa es el Hoechst 33258 para
visualizar la ausencia de contenido nuclear en los ovocitos enucleados, bajo luz
ultravioleta durante perodos de menos de diez segundos, sin efectos negativos en
el desarrollo de los embriones reconstituidos (Yong 1998; Stice y col 1993; Le
Bourhis y col 1998).

Respecto a las caractersticas del carioplasto, entre mas diferenciada est la

clula somtica, menor ser la probabilidad de xito en la transferencia nuclear.
Para que una clula sea totipotencial requiere que su ncleo sea capaz de
desarrollarse en un nuevo embrin (Solter 1996). Para ello los genes que dan
lugar al desarrollo de un organismo completo deben estar presentes an cuando
no todos sean expresados (Casas y col 1998). Algunos de los genes que deben
expresar las clulas totipotentes son el gen Tnap, los factores de transcripcin, los
genes Oct 3/4, el proto-oncogen ckit, y la ADN metiltransferasa Mt (Urven y col
1993).

La experiencia con mltiples tipos celulares tanto embrionarios como de tejidos

diferenciados ha demostrado que el uso de ncleos de blastmeros obtenidos de
embriones de dos clulas es mas eficiente que los de ocho clulas; asimismo, los
ncleos de blastmeros de las clulas de la MCI son mas eficientes que los de las
clulas de la granulosa, por ende, las clulas embrionarias son mas efectivas que
las clulas de individuos adultos (Edwards 1998). A su vez, los ncleos de las
clulas de la MCI son ms efectivos que los de las clulas del trofoectodermo
(McLaren 1984). Cheong et al (1993) encontraron que al utilizar ncleos de
blastmeros de embriones de dos, cuatro y ocho clulas que se hallaran en la fase
temprana del ciclo celular (fase G 1 de la segunda divisin), como donadores de
ncleos para ser transferidos, los de dos clulas daban 78% de blastocistos y 29%
de ratones nacidos vivos a partir de los embriones reconstituidos, mientras que los
de cuatro clulas daban 71% de blastocistos y 22% de ratones nacidos vivos, y los
de ocho clulas daban 46% y 17% respectivamente. En resumen, los ncleos
obtenidos de embriones en las fases tempranas de la segmentacin tienen la
ventaja sobre los provenientes de clulas diferenciadas en que los primeros
revierten con facilidad los cambios que sufren previo a su diferenciacin; mientras
que los ltimos deben revertir los cambios que ya han sufrido durante ms de 30
ciclos de divisiones celulares.

Es por ello que una transferencia nuclear eficiente, con un desarrollo a trmino del
huevo manipulado, depender de la reprogramacin adecuada del ncleo
donador. Las macromolculas del tipo del ARN mensajero y las protenas

64
almacenadas en el ovocito slo soportan el desarrollo embrionario durante un
tiempo relativamente corto. Entre ms corto sea este perodo, se requerir menor
tiempo para la reprogramacin. Conforme el embrin sufre cambios mayores y
crece, sus clulas requerirn mayor tiempo y ser probable que esta
reprogramacin no se lleve a cabo adecuadamente. En algunas especies, la
activacin de la transcripcin del genoma reintroducido ocurre hasta el estado
previo al blastocisto, por 10 que depende de la transcripcin del ARN materno. En
embriones productos de una fertilizacin normal, este proceso se lleva a cabo a
diferentes tiempos en diferentes especies: a partir del estado de dos clulas en
ratones y caprinos; de cuatro clulas en porcinos; y en el paso de ocho a diecisis
clulas en embriones de ovinos y bovinos (Prather y col 1987). En la transferencia
nuclear, la compatibilidad entre el citoplasma recipiente y el ncleo donador, es
poco entendida an y toma parte en la reprogramacin del ncleo donado (Solter
1996).

Dentro de los cambios que deben revertir los ncleos de las clulas de adulto
durante la transferencia nuclear est la metilacin del ADN que es esencial para el
desarrollo embrionario. El genoma del ovocito est poco metilado, mientras que en
el embrin comienza a incrementarse esta metilacin. Esto ultimo afecta la
expresin de los genes, la inactivacin del cromosoma X, la diferenciacin celular,
y el imprinting (Kokalj-Vokac 1998). Otros cambios asociados son la activacin de
las histonas y modificaciones en otras protenas nucleares. Si estos cambios no se
revierten, durante el crecimiento ocurriran modificaciones genticas de los
ncleos adultos, tales como la mutagnesis somtica, los errores mitticos, las
deleciones y trisomas (Edwards 1998).

Con el propsito de revertir los cambios en las clulas diferenciadas y as

incrementar las tasas de xito en la fusin y en el desarrollo de embriones
reconstituidos por medio de la transferencia nuclear, es importante la
sincronizacin de los ciclos celulares de las clulas donadoras de ncleos y de los
ovocitos receptores (Meng y col 1997; Solter 1996; Serrano y col 1997). Merchant
en 1996, le llama a este proceso sincronizacin nucleocitoplsmica.

Como es ampliamente conocido, durante la vida fetal y hasta la pubertad, el

ovocito de los mamferos se encuentra detenido en la etapa de diploteno de la
profase de la meiosis I y sus cromosomas se condensan poco antes de que ocurra
la ovulacin por accin de las gonadotropinas. Este estmulo promueve que el
ovocito reasuma su programa de divisin formndose el ovocito secundario con su
primer cuerpo polar, eliminando as la mitad de su material gentico. En los
mamferos adultos, el crecimiento del ovocito es continuo y termina en la
ovulacin, cuando es depositado en el oviducto en donde madura e inicia su
segunda divisin meitica (meiosis II), en la cual se vuelve a detener, solo que
esta vez hace en la metafase II. El ovocito arrestado en metafase II continuar su
divisin nicamente si es activado por el espermatozoide durante la fertilizacin,

65
en cuyo caso culminar su segunda divisin meitica y formar el segundo cuerpo
polar (Merchant 1997; Loi y col 1998; Wassarman 1999).

Durante la maduracin y la activacin, el citoplasma del ovocito modifica sus

propiedades en la medida en que la clula es liberada del arresto en la metafase II
y es activada con la fertilizacin mediante una serie de descargas de calcio que
promueven la reaccin cortical. Una vez ocurrida la fertilizacin, la transcripcin
del ARN materno comienza a controlar el desarrollo en las primeras divisiones
mitticas hasta la activacin del genoma embrionario. Cuando se efecta una
transferencia nuclear, la transcripcin del genoma materno del ovocito dirige al
ncleo donado mientras que ste es capaz de asumir el control de las fases
embrionarias tempranas por s mismo (Edwards 1998).

AI igual que en las clulas que se dividen, el ciclo celular del ovocito se encuentra
controlado mediante dos factores protenicos: el factor promotor de la mitosis de la
maduracin (MPF) formado por una ciclina y la cinasa dependiente de ciclina, y el
factor citosttico (CSF) que es esencialmente el mismo MPF pero asociado a una
protena que inhibe la accin de la cinasa. Cuando la protena inhibidora de la
ciclina se degrada, la clula es capaz de sintetizar ADN, si el inhibidor no se
degrada, la clula primeramente es incapaz de entrar a la fase S del ciclo y, en
consecuencia, puede condensar de manera prematura su material gentico.
Cuando las concentraciones del MPF se elevan, se inducen algunas alteraciones,
tales como la desintegracin o rompimiento de la envoltura nuclear (DEN), la
condensacin prematura de los cromosomas (CPC) y la reorganizacin del
citoesqueleto (Campbell y col 1996; Meng y col 1997).

Para que los eventos ocurran apropiadamente despus de la transferencia

nuclear, los niveles de MPF deben descender o ser bajos. De otro modo la
incidencia de dao cromosmico y aneuploidas puede ser alta (Meng y col 1997;
Yong 1998). Si la transferencia nuclear se hace cuando el ovocito tiene bajos
niveles de MPF (siete a diez horas despus de su activacin), no slo se
presentarn menos problemas de aneuploidas, sino que adems se mantendr
intacta la envoltura nuclear y los cromosomas no se condensarn
prematuramente, por lo que continuarn su ciclo de replicacin-condensacin de
manera normal, favoreciendo la sincronizacin nucleocitoplsmica y con ello el
desarrollo del cigoto as reconstituido (Merchant 1997).

Si se fusionan clulas en G con clulas en G, el material gentico de estas ltimas

sufre una condensacin prematura como si estuviera lista a iniciar los movimientos
clsicos de la divisin celular (mitosis). Si la fusin es entre clulas en etapa S y
G, la sntesis del material gentico se completa y el contenido de cromosomas en
el producto es aberrante, pues no slo hay ms sino que incluso las clulas hijas
sufren la falta de uno o varios de ellos, mientras que la otra presenta ms de un
par de copias de un cromosoma (trisomas) (Serrano y col 1997). Los ncleos

66
donadores que se encuentren en la fase del ciclo G resultan en un mejor
desarrollo que los que estn en fases S o G, ya que es ms sencillo reprogramar
un genoma que est abierto para sufrir una replicacin, adems de que los
factores citoplsmicos tienen mayor acceso al genoma cuando las clulas
donadoras estn en dichas fases (Wilmut y col 1997). Los ncleos se inducen a
entrar en un estado de quiescencia (G) cultivando las clulas donadoras o en
medios con cantidades reducidas de suero. De esta manera se coordinan los
ciclos celulares del carioplasto y citoplasto.

Ahora bien, para la fusin de carioplastos y citoplastos se han utilizado estmulos

elctricos, virales y qumicos. La fusin elctrica y la fusin viral se han utilizado
en roedores, lepridos y ovinos. La fusin elctrica se ha usado adems en
bovinos y en monos rhesus (Meng y col 1997; Prather 1990). La fusin inducida
por el virus Sendai tiene el inconveniente de que los ncleos transferidos no
sobreviven o los embriones reconstituidos no logran segmentarse. Las tasas de
xito en la fusin por virus son de 30% en ovinos, siendo de tan solo 8% en
bovinos (Prather 1990; Bromhall 1975), por que este tipo de estmulo ya no se
utiliza. Una vez efectuada la fusin, los factores presentes en el citoplasma del
ovocito enucleado y activado sern los que reprogramen al ncleo, confirindole la
habilidad para regular el desarrollo embrionario hasta que llegue a trmino
(Edwarsd 1998; McLaren 1984). Este desarrollo embrionario puede llevarse a
cabo in vitro, o in vivo en oviductos de ovino (Wlladsen 1989; Prather 1990).

Todava existe gran variabilidad de resultados con estas tcnicas, con tasas de
xito en la electrofusin de blastmeros obtenidos a partir de embriones de ocho
clulas del 90% en ovinos, 74% en bovinos, 84% en lepridos y 87% en porcinos
(Prather 1990), y tasas de gestacin de 0% a 54% (1) o hasta de 78% en bovinos.
En esta ltima especie, las tasas de segmentacin de los embriones reconstituidos
varan segn el sexo de los mismos: 73% para embriones hembras, 63% para
embriones machos (Le Bourhis y col 1998).

Existe un informe interesante en bovinos que describe la transferencia nuclear

utilizando ovocitos de vacas Holstein (Bos taurus) con ncleos de clulas aisladas
de embriones Brangus (5/8 Angus, Bos taurus y 3/8 Brahman, Bos indicus).En otra
etapa del estudio, utilizaron blastmeros de embriones de ocho a diecisis clulas
de ovino que se fusionaron con ovocitos enucleados de caprino, desarrollndose
hasta el estado de ocho clulas al ser cultivados in vivo en oviducto de ovino. Lo
anterior demuestra que es factible obtener un clon a partir de dos clulas
provenientes de diferentes especies animales y cultivarlo in vivo en el aparato
reproductor de una especie no homloga (Willadsen 1989).

- Ventajas y desventajas de las tcnicas de clonacin. La clonacin a partir de

clulas de animales adultos tiene algunas ventajas y desventajas dependiendo de

67
la tcnica que se trate (Cuadros 4 y 5), aunque en general todas tendran la
ventaja de que al conocerse las caractersticas del donador permitiran seleccionar
a los individuos con alto valor biolgico o productivo si las caractersticas
seleccionadas dependen solo de factores genticos, lo que no es tan probable por
el efecto de las condiciones ambientales, de manera que se desconoce hasta qu
grado es un clon realmente idntico a su donador (Lisker y Tapia 1997).

Tabla 8. Principales ventajas de la particin o divisin de Embriones

Solo se obtienen de uno a cuatro embriones monocigticos, y solo la mitad

de ellos llegan al trmino en su desarrollo (21,73).
Los demi-embriones obtenidos con esta tcnica no resisten la
criopreservacin.
Reduccin de las tasas de gestacin posteriores a la transferencia en
hembras receptoras (21).
Dificultad de separar con exactitud dos mitades que sean exactamente
iguales entre s, por lo que los individuos monocigticos no son 100%
idnticos (30).

Una de las consideraciones que deben hacerse cuando se planea la clonacin por
transferencia de ncleos tornados de clulas de adultos, es que stos reflejan la
edad biolgica del donador. Esto ltimo parece ser trivial, sin embargo tiene
importancia si se analiza lo ocurrido con las regiones terminales de los
cromosomas. En estas regiones se encuentra ADN de secuencia altamente
repetida y en forma general, por tripletes o ttradas de nucletidos repetidos,
dichas secuencias se conocen como microsatlites. Experimentalmente se ha
determinado que el nmero de repeticiones que debe tener es importante para la
funcin celular. Durante el envejecimiento, cada vez que la clula se divide el
nmero de estas repeticiones se hacen menores y permiten que se desarrollen
enfermedades propias de la edad adulta an en organismos "jvenes" (Marshall
2000).

Sin embargo, Lanza et al. (2000), observaron que en bovinos clonados por
transferencia nuclear a partir de clulas somticas envejecidas in vitro, ocurra un
aumento en la duracin de la vida replicativa de la clula as como en la longitud
de sus teloneros. As mismo, las clulas somticas que han estado expuestas a
carcingenos qumicos y radiaciones durante perodos prolongados, en este
sentido, es posible que hayan acumulado mutaciones que pueden manifestarse
durante la gestacin, como malformaciones congnitas o predisposiciones a
diversas enfermedades en los recin nacidos (Lisker y tapia 1997).

68
Tabla 9. Comparacin entre la clonacin por separacin de Blastmeros y la
transferencia nuclear

SEPARACION DE BLASTOMEROS TRANSFERENCIA NUCLEAR

VENTAJAS
Obtencin de individuos 100% Obtencin de copias genmicas
idnticos genticamente entre de individuos superiores.
s.
Facilidad de obtencin de
blastmeros aislados.
No requiere mtodos
especializados para obtener los
carioplastos, citoplastos o la
fusin entre ellos.
En la separacin y la
reagregacin de blastmeros,
los blastocitos obtenidos de
quntuples y sptuples pueden
utilizarse para establecer
clulas totipotenciales.
DESVENTAJAS
Necesita determinarse el medio Los clones no son 100%
ptimo para el desarrollo idnticos genticamente debido
embrionario in vitro para cada a la participacin del ADN
especie utilizada. mitocondrial-
Puede requerir de la utilizacin Los clones muestran diversos
de zonas pelcidas o de grados de alteracin.
sustitutos de ellas. Requiere de metodologa y
Bajas tasas de xito en cras equipos sofisticados para
nacidas que se reducen al obtencin de cariplastos,
utilizar embriones en fases citoplastos y su fusin.
avanzadas de la segmentacin. Requiere de una adecuada
Tasas de aborto elevadas sincronizacin nucleoplsmica.
despus de transferir embriones Bajas tasa de xito en cras
clonados en hembras nacidas.
receptoras.

Con la clonacin queda todava un buen nmero de problemas a resolver, como

son la eficiencia de la tcnica de transferencia nuclear, que actualmente es muy
baja y demasiado costosa para aplicarla comercialmente de manera rutinaria, ya

69
que an en el estudio mas conocido de esta tcnica se obtuvo una eficiencia de
0.36% (Wilmut y col 1997). Considerando que el patrn de desarrollo de los
cigotos es muy diverso, la adaptacin de las tcnicas a otras especies precisa an
de una extensa investigacin para cada una de ellas (Merchant 1997).

- Aplicaciones de la clonacin de embriones. En el mbito cientfico, la clonacin

ha abierto un nuevo campo de experimentacin para abordar problemas
fundamentales sobre los mecanismos que controlan la diferenciacin celular en el
inicio del desarrollo (Merchant 1997). Tambin es til en los estudios de fisiologa,
embriologa, gentica y crianza animal (Herman y col 1998; Williams y col 1984).

Los individuos genticamente idnticos pueden ser de sumo valor para los
experimentos controlados en los que se evalen los efectos ambientales, tales
como nutricin, instalaciones y medicamentos. La transferencia de genomas
idnticos en diferentes tipos de citoplastos permitira evaluar las interacciones
entre citoplasma y ncleo (Williams y col 1983; Prather 1990).

Los clones transgnicos y los derivados de clulas primordiales pueden ser

incluidos en la investigacin de terapias celulares o genticas, principalmente si se
trabaja con primates no humanos, ya que esto ltimo salvara la distancia
existente entre las especies de roedores comnmente utilizadas en los
laboratorios para desarrollo y prueba de frmacos de uso en humanos. En enero
de 2001, el grupo de Gerald Schatten dio a conocer el nacimiento de un simio que
tiene insertado el gene de la protena verde fluorescente (GFP), de tal suerte que
sus clulas pueden ser utilizadas con relativa facilidad para estudios encaminados
a determinar los efectos nocivos de frmacos que puedan ser semejantes a los
obtenidos en humanos, por lo que los estudios de fases terminales pueden ser
mas rpidos y con un modelo mas cercano evolutivamente, en lugar del riesgo que
implica hacer la extrapolacin del modelo de roedor o conejo, comnmente usado
en la investigacin farmacolgica.

Asimismo, los clones con fechas distintas de nacimiento (considerando que de un

mismo grupo de clones unos sean transferidos directamente y otros sean
congelados para transferirlos con posterioridad) tienen aplicacin en el anlisis
fenotpico de los individuos clonados antes de que sean propagados y en la
transferencia seriada de clulas totipotentes para dirigir la edad celular mas all de
las expectativas de vida (Mclaren 1984). Adems, los clones implantados en una
misma hembra subrogada podran probar los efectos epigenticos que incluyan el
ambiente materno (Chan y col 2000).

- Clonacin de embriones por generacin mltiple. La ltima meta de los

proyectos de clonacin de embriones es producir gran nmero o un nmero
ilimitado de individuos idnticos a partir de un individuo original. Lo anterior ha sido
llevado a cabo a travs de la clonacin por generacin mltiple tambin conocido

70
como reclonacin, que utiliza embriones clonados por transferencia nuclear como
donadores de ncleos para producir la prxima generacin de embriones
idnticos. De manera que si el primer ciclo de transferencia nuclear produce 10
embriones clonados viables, el siguiente ciclo posiblemente resultara en 100
embriones clonados en la segunda generacin (Singla y col 1997; Stice y col
1993).

A este respecto, desde la dcada de los 80, se han reportado resultados exitosos
en los procedimientos de reclonacin, pudindose obtener seis generaciones de
embriones (Willadsen 1989) y terneros de tercera generacin a partir de
embriones en diferentes estados de segmentacin, obtenidos por transferencia
nuclear. Asimismo, la multiplicacin en serie de embriones mediante la clonacin
ha incrementado el nmero de progenie producida de un embrin donador
determinado. Mediante ciclos repetidos de transferencia nuclear, se han obtenido
gestaciones de clones de tercera generacin y se han producido embriones en
etapa de blastocisto de clones de quinta generacin. Los lmites de la clonacin en
serie an no han sido definidos. Las tasas de gestacin de los embriones en
estado de mrula o blastocisto producidos por clonacin en serie no difieren de las
tasas de gestacin de los clones derivados de embriones frescos (Singla y col
1997; Stice y col 1993).

Se ha visto que los blastmeros provenientes de embriones clonados por

transferencia nuclear en etapas mas tempranas de la segmentacin, tienen
mayores probabilidades de fusionarse a los citoplastos que los provenientes de
embriones clonados en etapas mas tardas de la segmentacin, y que esto va
relacionado con el tamao del blastmero que se va a transferir. Las tasas de
xito en la reclonacin difieren con relacin en el tiempo de cultivo y el nmero
generacional del clon; por ejemplo, cuatro das de cultivo in vivo en oviductos de
ovino da lugar a tasas de fusin de 68% en embriones reconstituidos de bovino,
respecto del 57% obtenidos tras cinco das de cultivo in vivo. Sin embargo, los
clones de cinco das de cultivo pueden producir 4.5 generaciones de clones,
mientras que los de cuatro das solo 3.6. La tasa de xito en la fusin se reduce de
una generacin a otra, ya que de una lnea clonada se han obtenido 11 clones en
la primera generacin, 16 en la segunda, 20 en la tercera y solo 7 clones en la
cuarta generacin (Stice y col 1993).

Yong y Yuqiang (1998), lograron obtener cras de caprino de la primera a la sexta

generaciones, de las cuales tres pares fueron gemelos monocigticos, tres series
fueron de triples monocigticos, dos series de cudruples monocigticos, tres
series de quntuples y una serie de heptaples monocigticos.

Los abortos y las tasas de gestacin pueden diferir entre reclines y la primera
generacin de embriones clonados por transferencia nuclear. Willadsen (1989),
informa que la segunda o posteriores generaciones de bovinos y ovinos, tienen

71
tasas de gestacin mas bajas que la primera generacin de embriones clonados, y
que las tasas de aborto se incrementan a partir de la segunda generacin.

Con el estudio profundo y el adecuado control de las deficiencias actuales de la

clonacin, en un futuro la clonacin en serie permitir a su vez, la clonacin de
animales transgnicos que contengan genes selectos. De ah se deduce que la
clonacin ofrece una enorme oportunidad para la ganancia gentica, el incremento
en la eficiencia de la produccin de alimentos de origen animal y los programas de
investigacin (Singla y col 1997).

- Aspectos comerciales de la clonacin de embriones. Cuando la clonacin se

aplica a los embriones de alto valor, la habilidad para producir varios nacimientos
por cada embrin ofrece suficiente ventaja econmica para recuperar los costos
involucrados, sobre todo si se utilizan procedimientos de sexado de embriones, de
manera que los nacimientos de individuos clonados sean de sexo predeterminado.
Esto pondra un limite en el nmero de embriones de sexo masculino transferidos,
lo cual reducira el nmero de transferencias requeridas o permitira obtener una
poblacin de pie de cra efectiva con el mismo nmero total de transferencias
(Nicholas 1983). Sin embargo, la eficiencia con la que se cuenta actualmente an
no permite una produccin de embriones en masa a un costo accesible para la
produccin de animales comerciales (Singla y col 1997). Es necesario que se
incrementen significativamente las tasas de xito para que el mercado de los
embriones clonados pueda hacerse realidad. Actualmente en el mundo existe un
laboratorio que ofrece la clonacin de embriones por transferencia nuclear, a la
cual los ganaderos pueden enviar sus embriones para recibir clones por 100
dlares cada uno (Romo 1994).

Otra limitante es que los pesos de los individuos clonados al nacimiento son
anormales. Estos procedimientos dan lugar a una mayor incidencia de distocias,
aunque posterior al nacimiento las tasas de crecimiento no se afectan por este
procedimiento. No se conoce explicacin biolgica sobre este aspecto (Singla y
col 1997). Es necesario incrementar la eficiencia de este procedimiento para
eliminar el problema de gigantismo fetal que se ha encontrado en algunos
becerros producidos por transferencia nuclear (Roma 1994). En ovinos no se ha
observado alteracin en los pesos al nacimiento de los individuos clonados, pero
s un alargamiento en la duracin de la gestacin que es influenciado por el
genotipo fetal (Wilmut y col 1997).

Es clara la necesidad de investigacin bsica, utilizando especies de las que se

tenga un conocimiento adecuado para los fines de la investigacin. Este tipo de
estrategias, por su accesibilidad y bajo costo, podran ser llevadas a cabo en
animales de laboratorio, explorando mas la tcnica en los mbitos celular y
molecular, de manera que la solucin a los problemas de las tasas de gestacin y
pesos al nacimiento podra obtenerse de los experimentos a partir de estas
especies (Singla y col 1997).
72
- Aplicacin de la clonacin en la conservacin de especies. La reciente
demostracin de la capacidad para clonar mamferos adultos, ha propiciado una
variedad de nuevas ideas de investigacin para los interesados en las especies en
peligro de extincin.

La clonacin tiene el potencial de minimizar la prdida de recursos genticos, al

igual que rescatar la prdida de material gentico; por lo que permitira expandir el
nmero de tasas incluidos en los programas de supervivencia de especies, porque
hara posible la criopreservacin de embriones clonados; aunque habra que
pensar con cuidado, en las especies animales que podran ser utilizadas como las
receptoras de los embriones de especies en peligro de extincin que vayan a ser
clonados, y considerando: que los tipos de placentacin son diferentes para cada
especie; que la transferencia embrionaria interespecfica slo funciona en las
especies en las que es posible crear hbridos; que hay especies silvestres que no
se reproducen en cautiverio, y tambin que el comportamiento materno de las
hembras receptoras hacia las cras nacidas a partir de embriones clonados de
especies no homlogas a ellas, podra afectar la supervivencia de los clones,
etctera (Ryder 1997).

El grupo Lanza et al. (2000) efectuaron la primera clonacin de una especie en

peligro de extincin: un gaur asitico a quien llamaron No, obtenido por la
transferencia de ncleos utilizando clulas de piel (fibroblastos) de gaur macho y
ovocito enucleado de vaca domstica, y cuyo embrin reconstituido fue transferido
en una vaca domstica. Actualmente esperan el nacimiento del gaur clonado y
sealan que estn en planes de ser clonadas especies tales como el antlope
bongo, el tigre de Sumatra y el panda gigante. Asimismo, se cuenta con clulas
preservadas de una especie ya extinta, la cabra bucardo de montaa, de Espaa,
en la que se esta pensando aplicar la clonacin.

Consideraciones ticas de la clonacin. Hasta ahora se ha hablado sobre

algunas consideraciones que deben ser cuidadosamente estudiadas con respecto
ala clonacin de animales, tanto para el abasto como para la conservacin de
especies en peligro de extincin; queda solamente mencionar las probables
consecuencias que esta tcnica tendra si fuera aplicada a los seres humanos.

En 1984 McLaren consideraba que la transferencia nuclear podra ser aplicada en

los seres humanos; sealaba que para las parejas que tuvieran el riesgo de
transmitir defectos genticos a su progenie, si se recuperaran varios ovocitos de
una mujer, se enuclearan y se les transfiriera un ncleo de la MCI de alguno de
sus propios embriones; unos cuantos podran ser congelados mientras que los
remanentes genticamente idnticos podran ser evaluados para defectos
genticos por anlisis cromosmico, anlisis de ADN 0 por mtodos bioqumicos.

73
De esta forma se asegurara a la pareja que cualquier embrin transferido al tero
materno del stock que fuera congelado, estara libre de defectos genticos.

A este respecto existen opiniones tanto en favor como en contra. Por ejemplo, en
1997 el Consejo Biotico de Estados Unidos de Amrica (Nacional Bioethics
Advisory Comisin 1997), seal la preocupacin existente acerca del posible
dao fsico provocado por la manipulacin del ovocito, ncleo y embriones, as
como del dao psicolgico en cuanto al sentido de la individualidad y la autonoma
personal de los individuos clonados. Mencionan la preocupacin tica sobre la
degradacin de la calidad de la familia y el parentesco en el caso de que los
padres quisieran tener un control excesivo sobre las caractersticas de sus hijos.

Lisker y Tapia (1997) opinan que la clonacin de embriones humanos tendra

utilidad en la investigacin siempre y cuando los embriones no fueran implantados
en el tero de mujeres, y que tuviera la finalidad de incrementar el conocimiento
en biologa celular y los mecanismos de expresin gentica, ya que no deben
ponerse obstculos al avance en la investigacin cientfica. Aunque hacen
hincapi en la importancia de discutir y resolver todos los problemas ticos y
legales que plantea la clonacin de nuestra especie.

A finales del 2000 las autoridades inglesas aceptaron la aplicacin de la clonacin

por transferencia nuclear en humanos, pero con una temporalidad finita de solo 2
semanas y con una idea de aplicacin exclusiva para la obtencin de tejidos que
puedan ser utilizados para transplante. Una alternativa en este sentido es la
estrategia definida por los trabajos de Onishi et al. (2000), y de Polajaeva et al.
(2000) en los cuales se obtuvieron cerdos clonados por transferencia nuclear y
cuya similitud en cuanto a tamao de rganos y capacidades de aspecto
inmunolgico son muy similares a la de los humanos.

Hottois (1998) considera que se le est dando mayor prioridad alas reacciones
simblicas de la clonacin que al anlisis de sus tcnicas. Opina que no hay razn
para enjuiciar la clonacin, ya que desde el punto de vista de una pareja con
problemas de esterilidad total, 0 que hayan perdido a un hijo, 0 de una pareja en la
que ambos cargan genes letales, la clonacin no implicara la reproduccin en
masa de clones sino de tan solo uno 0 quizs dos, y que ello no afectara la
autonoma de los clones. Adems, recuerda que la identidad biolgica entre los
clones, y entre ellos y su donador no sera total, ya que existen diferencias ligadas
al ADN mitocondrial (que permanece en los ovocitos receptores) y alas la
seleccin natural, son reintegrados al juego con lo que eventualmente pueden
obtenerse individuos en cuyos embarazos se manifiesten nuevamente estos
genes letales.

Por otro lado, Bryan (1998) trata de aproximar el que sera el sentir de los
humanos como individuos clonados con el de los gemelos monocigticos que
nacen de manera natural. Explica que en virtud de que an cuando estos ltimos
74
son idnticos genticamente, siempre hay uno que nace primero que el otro y que,
por 10 tanto los medios uterino y extrauterino influyen para producir no solo
apariencias sino tambin personalidades diferentes en cada uno. En el aspecto
psicolgico, seala como ventaja que los gemelos monocigticos tienen facilidad
para relacionarse y comprenderse mutuamente dada su identidad biolgica; pero
como desventajas, que tienen mayores riesgos de nacer prematuramente 0 de
tener altas tasas de muerte perinatal.

Por ltimo, Edwards y Beard (1998) sealan que la biseccin 0 separacin de

embriones y la transferencia nuclear actualmente aplicadas en animales, podran
considerarse para su aplicacin en humanos en la prxima dcada

75
 3. METODOLOGIA

Revisin de literatura.
Revisin de antecedentes investigativos o de trabajos realizados sobre el tema
en nuestro pas.
Revisin de antecedentes investigativos internacionales, as como de
organismos de referencia.
Consulta a travs de revistas de investigacin o publicaciones cientficas del
tema.
Consulta en bases de datos y bibliotecas internacionales acerca de temas o
informacin relacionada.
Envi de e-mails a investigadores internacionales que han trabajado sobre el
tema, para as realizar una recopilacin de informacin importante.
Elaboracin de un proyecto de investigacin tipo monografa en donde se
plasme toda la informacin obtenida y se realice una descripcin clara y
precisa de la fecundacin, produccin y del desarrollo embrionario como el de
la transferencia de embriones en reproduccin y produccin porcina que esta
siendo implementada a nivel experimental en el continente Europeo.

76
 4. IMPACTO ESPERADO

Esta monografa aportara elementos bsicos e indispensables como base para el

desarrollo e implementacin de nuevos trabajos investigativos, as como, ser una
fuente de informacin para los sistemas de produccin porcina en donde se
pretende dar a conocer la existencia de nuevas biotecnologas reproductivas y
productivas viables que pueden llegar a ser una solucin a los problemas de tipo
gentico y reproductivos que estn presentando hoy en da nuestros sistemas
Porccolas en el pas.

77
 7. CONCLUSIONES

La combinacin de las tecnologas anteriormente nombradas (produccin in Vitro

de embriones, transgnesis y clonacin) hacen posible actualmente realizar
modificaciones genticas muy precisas en el genoma del animal y han contribuido
a incrementar la eficiencia del proceso de generacin de animales transgnicos
como clonados de granja. Aunque en una primera etapa las modificaciones
genticas afectarn solamente a genes simples, a medida que la tecnologa
avance y se haga ms eficiente es posible vislumbrar un mayor rango de
modificaciones que irn desde cambios en unos pocos pares de bases hasta la
reingeniera de grandes segmentos cromosmicos. Muchas aplicaciones
requerirn de modificaciones genticas mltiples, lo que puede significar un
problema para los animales de granja dado su largo perodo generacional. Por lo
tanto, el real desafo ser desarrollar clulas que mantengan su capacidad de
totipotencialidad para transferencia nuclear despus de mltiples eventos de
recombinacin homloga.

Esto permitir realizar ms de una modificacin gentica en el animal y acortar el

tiempo necesario para establecer estos cambios al estado de homocigosis.
Aunque por el momento muchas de las aplicaciones de esta tecnologa estn
orientadas principalmente a la industria farmacutica, es posible vislumbrar que
rasgos tan complejos de manipular como una mayor eficiencia en la conversin de
alimentos y la resistencia a enfermedades, entre otras, sern ms fcilmente
abordadas gracias a esta tecnologa.

Por lo tanto, el inters que despierta la tecnologa de la reproduccin, tanto en el

rea de la medicina como en la industria porcina, aumenta el afn por el desarrollo
de nuevas tecnologas as como la puesta en marcha de las existentes. Sin
embargo, aunque la clonacion, transgenesis y la produccin in Vitro de embriones
a partir de ovocitos madurados, fecundados y cultivados in Vitro es hoy una
realidad, el rendimiento de estas tcnicas es todava inapropiado para obtener los
beneficios anteriormente mencionados pero al iniciar con los primeros peldaos a
nivel investigativo de estos temas, podemos dar comienzo a una secuencia de
investigaciones experimentales a nivel nacional que pueden aportar grandes
hallazgos y resultados para la medicina veterinaria, la medicina humana, adems
de contar con las garantas de obtener siempre el propsito que busca el
productor, un sistema optimo, que le brinde los mejores resultados en cuanto
produccin y productividad, sin afectar la rentabilidad, sostenibilidad y
sustentabilidad del sistema.

Es claro y evidente que el uso de biotecnologas y sobre todo estos dos tipos de
tcnicas en la produccin porcina son prcticamente unos trminos nuevos, en

78
comparacin con la implementacin de tcnicas como la IA, la cual se ha usado
desde hace muchos aos, debemos tener en cuenta que la implementacin de
nuevas tecnologas, empiezan y parten de una idea, y es as como surgi la de IA,
ahora el gran salto que esta dando en estos tiempos la ingeniera gentica nos da
pinceladas del futuro; de un futuro que podemos tomar en las manos en busca de
nuevas repuestas y soluciones a las nuevas problemticas mundiales que nos
afectan a todos; es claro que la implementacin de estas biotecnologas
representan altos costos de produccin, pero a medida de las investigaciones y de
los resultados que estas aporten van a dar respuesta y luz a su uso masivo y
mundial por ser alternativas productivas y mundiales y a su vez a optimizar el
rendimiento y rentabilidad de los sistemas productivos porcinos, es ahora donde
debemos aportar nuestro grano de arena a la investigacin, para que en futuro
podamos cosechar los frutos de nuestros esfuerzos.

79
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