TCNICAS BSICAS Y HERRAMIENTAS UTILIZADAS POR LA GENTICA MOLECULAR

HUMANA

UNIVERSIDAD NACIONAL
PEDRO RUIZ GALLO
MEDICINA HUMANA
TCNICAS BSICAS Y
HERRAMIENTAS UTILIZADAS POR
LA GENTICA MOLECULAR HUMANA

ASIGNATURA : GENTICA HUMANA

DOCENTE : Dr. JORGE L. ORTIZ MILLONES

INTEGRANTES :
NAZARIO PREZ LUIS
NIO MALDONADO MARIO ENRIQUE
ODAR CASTILLO ESTRELLITA
PRISCILA MAHDILEY
PEA CARLO JUNIOR ANDR
PREZ GRANDEZ JHONELL WILLSON
PUICN SUREZ JACQUELINE
BETSABE

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I. INTRODUCCIN:
Antes de los aos 1980, encontrar el genotipo de un individuo por lo
general implicaba varios ensayos de laboratorio para un producto
gnico - la protena o la enzima. Los casos de los grupos sanguneos de
Rhesus y ABO son los ejemplos clsicos de como uno deduce genotipos
de la reaccin de productos gnicos con ciertos productos qumicos. A
mediados de 1980, la tecnologa gentica dio un gran salto en la historia
con la capacidad de hacer que el genotipo permanezca estable por s
mismo para ser estudiado. El genetista ahora podra examinar el ADN
directamente sin examinar el proceso laborioso de ensayos que se
desarrollan para descubrir diferencias individuales de protenas y
enzimas. El anlisis de ADN directo tena la remota ventaja de ser capaz
de identificar alelos en las secciones de ADN que no cifr para cadenas
de polipptido.

Como consecuencia de estos nuevos avances, el nmero de los lugares

genticos que podran ser descubiertos aumentaron exponencialmente
y pronto condujo a la identificacin de los genes para los desrdenes
que haban dejado un misterio para la mayor parte de este siglo. En el
presente seminario, las tcnicas principales moleculares son perfiladas.
Su objetivo principal es proporcionar una referencia rpida y
comprensible para el cientfico social. El contenido de este seminario
puede ayudar a entender la gentica, lo que los genes son, o como ellos
se relacionan con el comportamiento humano.
Los objetos sealados ayudaran al lector interesado en la ciencia de
laboratorio a entender las tcnicas bsicas sin necesidad de que se
remita a manuales contemporneos sobre la gentica molecular.
Comencemos ahora definiendo una serie de instrumentos bsicos y
tcnicas.

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II. OBJETIVOS:

OBJETIVO GENERAL:
- Explicar tcnicas bsicas y herramientas utilizadas por
la gentica humana.

OBJETIVOS ESPECFICOS:
- Describir e interpretar la tcnica del ADN recombinante.
- Explicar y esquematizar el proceso de la tcnica del ADN
recombinante.
- Definir y relacionar los trminos; enzimas de restriccin,
vectores, genoteca, etc.
- Conocer la secuencia completa de un genoma, secuencias
de fragmentos individuales de ADN, como plsmidos
bacterianos o ADN copiado en la PCR.

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III. ADN RECOMBINANTE:

Los experimentos clsicos en biologa molecular fueron sorprendentemente
exitosos en el desarrollo de nuestros conceptos fundamentales de la naturaleza y la
expresin de los genes. Dado que estos estudios se basaron principalmente en el
anlisis gentico, su xito dependi en gran medida de la eleccin de organismos
simples, de rpida replicacin (como las bacterias y los virus) como modelos. No
estaba claro, sin embargo, cmo estos principios fundamentales podran extenderse
para proporcionar una comprensin molecular de las complejidades de las clulas
eucariotas, ya que los genomas de la mayora de los eucariotas (por ejemplo, el
genoma humano) son hasta mil veces ms complejos que los de E coli. A principios
de los aos setenta, la posibilidad de estudiar tales genomas a nivel molecular
pareca desalentadora. En particular, no pareca haber ninguna manera en la que los
genes individuales podran ser aislados y estudiados.

Este obstculo para el progreso de la biologa molecular fue superado por el

desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante, que proporcion a los cientficos
la capacidad de aislar, secuenciar y manipular genes individuales derivados de
cualquier tipo de clula. La aplicacin de ADN recombinante ha permitido estudios
moleculares detallados de la estructura y funcin de genes eucariticos,
revolucionando as nuestra comprensin de la biologa celular.

3.1 ENDONUCLEASA DE RESTRICCIN:

El primer paso en el desarrollo de la tecnologa de ADN recombinante fue la

caracterizacin de endonucleasas de restriccin-enzimas que escinden ADN en
secuencias especficas. Estas enzimas se identificaron en bacterias, donde
aparentemente proporcionan una defensa contra la entrada de ADN extrao (por
ejemplo, de un virus) en la clula. Las bacterias tienen una variedad de
endonucleasas de restriccin que escinden ADN en ms de cien sitios de
reconocimiento distintos, cada uno de los cuales consiste en una secuencia
especfica de cuatro a ocho pares de bases

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Sitios de reconocimiento de endonucleasas restrictivas representativas.

a* Las enzimas se nombran de acuerdo con su especie de aislamiento, seguido por un nmero
para distinguir diferentes enzimas aisladas del mismo organismo (por ejemplo, HpaI y HpaII).
b* Los sitios de reconocimiento muestran la secuencia de una sola hebra de ADN bicatenario.
"N" representa cualquier base.

3.2 SITIOS DE RECONOCIMIENTO DE ENDONUCLEASAS

RESTRICTIVAS REPRESENTATIVAS:

Dado que las endonucleasas de restriccin digieren el ADN en secuencias

especficas, pueden usarse para escindir una molcula de ADN en sitios nicos. Por
ejemplo, la endonucleasa de restriccin EcoRI reconoce la secuencia GAATTC de seis
bases de par. Esta secuencia est presente en cinco sitios en el ADN del bacterifago
, por lo que EcoRI digiere el ADN en seis fragmentos que van desde 3,6 a 21,2
kilobases de longitud (1 kilobase, o kb = 1.000 pares de bases).

Estos fragmentos pueden separarse segn el tamao mediante electroforesis en gel,

un mtodo comn en el que se separan las molculas basndose en las velocidades
de su migracin en un campo elctrico. Un gel, habitualmente formado a partir de
agarosa o poliacrilamida, se coloca entre dos compartimentos de tampn que
contienen electrodos.

La muestra (por ejemplo, la mezcla de fragmentos de ADN a analizar) se pipetea a

continuacin en ranuras preformadas en el gel y el campo elctrico se enciende. Los
cidos nucleicos estn cargados negativamente (debido a su esqueleto de fosfato),

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por lo que migran hacia el electrodo positivo. El gel acta como un tamiz, retardando
selectivamente el movimiento de las molculas ms grandes. Por lo tanto, las
molculas ms pequeas se mueven a travs del gel ms rpidamente, permitiendo
separar una mezcla de cidos nucleicos en base al tamao.

Digestin con EcoRI y electroforesis en gel de ADN \ lambda.

Digestin con EcoRI y electroforesis en gel de DNA

EcoRI escinde el ADN de en cinco sitios (flechas), produciendo seis fragmentos de ADN. Estos
fragmentos se separan luego por electroforesis en un gel de agarosa. Los fragmentos de ADN
migran hacia el electrodo positivo, con fragmentos ms pequeos movindose ms
rpidamente a travs del gel. Despus de la electroforesis, el ADN se tie con un tinte
fluorescente y se fotografa. Se indican los tamaos de fragmentos de ADN.

Adems del tamao, el orden de los fragmentos de restriccin puede determinarse

por una diversidad de mtodos, obtenindose (por ejemplo) un mapa de los sitios
EcoRI en de ADN. Las ubicaciones de sitios de escisin para mltiples
endonucleasas de restriccin diferentes se pueden usar para generar mapas de
restriccin detallados de molculas de ADN, tales como genomas virales. Adems, se
pueden aislar fragmentos de ADN individuales producidos por digestin con
endonucleasas de restriccin despus de la electroforesis para estudio adicional,
incluyendo la determinacin de su secuencia de ADN. Los ADN de muchos virus se
han caracterizado por este enfoque.

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Modelos de restriccin de ADN de y adenovirus Las ubicaciones de los sitios de escisin para
BamHI, EcoRI y HindIII se muestran en los ADN del bacterifago de E. coli (48,5 kb) y del
adenovirus humano 2 (35,9 kb).

Sin embargo, la digestin por endonucleasa de restriccin sola, no proporciona

suficiente resolucin para el anlisis de molculas de ADN ms grandes, tales como
genomas celulares. Una endonucleasa de restriccin con un sitio de reconocimiento
de seis pares de bases (tal como EcoRI) escinde ADN con una frecuencia estadstica
de una vez cada 4096 pares de bases (1/46). Por lo tanto, se esperara que una
molcula del tamao de ADN \ alpha (48,5 kb) produjera aproximadamente diez
fragmentos EcoRI, consistentes con los resultados ilustrados en la figura.

Sin embargo, la digestin por endonucleasa de restriccin de genomas ms grandes

produce resultados muy diferentes. Por ejemplo, el genoma humano tiene
aproximadamente 3 x 106 kb de longitud y por lo tanto se espera que produzca ms
de 500.000 fragmentos EcoRI. Un nmero tan grande de fragmentos no se pueden
separar unos de otros, por lo que la electroforesis en gel de agarosa de ADN humano
digerido con EcoRI produce un frotis continuo en lugar de un patrn discreto de
fragmentos de ADN.

Debido a que es imposible aislar fragmentos de restriccin individuales de tales

digeridos, la digestin con endonucleasas de restriccin por s sola no produce una
fuente de ADN homogneo adecuada para un anlisis posterior. Sin embargo, las
cantidades de tales fragmentos de ADN purificados pueden obtenerse mediante
clonacin molecular.

3.3 GENERACIN DE MOLCULAS DE ADN RECOMBINANTE:

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La estrategia bsica en la clonacin molecular es

insertar un fragmento de ADN de inters (por ejemplo,
un segmento de ADN humano) en una molcula de
ADN (denominada vector) que es capaz de replicacin
independiente en una clula husped. El resultado es
una molcula recombinante o clon molecular,
compuesto por el inserto de ADN unido a secuencias
de ADN vector. Pueden obtenerse grandes cantidades
del ADN insertado si la molcula recombinante se deja
replicar en un husped apropiado. Por ejemplo, se
pueden clonar fragmentos de ADN humano en
vectores bacterifagos .

Estas molculas recombinantes se pueden introducir

entonces en E. coli, donde se replican eficientemente
para producir millones de fagos de progenie que
contienen el inserto de ADN humano. El ADN de estos
fagos puede entonces aislarse, produciendo grandes
cantidades de molculas recombinantes que
contienen un solo fragmento de ADN humano.
Mientras que este fragmento podra representar una
parte en 100.000 de ADN genmico humano,
representa aproximadamente una parte en 10
despus de ser clonado en el vector . Adems, el
fragmento puede aislarse fcilmente del resto del ADN
vector mediante digestin con endonucleasas de
restriccin y electroforesis en gel, permitiendo que un
fragmento puro de ADN humano sea analizado y
manipulado adicionalmente.

Se inserta un fragmento de ADN humano en un vector de ADN \ lambda. La molcula

recombinante resultante se introduce entonces en E. coli, donde se replica para producir un
fago de progenie recombinante que contiene el inserto de ADN humano.

Los fragmentos de ADN utilizados para crear molculas recombinantes suelen

generarse por digestin con endonucleasas de restriccin. Muchas de estas enzimas
escinden sus secuencias de reconocimiento en sitios escalonados, dejando colas
colgantes o cohesivas de una sola cadena que pueden asociarse entre s mediante
apareamiento complementario de bases. La asociacin entre dichos extremos
complementarios pareados puede establecerse permanentemente mediante el
tratamiento con ADN ligasa, una enzima que sella las rupturas en las cadenas de
ADN. Por lo tanto, dos fragmentos diferentes de ADN (por ejemplo, un inserto de
ADN humano y un vector de ADN ) preparados por digestin con la misma

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endonucleasa de restriccin pueden unirse fcilmente para crear una molcula de

ADN recombinante.

3.4 UNIN DE MOLCULAS DE ADN

Los ADN vectoriales y de inserto se digieren con una endonucleasa de restriccin

(tal como EcoRI), que se escinde en sitios escalonados dejando colas colgantes
colgantes. Los ADN vector y de inserto pueden asociarse entonces mediante
apareamiento de bases complementarias, y la unin covalente de las cadenas de
ADN por ADN ligasa produce una molcula recombinante.

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Los fragmentos de ADN que pueden ser clonados no se limitan a los que terminan
en sitios de escisin de endonucleasas de restriccin. Los "enlazadores" de ADN
sinttico que contienen una variedad de
sitios de endonucleasa de restriccin
pueden aadirse a los extremos romos de
cualquier fragmento de ADN. Los
enlazadores son oligonucletidos cortos que
se pueden obtener fcilmente por sntesis
qumica, permitiendo que prcticamente
cualquier fragmento de ADN se prepare para
la ligacin a un vector.

No slo el ADN, sino tambin las secuencias

de ARN pueden ser clonados. El primer paso
es sintetizar una copia de ADN del ARN
usando la enzima transcriptasa inversa. El
producto de ADN (denominado ADNc
porque es complementario al ARN utilizado
como molde) puede ligarse entonces al ADN
vectorial como ya se ha descrito. Dado que
los genes eucariticos son normalmente
interrumpidos por secuencias no
codificantes, que se eliminan del ARNm por
empalme, la capacidad de clonar cDNA, as
como el ADN genmico ha sido crtico para
la comprensin de la estructura del gen y la
funcin.

3.5 VECTORES PARA ADN RECOMBINANTE

Dependiendo del tamao del inserto de ADN y el propsito del experimento, se
pueden usar muchos tipos diferentes de vectores de clonacin para la generacin de
molculas recombinantes. Los vectores de bacterifago se usan frecuentemente
para el aislamiento inicial de clones genmicos o de cDNA de clulas eucariotas.

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En vectores de clonacin , las secuencias del genoma del bacterifago que son
prescindibles para la replicacin del virus se han eliminado y se han sustituido por
sitios de restriccin nicos para la insercin de ADN clonado. Los insertos de ADN
pueden ser tan grandes como aproximadamente 15 kb y todava producir un
genoma recombinante que puede ser empaquetado en partculas de fago. Para aislar
clones genmicos de ADN humano, por ejemplo, se ligan fragmentos al azar de ADN
humano con un tamao medio de aproximadamente 15 kb a brazos de vector .
Estas molculas de ADN recombinante pueden entonces ser empaquetadas
eficazmente en partculas de fago mezclando ADN con protenas (llamados
extractos de envasado) in vitro. Las partculas de fago se utilizan entonces para
infectar cultivos de E. coli. Dado que cada fago recombinante forma una sola placa,
pueden aislarse recombinantes que llevan insertos nicos de ADN humano. Adems,
los fagos recombinantes que contienen genes particulares de inters pueden
identificarse mediante hibridacin de cido nucleico u otros mtodos de cribado,
como se discute en la siguiente seccin.

3.6 VECTORES PLASMDICOS

Los vectores plasmdicos permiten una manipulacin ms fcil de las secuencias de
ADN clonadas que los vectores de fagos. Los plsmidos son pequeas molculas de
ADN circulares que pueden replicarse independientemente, sin estar asociadas con
el ADN cromosmico, en las bacterias. Todo lo que se requiere en el ADN plasmdico
es un origen de replicacin, la secuencia de ADN que seala la ADN polimerasa de la

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clula husped para replicar la molcula de ADN. Adems, los vectores plasmdicos
portan genes que confieren resistencia a antibiticos (por ejemplo, resistencia a
ampicilina), de manera que se pueden seleccionar bacterias que portan los
plsmidos. Los vectores plasmdicos consisten usualmente de slo 2 a 4 kb de ADN,
en contraste con los 30 a 45 kb de ADN fago presentes en vectores , facilitando el
anlisis de un fragmento de ADN insertado.

3.7 CLONACIN EN VECTORES PLASMDICOS

El vector es una pequea molcula circular que contiene un origen de replicacin

(ori), un gen que confiere resistencia a la ampicilina (Ampr) y un sitio de restriccin
(por ejemplo, EcoRI) que puede usarse para insertar ADN extrao. El ADN de
insercin se liga al vector, y los plsmidos recombinantes se usan para transformar
E. coli. Las bacterias se siembran en un medio que contiene ampicilina, de modo que
slo las bacterias que son resistentes a la ampicilina porque llevan ADN plasmdico
son capaces de formar colonias. Las colonias individuales de bacterias que contienen
plsmido pueden aislarse y crecer en grandes cantidades para el aislamiento de
plsmidos recombinantes

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Para ser clonado en un vector plasmdico, se liga un fragmento del ADN inserto a un
sitio de restriccin apropiado en
el vector y la molcula
recombinante se utiliza para
transformar E. coli. Se
seleccionan las colonias
resistentes a los antibiticos,
que contienen ADN plasmdico.
Dichas bacterias que contienen
plsmido se pueden cultivar
entonces en grandes cantidades
y su ADN se extrae. Las
pequeas molculas circulares
de ADN plasmdico, de las cuales
a menudo hay cientos de copias
por clula, pueden separarse del
ADN cromosmico bacteriano;
el resultado es ADN de plsmido
purificado que es adecuado para
el anlisis del inserto clonado.
Para algunos estudios que
implican el anlisis del ADN
genmico, es deseable clonar
fragmentos an mayores de
ADN que los acomodados por
vectores . Para este propsito
se pueden utilizar vectores de
cromosomas artificiales de
cosmticos y levaduras (YAC).
Los vectores cosmdicos (figura
3.23) alojan insertos de aproximadamente 45 kb. Estos vectores contienen
secuencias de bacterifagos que permiten un envasado eficaz del ADN clonado en
las partculas de fago. Adems, los csmidos contienen orgenes de replicacin y los
genes de resistencia a los antibiticos que son caractersticos de los plsmidos, por
lo que son capaces de replicarse como plsmidos en las clulas bacterianas. Incluso
fragmentos ms grandes de ADN (cientos de kilobases) pueden clonarse en vectores
YAC, que se replican como cromosomas en clulas de levadura.

3.8 CLONACIN EN VECTORES CSMIDOS

Un csmido es un plsmido que contiene sitios cos, que permiten que el ADN se
empaqueta en partculas de fago . Se ligan fragmentos grandes de inserto de ADN

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(aproximadamente 45 kb) a un sitio de clonacin (por ejemplo, BamHI) para

producir molculas de aproximadamente el tamao del genoma (48,5 kb), que es
apropiado para incorporacin en partculas de fago. Las molculas recombinantes
se hacen lineales (de manera que un sitio cos est presente en cada extremo), se
envasan en fagos y se usan para infectar E. coli. El ADN cosmdico se vuelve circular
de nuevo dentro de las bacterias infectadas, produciendo molculas que se replican
como plsmidos y confieren resistencia a la ampicilina a las clulas infectadas.

3.9 EXPRESIN DE GENES CLONADOS

Adems de permitir la determinacin de las secuencias de nucletidos de genes y,

por tanto, de las secuencias de aminocidos de sus productos proteicos, la clonacin
molecular ha proporcionado nuevos enfoques para obtener grandes cantidades de
protenas para caracterizacin estructural y funcional. Muchas protenas de inters
estn presentes slo a niveles bajos en clulas eucariotas y por lo tanto no pueden
purificarse en cantidades significativas mediante tcnicas bioqumicas
convencionales. Dado un gen clonado, sin embargo, este problema se puede resolver
mediante la ingeniera de vectores que conducen a altos niveles de expresin gnica
en clulas bacterianas o eucariotas.

Para expresar un gen eucariota en E. coli, el cDNA de inters se clona en un vector

de plsmido o fago (denominado vector de expresin) que contiene secuencias que
impulsan la transcripcin y la traduccin del gen insertado en clulas bacterianas.
Los genes insertados a menudo pueden expresarse en niveles lo suficientemente
altos como para que la protena codificada por el gen clonado corresponda a un 10%
de la protena bacteriana total. La purificacin de la protena codificada por el gen
clonado en cantidades adecuadas para estudios bioqumicos o estructurales
detallados es entonces una cuestin directa.

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Expresin de genes clonados en bacterias Los vectores de expresin contienen

secuencias promotoras (pro) que dirigen la transcripcin del ADN insertado en
bacterias y secuencias requeridas para la unin de ARNm a ribosomas bacterianos
(secuencias de Shine-Delgarno [SD]). Un cDNA eucaritico insertado adyacente a
estas secuencias puede expresarse eficazmente en E. coli, dando como resultado la
produccin de protenas eucariotas en bacterias transformadas.
Con frecuencia es til expresar niveles altos de un gen clonado en clulas eucariotas,
en lugar de en bacterias. Este modo de expresin puede ser importante, por ejemplo,
para asegurar que las modificaciones postraduccionales de la protena (tales como
la adicin de carbohidratos o lpidos) ocurren normalmente. Tal expresin de
protena en clulas eucariotas se puede conseguir, como en E. coli, mediante la
insercin del gen clonado en un vector (normalmente derivado de un virus) que
dirige la expresin gnica de alto nivel. Un sistema frecuentemente utilizado para la
expresin de protenas en clulas eucariotas es la infeccin de clulas de insecto por
vectores de baculovirus, que dirigen niveles muy altos de expresin de genes
insertados en lugar de una protena estructural viral. Alternativamente, se pueden
lograr altos niveles de expresin de protenas usando vectores apropiados en
clulas de mamfero. La expresin de genes clonados en levadura es particularmente
til porque se pueden emplear mtodos sencillos de gentica de levaduras para
identificar protenas que interactan con otras protenas clonadas o con secuencias
de ADN especficas.

La clonacin molecular permite que los fragmentos de ADN individuales se

propaguen en bacterias y se aslan en grandes cantidades. Un mtodo alternativo
para aislar grandes cantidades de una sola molcula de ADN es la reaccin en cadena
de polimerasa (PCR), que fue desarrollada por Kary Mullis en 1988. Siempre que se
conozca alguna secuencia de la molcula de ADN, la PCR puede conseguir una
amplificacin sorprendente de ADN va reacciones realizadas enteramente in vitro.
Esencialmente, la ADN polimerasa se usa para replicacin repetida de un segmento
definido de ADN. El nmero de molculas de ADN aumenta exponencialmente,
duplicando con cada ronda de replicacin, por lo que una cantidad sustancial de
ADN se puede obtener a partir de un pequeo nmero de copias plantilla inicial. Por
ejemplo, una nica molcula de ADN amplificada a travs de 30 ciclos de replicacin
tericamente producira 230 (aproximadamente 1 billn) de molculas de progenie.
Las molculas de ADN individuales pueden amplificarse de este modo para producir
cantidades fcilmente detectables de ADN que pueden aislarse mediante clonacin
molecular o analizarse adicionalmente directamente mediante digestin con
endonucleasas de restriccin o secuenciacin de nucletidos.

IV. ANLISIS DE CIDOS NUCLEICOS:

- SOUTHERN BLOT: El mtodo tipo Southern o Southern blot fue
desarrollado por E. M. Southern para la deteccin de genes especficos en el

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ADN celular. El ADN es digerido con una enzima de restriccin y los

fragmentos son separados por tamaos mediante una electroforesis en un
gel. Se realiza tincin con bromuro de etilo para comprobar la calidad de la
electroforesis y del ADN. A continuacin los fragmentos de ADN de doble
cadena son parcialmente hidrolizados con un cido dbil y desnaturalizados
con NaOH para permitir la transferencia. Posteriormente, el ADN es
transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda
representada una rplica de la disposicin de los fragmentos de ADN
presentes en el gel. A continuacin el filtro se incuba durante un tiempo con
la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la
incubacin la sonda se va hibridando a las molculas de ADN de cadena
sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al
fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una
forma sencilla mediante una exposicin a una pelcula de rayos X para el caso
de sondas radiactivas o con una pelcula sensible a la luz, para el caso de
sondas con fluorocromo.

PASOS DEL SOUTHERN BLOT:

1. EXTRACCIN DEL ADN:

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN
en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una vctima muerta,
clulas del folculo capilar y saliva. El ADN extrado de las pruebas del delito
("indicios" o "vestigios" biolgicos) se compara con el extrado de muestras de
referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.

2. DIGESTIN DEL ADN CON UNA ENDONUCLEASA DE RESTRICCIN:

El ADN extrado de la muestra se trata con una endonucleasa de restriccin, que es
una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia
caracterstica. La enzima que se usa ms frecuentemente para el anlisis legal es Hae
III, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.

3. ELECTROFORSIS EN GEL DE ADN:

Tras la digestin del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan segn su
tamao mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las
molculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al
avanzar las molculas de ADN, su velocidad de migracin se ve reducida por la
matriz del gel de agarosa. Las molculas menores se mueven ms deprisa a travs
de los poros del gel que las de mayor tamao. Como resultado, se produce una
separacin continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamao, de modo
que los fragmentos ms pequeos avanzan la mayor distancia con referencia al
origen o punto de aplicacin de la muestra.

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4. PREPARACIN DE UN ENSAYO DE SOUTHERN ("Southern blot"):

Tras la electroforesis, las molculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras
permanecen en el gel de agarosa, impregnando ste con una disolucin alcalina. Tras
la neutralizacin de sta, el ADN monocatenario resultante se transfiere a la
superficie de una membrana de nailon, realizando as una copia o "calco" (la
traduccin ms literal del ingls blot, conservando este sentido, es "secante"). Este
proceso de desnaturalizacin y transferencia se conoce como mtodo de Southern
en recuerdo de quien lo invent, Edward Southern. Al igual que la aplicacin de un
secante a un papel con la tinta hmeda transfiere una rplica de la imagen del papel
al secante, el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la
distribucin espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado
de la electroforesis.

5. HIBRIDACIN CON SONDA RADIOACTIVA:

Una sonda de locus nico es una molcula pequea de ADN o ARN capaz de hibridar
(es decir, de formar un dplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento
de restriccin concreto en el ensayo de Southern. La formacin de la molcula
bicatenaria (dplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre
las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". Las sondas de locus nico
se marcan habitualmente con un istopo radiactivo para facilitar su deteccin, y se
eligen para que detecten un locus gentico polimrfico en un solo cromosoma
humano. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolucin
que contiene una sonda radiactiva de locus nico, bajo condiciones de temperatura
y concentracin de sales que favorezcan la hibridacin. Tras producirse sta, se lava
el exceso de sonda no unido, de modo que la nica radiactividad que quede en la
membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.

6. DETECCIN DE LOS RFLPs MEDIANTE AUTORRADIOGRAFA:

Las posiciones de hibridacin de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo
de Southern se detectan mediante autorradiografa. En esta tcnica, la membrana de
nailon se coloca, una vez lavada, junto a una pelcula de rayos X dentro de una caja
que las asle de la luz. La pelcula registra las posiciones donde hay desintegracin
radiactiva. Tras su exposicin y el revelado fotogrfico, el registro resultante de la
hibridacin de Southern se conoce como autorradiografa.

7. REENSAYAR EL RESULTADO DEL SOUTHERN CON SONDAS ADICIONALES:

En un anlisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios
cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografa para la primera
sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolucin a elevada temperatura, que
deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a
un locus diferente. Se repiten as las etapas 5-7, detectando cada vez un locus
diferente. El grupo de autorradiografas de una misma transferencia de Southern se
conoce como un "perfil de ADN".

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DIAGNSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES:

El Southern Blot es una tcnica que puede proveer informacin que puede ser usada
para el diagnstico molecular de algunas enfermedades gnicas, ejemplo de ellas
seran el Sndrome de Angelman, Sndrome de Prader-Willi y Sndrome X frgil. Esta
tcnica resulta ser la ms sensible para el diagnstico de algunas patologas como es
el caso del Sndrome Angelman y el Sndrome de Prader-Willi. El diagnstico
consiste en la realizacin de un test de metilacin mediante PCR por tratamiento con
bisulfito, basndose en el ADN por medio del estudio de la metilacin del locus
PW71. Otra enfermedad que tambin puede ser diagnosticada por el Southern Blot
es el Sndrome de X frgil, el uso de esta tcnica para esta enfermedad permitir
cuantificar el nmero exacto de repeticiones y metilaciones, causantes de la
enfermedad.

- NOUTHERN BLOT: Una tcnica de laboratorio que se utiliza para identificar

y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de
ADN o ARN llamado sonda.

Northern blot o anlisis Northern es bsicamente una prueba para detectar la

presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y la cual permite tambin
determinar el tamao de la trascripcin de ese ARN mensajero. El procedimiento se
hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde
un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en
particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de cido nucleico,
generalmente de cADN o rARN del gen de inters.

Procedimiento:

El procedimiento general comienza con la extraccin del ARN total de una muestra
de tejido homogeneizado. El ARNm se puede aislar mediante cromatografa para
retener solamente los ARN con colas de poli(A). Las muestras de ARN se separan
entonces mediante electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la dificultad
para que las sondas penetren en la matriz, las muestras de ARN, separadas por

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tamao tras la electroforesis, se transfieren a una membrana de nailon, bien por

capilaridad o empleando un sistema de vaco.

Los sistemas de capilaridad inica se utilizan pra transferir el ARN desde un gel de
electroforesis a una membrana de northern blot.
Una membrana de nailon cargada positivamente es el soporte ms eficaz para
realizar la hibridacin en el northern blot ya que los cidos nucleicos, que estn
cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas. El tampn
de transferencia que se usa en el ensayo suele contener formamida, dado que esta
reduce la temperatura de interaccin de las muestras, lo que evita la utilizacin de
altas temperaturas que podran degradar las molculas de ARN. Una vez que el ARN
se ha transferido a la membrana, se inmoviliza mediante enlaces
covalentes formados con la membrana, lo cual se consigue por medio de luz
ultravioleta o calor. Despus del marcaje de la sonda, sta se hibrida con el ARN en
la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y
especificidad de la hibridacin estn determinadas por las condiciones inicas, de
viscosidad, la presencia de ARN bicatenario, bases desemparejadas y composicin
de las mismas. Finalmente, la membrana debe lavarse para asegurar que la sonda se
ha unido de forma especfica y para evitar ruido de fondo en las seales emitidas por
la misma. Estas seales pueden cuantificarse mediante densitometra. Para crear
controles y poder asegurarnos de que no se estn mostrando genes que no nos
interesen se puede realizar posteriormente la determinacin empleando chips de
ADN o RT-PCR.

Las muestras de ARN se separan habitualmente en geles de agarosa que

contienen formaldehdo como agente desnaturalizante del ARN. Los geles pueden
teirse con bromuro de etidio u otro agente intercalante y se visualizan
generalmente bajo luz ultravioleta. Tambin pueden usarse geles
de poliacrilamida con urea, aunque esto suele limitarse a fragmentos de ARN
o ARNm, ya que poseen un tamao de poro ms pequeo, por lo que el ARN que
suele utilizarse no podra desplazarse por el gel. Suele utilizarse adems un patrn
de ARN con muestras de tamao conocido para poder estimar el tamao de las
muestras en estudio.

Sondas:
Las sondas para el ensayo northern estn compuestas por cidos nucleicos con una
secuencia complementaria a todo o parte del RNA que nos interesa. Pueden ser de

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DNA, RNA o oligonucletidos, con un mnimo de 25 bases complementarias para

nuestra secuencia diana. Las sondas de RNA o ribosondas que se transcriben in
vitro ayudan a prevenir el ruido de fondo. Normalmente, el DNA complementario se
sintetiza con cebadores para la secuencia RNA de inters para actuar como sonda en
el Northern blot. Las sondas requieren ser marcadas bien con istopos
radiactivos (32P) o con quimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o
con peroxidasa de rbano, las cules, tras la adicin de su sustrato especfico
producen una emisin de luz detectable. El marcaje por quimioluminiscencia puede
hacerse de dos formas: Por un lado, la sonda puede estar unida a la enzima o bien
unida a un ligando (p.ej, biotina) para la cual hay un anticuerpo
(avidinao estreptavidina en este caso) est unido a la enzima que revelar el
marcaje. Los Rayos X pueden detectar tanto las seales radioactivas como las
quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la segunda, dada
su mayor rapidez, sensibilidad y reduccin de los riesgos para la salud que conlleva
trabajar con compuestos radioactivos.

Aplicaciones:

El ensayo northern permite observar un patrn particular de expresin gentica

entre tejidos, rganos, estadios del desarrollo, niveles de estrs ambiental,
infecciones causadas por patgenos y durante el curso del tratamiento de las
mismas. Esta tcnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresin de oncogenes y
la desregulacin de genes oncosupresores en clulas cancerosas cuando son
comparadas con tejidos normales.

Los patrones de expresin obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los
genes. Desde que el RNA se separ por su tamao, las sondas contra el mismo
pueden darnos una idea de su tamao, sugerir ayuste alternativo, o motivos
repetidos en la secuencia. La variacin en el tamao del producto de un gen puede
adems indicarnos delecciones o errores en el proceso de transcripcin. Alterando
la sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar qu regin del RNA ha
sido deleccionada.

Ventajas y desventajas

El anlisis de la expresin gnica puede realizarse por diversos mtodos, como RT-
PCR, ensayos de proteccin de RNasa, chips de ADN, anlisis seriado de expresin
gnica as como el ensayo northern. Los chips de ADN son los ms utilizados y son
generalmente consistentes con los datos obtenidos por el ensayo northern. No
obstante, en ocasiones ste es capaz de detectar pequeos cambios en la expresin
de genes que los chips de ADN no pueden identificar.

Ventajas adicionales de usar el ensayo northern incluyen la capacidad de definir el

tamao de la cadena de ARN, la capacidad de observar los productos del empalme
alternativo, la posibilidad de usar sondas con homologa parcial, la habilidad de
medir el tamao y la calidad del ARN antes de realizar la inmovilizacin en la
membrana y finalmente la opcin de guardar la membrana para ser analizada en
repetidas ocasiones en el futuro.2

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Un problema comn del ensayo northern es la degradacin de la muestra por

ribonucleasas (endgenas de la muestra o a travs de contaminacin ambiental),
que puede evitarse con una apropiada esterilizacin de los materiales as como el
uso de inhibidores de RNasas como el dietilpirocarbonato.

Northern blot inverso

En esta versin alternativa del mtodo el cido nucleico que acta como sustrato
(fijo en la membrana) est formado por fragmentos aislados de ADN, mientras que
la sonda est formada por ARN obtenido de los tejidos y etiquetada con material
radioactivo.

Esta variante es ms compatible con el uso de un chip de ADN, que se ha convertido

en practica comn en la parte final de la dcada de 1990 y la primera del siglo XXI.
Ambas prcticas requieren la fijacin de fragmentos de ADN como su hibridacin
con sondas de ARN celular. De esta manera el proceso inverso, aunque inicialmente
era poco comn, permiti que el northern blot evolucionara hasta tener un lugar en
el desarrollo de los perfiles de expresin gnica.

V. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA:

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una alternativa a la
clonacin para generar muchas copias (millones o miles de millones!) de
una secuencia de inters (regin de ADN que le interesa al investigador).1
La PCR se utiliza en muchas reas de la biologa y la medicina, como la
investigacin en biologa molecular, el diagnstico mdico e incluso algunas
ramas de la ecologa.2

Componentes:
ADN replicado.
Nucletidos (bloques bsicos de ADN).
La taq polimerasa.
Los cebadores.

Cebadores para PCR

La Taq polimerasa solo puede hacer ADN si hay un cebador, una corta
secuencia de nucletidos que proporciona un punto de partida para la
sntesis de ADN.2
La Taq polimerasa
Al igual que la replicacin de ADN en un organismo, la PCR requiere
de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN
mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La ADN

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polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se

llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se
aisl (Thermus aquaticus).2

Los pasos bsicos son:

1. Desnaturalizacin (96C): la reaccin se calienta bastante para

separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los
moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.
2. Templado (55 - 65C): la reaccin se enfra para que los cebadores
puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de
ADN de cadena sencilla.
3. Extensin (72C): la temperatura de la reaccin se eleva para que
la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice as nuevas
cadenas de ADN.

Aplicaciones de la PCR

La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigacin, y tambin tiene

aplicaciones prcticas en medicina forense, pruebas genticas y
diagnsticas. Por ejemplo, la PCR se utiliza para amplificar genes
asociados con trastornos genticos a partir del ADN de los pacientes (o de
ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR tambin puede
utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de

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un paciente: si el patgeno est presente, es posible amplificar regiones de

su ADN de una muestra de sangre o tejido.

VI. SECUENCIACIN DEL ADN:

Es la determinacin de la secuencia de nucletidos que constituye cada gen. Dentro
de todas formas, el mtodo original ideado por Fred Sanger (por Fred Sanger que,
con Walter Gilbert, recibi el premio Nobel en 1980 por desarrollar la secuenciacin
de DNA). Disearon el mtodo que se conoce como el mtodo de terminacin de
cadenas o di-desoxi porque se basa en la interrupcin del proceso de extensin
de un cebador, dando lugar a cadenas de todas las posibles longitudes, puesto que
cada una ha sido interrumpida en una posicin distinta; la separacin de las cadenas
de distintos tamaos y la deteccin de qu nucletido llevan en su extremo 3 nos
permite deducir la secuencia de la molcula original.

Secuenciacin de Sanger: el mtodo por terminacin de cadena:

En el Proyecto Genoma Humano, se utiliz la secuenciacin de Sanger para
determinar las secuencias de muchos fragmentos relativamente pequeos de ADN
humano. (Estos fragmentos no necesariamente eran de 900900900 pb o menos,
pero los investigadores pudieron "recorrer" la longitud de cada fragmento con
mltiples rondas de secuenciacin de Sanger). Los fragmentos se alinearon con base
en porciones que se traslapaban para ensamblar la secuencia de regiones ms
grandes de ADN y, al final, cromosomas completos.

Ingredientes para la secuenciacin de Sanger:

La secuenciacin de Sanger consiste en hacer muchas copias de una regin blanco
de ADN. Sus ingredientes son similares a los necesarios para la replicacin del
ADN en un organismo o para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que copia
el ADN in vitro. Los ingredientes son:
Una enzima ADN polimerasa
Un cebador, que es un fragmento pequeo de ADN monocatenario que se
une al molde de ADN y acta como un "iniciador" de la polimerasa.
Los cuatro nucletidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
El molde de ADN que ser secuenciado.
Sin embargo, una reaccin de secuenciacin de Sanger tambin contiene un
ingrediente nico:
Versiones didesoxi, o terminadores de la cadena, de los cuatro nucletidos
(ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uno marcado con pigmentos de color
diferente.

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Los nucletidos didesoxi son similares a los nucletidos normales, o desoxi, pero
con una diferencia clave: no tienen grupo hidroxilo en el carbono 3' del anillo de
azcar. En un nucletido normal, el grupo hidroxilo 3' acta como un "gancho" que
permite que un nuevo nucletido se aada a una cadena existente.
Una vez que se aade a la cadena un nucletido didesoxi, ya no hay un hidroxilo
sobre el que se puedan agregar ms nucletidos. La cadena termina con el
nucletido didesoxi, que est marcado con pigmento de un color particular
dependiendo de la base (A, T, C o G) que lleve.

Mtodo de secuenciacin de Terminacin de Cadena.

El primer elemento de toda reaccin de secuenciacin es, lgicamente, el fragmento
de ADN cuya secuencia queremos leer; precisamente, este fragmento sirve como
molde para la sntesis de ADN a partir de un cebador especfico que se une a l por
complementariedad de bases, y esto es lo que nos va a permitir deducir la secuencia
de nucletidos del fragmento. Aunque inicialmente era necesario convertir el
fragmento de ADN a su forma monocatenaria, clonndolo en un tipo especial de
vectores, hoy en da puede utilizarse ADN de doble cadena, bien sea en forma de
plsmidos (cuyo inserto queremos secuenciar) o como productos de PCR. Al igual
que en el caso de la PCR, otro elemento necesario es el cebador que va a iniciar la
sntesis de ADN desde el punto donde queremos empezar a leer la secuencia del
fragmento original. Notamos que aqu slo vamos a utilizar un cebador (en vez de
dos, como en la PCR) ya que no queremos amplificar una regin, sino simplemente
sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de un punto concreto. Como toda reaccin
de sntesis de ADN, tambin es necesaria la presencia de una polimerasa de ADN que

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tenga buena procesividad y fidelidad (es decir, que no introduzca errores en la

nueva cadena). El punto clave de este mtodo de secuenciacin est en los
nucletidos libres presentes en la reaccin, que se van a ir incorporando a la nueva
cadena sintetizada por la polimerasa a partir del extremo 3 del cebador; adems de
2-desoxi-nucletidos tpicos en su forma tri-fosfato, este mtodo incorpora a la
mezcla de reaccin unos nucletidos especiales que actan como terminadores de
la sntesis. Los terminadores son nucletidos modificados qumicamente que
carecen adems del grupo hidroxilo 3 por el que crece la cadena, de ah su nombre
de di-desoxi-NTP (abreviado como ddNTP), ya que corresponden a la forma 2,3-di-
desoxi de cada nucletido tri-fosfato.
La reaccin de secuenciacin, una vez que tenemos los distintos componentes
mezclados en cantidades adecuadas, procede del siguiente modo. En primer lugar,
el fragmento a secuenciar se desnaturaliza para separar las dos cadenas y permitir
que el cebador acceda a su regin complementaria especfica. Tras permitir la
hibridacin del cebador con la cadena molde respectiva, la polimerasa comienza a
extender el cebador incorporando nucletidos complementarios a los de la cadena
molde. Como en la reaccin estn presentes desoxi-NTPs y didesoxi-NTPs, en cada
posicin es posible incorporar uno u otro. En el caso de incorporar un dNTP, la
cadena seguir extendindose normalmente, ya que el nuevo nucletido
proporciona el grupo hidroxilo 3 necesario para formar un nuevo enlace fosfo-di-
ster con el grupo fostato de un nuevo nucletido; en cambio, si el nucletido
incorporado es un ddNTP, la sntesis de la cadena terminar en esa posicin, ya que
no existe el grupo hidroxilo 3 necesario para continuar la elongacin. Lgicamente,
esto suceder para cada posicin, de modo que mientras la sntesis avanza (porque
se han incorporado dNTPs) en cada nueva posicin existe la posibilidad de que la
cadena se termine en ese punto. Al final, tendremos una coleccin de fragmentos de
todos los posibles tamaos, con una diferencia de longitud de un nucletido; cada
fragmento estar terminado por el nucletido complementario al que estaba en la
cadena molde original en esa posicin. Cuando la reaccin de secuenciacin ha sido
completada, slo nos resta separar de alguna forma todos los fragmentos de los
distintos tamaos y ver en qu nucletido est terminado cada uno de ellos, de modo
que as podremos reconstruir la secuencia original. Los mtodos para separar los
fragmentos y leer el nucletido terminal han cambiado bastante desde la
descripcin original del mtodo. Hoy en da, lo ms habitual es utilizar terminadores
marcados con algn fluorocromo especfico: se trata de ddNTPs que llevan unido un
grupo qumico que produce fluorescencia cuando es excitado por una luz de una
determinada longitud de onda. Como cada terminador lleva un fluorocromo distinto,
es fcil saber en qu nucletido termin una cadena concreta, dependiendo del tipo
de fluorescencia que produzca. Para la separacin de los fragmentos se utilizan
tcnicas de electroforesis capilar, en la que la mezcla de reaccin va pasando por
unos finos capilares que contienen una matriz porosa capaz de resolver fragmentos
de ADN que se diferencian en tamaos de tan slo un nucletido. De este modo,
cuando la reaccin de secuenciacin ya completada pasa por el capilar, los
fragmentos ms pequeos pasan ms facilmente y salen del capilar antes que los
fragmentos mayores, que tienen ms dificultad para atravesar los poros y por eso

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quedan retenidos temporalmente. El resultado es que todos los fragmentos de la

mezcla de reaccin van saliendo del capilar ordenados por tamaos, comenzando
por el ms corto, con diferencias de tamao un solo nucletido. A la salida del capilar
se sita una fuente de luz (habitualmente un lser) que excita los fluorocromos y
produce un tipo de fluorescencia especfico de cada ddNTP, lo cual es detectado por
un dispositivo especial. As, viendo el orden en que van apareciendo los cuatro
distintos colores correspondientes a los cuatro nucletidos, podemos saber la
secuencia de la cadena que se ha sintetizado, que ser exactamente la secuencia
complementaria a la cadena molde original.

VII. MICROARRAYS:
o Qu es un microarray?:

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Los microarrays de ADN son una herramienta que permite realizar anlisis
genticos diversos basados en la miniaturizacin de procesos biolgicos. Esta
tecnologa nos permite estudiar los diversos genes en conjunto, pues ante tenamos
que estudiarlo un por uno. Estos fragmentos de ADN de una sola hebra
inmovilizados en el soporte, se le denomina a menudo sondas. Los cidos nucleicos
de las muestras a analizar se marcan por diversos mtodos (enzimticos,
fluorescentes, etc.) y se incuban sobre el panel de sondas, permitiendo as la
hibridacin (reconocimiento y unin entre molculas complementarias) de
secuencias homlogas, Durante la hibridacin, las muestras de material gentico
marcadas, se unirn a sus complementarias inmovilizadas por el soporte del
microarray, permitiendo la identificacin y cuantificacin del ADN presente en la
muestra (mutaciones, patgenos etc.). Luego el escner y las herramientas
informticas nos permitirn interpretar y analizar los datos obtenidos.

o Qu tipos de microarrays existen?:

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A pesar que existen 12 tipos diversos, de ellos he aqu los ms importantes:

Microarrays del ADN: El microarray del ADN tambin se conoce como viruta del
gen, viruta del ADN, o biochip. Mide el ADN o utiliza el ADN como parte de su sistema
de deteccin. Hay cuatro diversos tipos de microarrays del ADN: microarrays del
ADNc (Sintetizado a partir de ARNm),
microarrays oligos del ADN, microarrays del
CCB y microarrays de SNP.
Microarrays de la Protena: Acta como
plataforma para la caracterizacin de cientos
de miles de protenas de una manera
altamente paralela. El microarray de la
Protena es de tres tipos, y stas son
microarrays analticos de la protena,
microarrays funcionales de la protena y los
microarrays de la protena de la reverso-fase.
Microarrays del Tejido: Los bloques de la
parafina del microarray del tejido que son
formados separando el tejido cilndrico
vacan de diversos donantes y de embutirlo en un nico microarray. Esto se utiliza
principal en patologa.
Microarrays Celulares: Tambin se llaman los microarrays de la transfeccin o los
vivir-clula-microarrays, y se utilizan para revisar la substancia qumica en grande
y bibliotecas genmicas y sistemticamente investigar el microambiente celular
local.
o Aplicaciones de los microarrays:
Tienen muchas aplicaciones que se basa en 3:
El anlisis del nivel de expresin gnica, el patrn de expresin gnica de un gen
proporciona informacin indirecta acerca de su funcin. Si llegamos a caracterizar
las secuencias homlogas de una familia gnica, as como los procesos que
desencadenan la expresin selectiva de sus genes, podremos disear frmacos que
activen dicha expresin de manera especfica, bajando as los efectos secundarios.
Deteccin del nmero de copias del ADN, similar a la tcnica de hibridacin
genmica comparada (CGH), se han diseado microarrays para detectar ganancias
o prdidas allicas en miles de secuencias, lo que per- mite obtener mapas
cromosmicos mucho ms detallados que la CGH tradicional. Estas tcnicas tienen
inters potencial en el estudio del pronstico de tumores, ya que ste se halla
asociado al nivel de dao genmico. Tambin puede ser til para detectar nuevos
oncogenes y genes supresores de tumores.
Aplicacin farmacogenmica, la respuesta dada por cada paciente hacia un
frmaco est intrnsecamente ligada a las caractersticas genticas del paciente ,
moduladas por factores fisiolgicos, patolgicos y ambientales. Por lo que las

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expresiones tpicas implicadas en la accin de un frmaco o el metabolismo, puede

manifestarse como una terapia extra a la misma. La informacin obtenida de
relacionar el perfil gentico en respuesta de cada paciente a un frmaco
determinado; con estos resultados se utiliza para disear los arrays de ADN que
puedan ser utilizados en la seleccin de tratamientos ms eficaces para minimizar
los efectos secundarios en el paciente.

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VI. CONCLUSIONES:

- Se explicaron las tcnicas bsicas y herramientas utilizadas por la gentica

molecular humana.
- Se describi la tcnica del ADN recombinante.
- Se esquematiz y explic mediante ilustraciones grficas el proceso de la
tcnica del ADN recombinante.
- Se defini y relacion los trminos: enzimas de restriccin, vectores,
genoteca, etc.
- Se determin que es posible conocer la secuencia de nucletidos usando
distintos mtodos como el de Sanger, aunque en la actualidad se han
diseado metodologas ms rpidas y baratas, en dispositivos especializados
que permuten determinar las secuencias de un fragmento en segundos.

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VII. BIBLIOGRAFA:
- Novo FJ. Gentica Humana: Conceptos, mecanismos y aplicaciones de la
Gentica en el campo de la Biomedicina. 1 edicin. Madrid: Pearson
Educacin S.A. , 2007.
- Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA):
Sinauer Associates; 2000. Recombinant DNA.
- Nussbaum RL, McInnes RR, and Willard HF. Thompsom & Thompsom:
Gentica en medicina. 7ma edicin. Madrid: Elsevier Masson, 2008.

VIII. LINKOGRAFA:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9950/
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-
technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-
reaction-pcr

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