Examen de Mtodos de Separacin convocatoria de Julio 2017

Preguntas de respuesta Larga

1 Explica el funcionamiento de todas las partes de un cromatgrafo lquido equipado con una
bomba cuaternaria y un detector de diodos array.

Primero hablaremos del sistema de impulsin de la fase mvil la cual se hacen en por medio de
un sistema de bombeo. Existen varios tipos, pero hablaremos en este caso de un sistema de
bombas cuaternarias. Una bomba cuaternaria est diseada con dos mbolos y dos canales para
el flujo de la fase mvil. La mezcla de disolventes se lleva acabo a baja presin, posee adems
un sistema de desgasificacin a vaco. EL lquido embotellado circula hacia el desgasificador y de
ah pasa a la vlvula de entrada, el funcionamiento de la bomba consiste en un primer embolo
que se mueve dos veces ms rpido que el segundo permitiendo que el disolvente que entre
por la parte inferior, ascienda por el mismo de forma rpida. El lquido se mantiene en un
reservorio amortiguador con un volumen determinado a la espera de que la segunda bomba
ms lenta que la primera se retraiga permitiendo la entrada del fluido al sistema de la columna.
Este tipo de bombas permite la mezcla de hasta cuatro disolventes diferentes, pudiendo usar
dos polaridades distintas adems de un disolvente tampn o un disolvente de derivatizacin.

Otro de las partes ms importantes de un sistema de HPLC es el sistema de inyeccin de la

muestra el cual se suele hacer principalmente haciendo uso de una vlvula, esta ha de cumplir
una serie de requisitos:
Requisitos de la vlvula

Fcil de operar
Preciso
Soportar altas presiones
No interrumpir el caudal

Para ello la vlvula se carga con la muestra y haciendo uso de una palanca adicionamos al
flujo la muestra de forma rpida para evitar fluctuaciones en el flujo de la fase mvil. Este
tipo de tcnicas tambin puede llevar un sistema de inyeccin de muestra automatizado, lo
que proporciona una mejor precisin.

Pre-columna

Es una pequea columna con una composicin similar a la de la columna cromatogrfica,

sirve para eliminar materia en suspensin y componentes de la muestra que se pueden fijar
a la columna de forma irreversible (Ej: protenas). Aumenta la vida media de la columna

Columna

Se puede usar columnas de varios tipos en dnde tenemos columnas convencionales de

unos 10-30 cm de largo con un dimetro de 4-10 mm, o micro columnas. Siendo estas de 3-
7 cm de largo, de 1-4 mm de dimetro interno y con partculas de 3-5 micras. Estas se
rellenan de principalmente de silica, almina o polmeros. Que pueden ser rellenadas de
forma pelicular o de relleno de partculas

Detector

El detector mide una propiedad del disolvente que es la cantidad de radiacin que es capaz
de absorber como puede una medida espectroscpica de UV-V con un detector de diodos
array. El sistema funciona pasando una radiacin por la fase mvil que sale de la columna y
dispersada por una red de difraccin que permite transformar la radiacin en todas sus
longitudes de onda siendo detectadas por una matriz de diodos. Este tipo de deteccin
ofrece una mejor respuesta que la espectroscopia UV-V pero se pierde en sensibilidad

2 Explica el esquema y el funcionamiento de los detectores de ionizacin de llama y de

nitrgeno-fosforo haciendo hincapi en sus similitudes y diferencias.

Detector de Ionizacin de Llama Detector de Nitrgeno-Fosforo

El detector de ionizacin de llama o FID es de respuesta universal y selectivo a los enlaces C-H,
el gas procedente de la columna se quema en una cmara con exceso de aire. Encima de la llama
se encuentra un colector polarizado con forma cilndrica que tiene como fin recoger los iones
generados. Midindose la corriente inica que se establece entre la punta del quemador y el
electrodo colector. Ofrece una alta sensibilidad, sencillez, pero es un detector destructivo.

El detector de nitrgeno-fosforo contiene una sal de metales alcalinos a la llama de ionizacin,

aumentando la respuesta de este hacia determinados elementos (fosforo, nitrgeno, azufre).
Este tipo de detector funciona igual que el citado con anterioridad con la diferencia de que
responde a compuestos orgnicos con grupos que contengan nitrgeno o fosforo de forma
selectiva. Este tipo de detectores es tedioso de usar ya que hay que estar cambiando la perla de
metales alcalinos de vez en cuando. El mecanismo de deteccin en ambos detectores es similar
la mayor diferencia reside en la introduccin de la perla alcalina en el caso del detector de
Nitrgeno-Fosforo.

3 Explicar el fundamento y la utilidad de la supresin qumica en la cromatografa inica.

Poner un ejemplo.

La supresin qumica es una tcnica que consiste en el intercambio de los cationes del eluato y
de la muestra, por especies que produzca una respuesta conductimetrica. Se usa principalmente
para muestras que contengan aniones, haciendo uso de una columna con intercambiadores en
forma cida. La tcnica consiste en reducir la conductividad del eluyente haciendo que esta
forma una especie o especies neutras:

Esta tcnica mejora enormemente los lmites de deteccin principalmente en especies aninicas
tanto de naturaleza inorgnica como orgnica. Un ejemplo seria la determinacin de cloruros
en muestras de NaCl en agua.

Preguntas de respuesta corta

1 En la ecuacin de resolucin propuesta por la teora de platos, indicar el significado de cada

uno de los tres parmetros y el concepto qumico con el que estn relacionados.

El nmero de platos tericos nos indica el nmero de equilibrios que se producen en la

separacin, de modo que un aumento del mismo produce una mayor resolucin. El factor de
selectividad depende de la naturaleza de la fase mvil y la fase estacionaria ya que estos
dependen de las constantes de equilibrios de los compuestos a separar debido a la interaccin
de estos con la fase mvil y la fase estacionaria. El factor de retencin k depende principalmente
del tiempo de retencin de los analitos durante el anlisis, este parmetro a su vez depende las
caractersticas de la columna y de la velocidad de la fase mvil.

2 uniones en el sistema HPLC. Materiales, requisitos y problemas.

Debido a la presencia de volmenes muertos los cuales originan perdidas en la eficacia del
sistema y consecuencia en la separacin. Las conducciones han de poseer un dimetro interno
pequeo y evitar longitudes largas de tubos. Los tubos han de estar hechos de un material inerte
frente a la fase mvil, ser inoxidables e inerte a la sustancia a separar. Se suelen usar
principalmente de titanio o de materiales sintticos o polmeros. Las conexiones son de dos
tipos, las que se usan para unir tubo a tubo del mismo dimetro y las que sirve para adecuar el
dimetro de un tubo al del otro. Estas han de cumplir una caracterstica simple, que este bien
encajadas para evitar la formacin de volmenes muertos.

3 Caractersticas y propiedades de una Precolumna en HPLC

Es una pequea columna con una composicin similar a la de la columna cromatogrfica, sirve
para eliminar materia en suspensin y componentes de la muestra que se pueden fijar a la
columna de forma irreversible (Ej: protenas). Aumenta la vida media de la columna

4 Explicar el orden de elucin en cromatografa de exclusin segn las propiedades de las

molculas.

En cromatografa de exclusin molecular la prioridad en la elucin viene marcada por el tamao

de las molculas. Los poros de la columna tienen el tamao suficiente para que entren aquellas
molculas ms pequeas retrasndose en la elucin pasando primero las molculas grandes las
cuales no entran en los poros. Por ello se dice que los poros excluyen a las molculas de soluto
mayores.

5 Entre que valores ha de moverse las constantes de equilibrio en cromatografa de afinidad

y que pasa cuando no estn dentro del rango.

La constante de afinidad ha de estar en torno a valores de 10^-4 y 10^-8 en disolucin a valores

por encima de 10^-4 los ligandos son demasiado dbiles para secuestrar al analito y por debajo
de los 10^-8 son demasiado fuertes y es difcil de romper el enlace sin producir una inactivacin
del ligando o del analito.

6 Em que influye el punto isoelctrico de una protena cuando se quiere separar usando
cromatografa de intercambio inico.

El punto isoelctrico de una protena es el pH al que una protena posee carga neta cero, por
ello si variramos el pH podramos tener la protena con todos sus sustituyentes en forma
catinica o en forma aninica. De modo que es un parmetro interesante en cromatografa de
intercambio inico ya que con dicha tcnica podemos determinar protenas haciendo uso de
esta propiedad.
 7 indicar las mejoras del HPLC frente a la cromatografa plana clsica.

Son varias las mejoras que presenta la cromatografa lquida frente a la cromatografa plana
estas son las siguientes:

La separacin es ms rpida en HPLC que en columna debido a una mayor velocidad de

fase mvil y a una mejor separacin de la columna.
HPLC permite el uso de un gradiente de elucin variando los volmenes de fase mvil
para mejorar la separacin y aumentar la velocidad del anlisis.
Posibilidad de variar la polaridad del disolvente durante el proceso analtico
Uso de sistema de deteccin capaces de detectar y cuantificar los analitos de una
muestra de forma inmediata y sin el uso de reveladores especficos.

Preguntas de Prcticas

1 En la preparacin de la muestra para determinacin de cafena el procedimiento es el

siguiente: Se hace la extraccin en agua caliente de 3,0923 g de hojas de t. El extracto se
enraza en matraz de 250 ml. A partir del matraz, se filtra convenientemente sobre un vial y se
toman 50 L que se colocan en otro vial y se aaden 950 L de fase mvil. Se determina por
HPLC y se obtiene a partir del calibrado analtico una concentracin de 7,28 mg/L. Expresar el
resultado en dos formatos: a) mg/g b/ %
1
a) 7.28 mg/L 1000
= 0.00728 = 0.00728

b) 7.28 mg/L % % = 10000

%
7.28 ppm 10000 = 0.000728 %

2 Te dan dos grficas, una con un calibrado externo y otra con un calibrado interno y los
errores tpicos de cada uno:

A vs ppm ( C. externo) A vs ppm (C.Interno)

2.5
500000 y = 0.4299x + 0.06
y = 87266x - 33906 R = 1
2
400000 R = 0.9317

300000 1.5

200000 1

100000 0.5
0
0
0 1 2 3 4 5 6
0 1 2 3 4 5 6

S y/x= 43151,8 S y/x= 0.005

 a) Comentar los parmetros, cul de los dos calibrados obtenidos es el ms adecuado
para la cuantificacin
El ms adecuado sera el calibrado con el patrn interno, ya que posee el mejor valor de
R^2 prximo a 1 y un error tpico pequeo. En comparacin con los valores y la recta
obtenida por la de calibrado externo. Al usar el patrn interno se han eliminado los
errores sistemticos que pudieron aparecer durante el anlisis.
b) En dos muestras analizadas en el mismo cromatgrafo y mismas condiciones se han
obtenido valores de rea.
+ Muestra 1: rea 4640 para 3 metil butanol, rea para Estndar interno 3156
+Muestra 2: rea 78963 para 3 metil butanol, rea para estndar interno 3119

Cul es la concentracin de 3-metilbutanol en la muestra analizada?

4640 1.470.06
Muestra 1 3156 = 0.4299
= 3.28
78963 24.680.06
Muestra 2 = = 57.28
3199 0.4299

3 Cromatografa de vidrio

a) Cul es el parmetro seguido, y en funcin de que se mide?

El parmetro que se sigue es la altura del analito atreves de la columna en funcin del
tiempo.

b) Comportamiento de dichos parmetros y como se miden

Ha medida que el ancho aumenta el tiempo de elucin aumenta de la misma manera,
para medir cada parmetro se usa un metro y un cronometro.

c) Para que se usa la ltima medida

La ltima medida se usa para determinar en nmero de platos tericos

d) Que parmetro se puede medir con ella

La altura de plato terico

4 Cromatografa de Gases

a) Que variacin se realiza en el horno de la columna

En el horno se establece una variacin de la temperatura, la cual se puede trabajar de
forma isocrtica (T Fija) o en rampa o gradiente de temperatura

b) Que compuestos y que analitos se usan para el desarrollo de la practica

Usamos distintos tipos de alcoholes para el calibrado y una disolucin 60:40 de
agua/etanol.

c) Se utiliza patrn interno, cual es

Como patrn interno se usa el isobutanol
 d) Que parmetros se cambian en las condiciones del detector
En esta tcnica no es necesario variar ningn parmetro del detector

e) Que modalidad de inyeccin se ensaya y cul es la ms adecuada

Se usa dos tipos de inyecciones una con el Split cerrado y otra con el Split abierto, dada
la practica la mejor opcin es usar el Split abierto ya que la concentracin de los analitos
es alta. El uso del Split cerrado dara lugar a una saturacin del cromatograma dando
lugar a unas bandas sin definicin.

5 HPLC

a) Sistema de inyeccin
El sistema de inyeccin usado es un sistema por vlvulas en la que se inyecta la muestra
haciendo uso de una jeringuilla Hamilton. Las vlvulas se cargan con la fase mvil usada,
al aadir la muestra y accionar la palanca de inyeccin la muestra se mezcla con la fase
mvil y pasando la mezcla a la columna

b) Que parmetros se optimizan en la practica

La polaridad de la fase mvil
El gradiente de fase mvil
Las longitudes de ondas del detector de UV-V

c) Que componentes se analizan

Se analizan tres de las bases xanticas ms importantes que contiene el t, la cafena, la
teobromina y la teofilina.

d) Se usa patrn interno? Cual es

En esta tcnica no se hace uso de patrn interno

e) Sistema de purificacin de la muestra? Cual es

Se hace uso de una extraccin en fase slida (SPE) con una columna C18