TUGAS ANALISIS PANGAN

Atomic Absorption Spectrometry (AAS), Spektrofotometer, Hight Performance

Liquid Chromatography (HPLC)

Oleh :

Putri Aprilliyani Lestari 143020312

JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNIK

UNIVERSITAS PASUNDAN

BANDUNG

2016
 Atomic Absorption Spektrophotometry (AAS)

Spektrofotometri Serapan Atom (SSA)

A. Teori Singkat Spektroskopi Serapan Atom (SSA)

Sejarah singkat tentang serapan atom pertama kali diamati

oleh Frounhofer, yang pada saat itu menelaah garis-garis hitam pada spektrum
matahari. Sedangkan yang memenfaatkan prinsip serapan atom pada bidang
analisis adalah seorang Australia bernama Alan Walsh di tahun 1995. Sebelum
ahli kimia banyak tergantung pada cara-cara spektrofotometrik atau metode analis
spektrografik. Beberapa cara ini yang sulit dan memakan waktu, kemudian segera
di gantikan dengan Spektroskopi Serapan Atom atau Atomic Absorption
Spectroscopy (ASS). Metode ini sangat tepat untuk analisis Zat pada konsentrasi
rendah. Teknik ini mempunyai beberapa kelebihan di bandingkan metode
spektroskopi emisi konvensional.Memang selain dengan metode serapan
atom,unsur-unsur dengan energi eksitasi dapat juga dianalisis dengan fotometri
nyala,tetapi untuk unsur-unsur dengan energi eksitasi tinggi hanya dapat
dilakukan dengan fotometri nyala Untuk analisis dengan garis spectrum resonansi
antara 400-800 nm,fotometri nyala sangat berguna sedangkan antara 200-300 nm
metode ASS lebih baik dari pada fotometri nyala.Untuk analisis kualitatif,metode
fotometri nyala lebih disukai dari ASS, karena ASS memerlukan lampu katoda
spesifik (hallow cathode). Kemonokromatisan dalam ASS merupakan sarat
utama. Dari segi biaya AAS lebih mahal dari fotometri nyala berfilter. Dapat
dikatakan bahwa metode fotometri nyala dan AAS merupakan komplomenter satu
sama lainnya.

Komponen-komponen lainnya dari sebuah spektrofotometer serapan atom

adalah konfensional sifatnya. Monokromatornya dapat tak semahal monokromator
spektrofotometer biasa yang sepadan kualitasnya, karena kurang dituntut. Satu-
satunya tuntutan adalah bahwa monokromator itu melewatkan garis resonan yang
dipilih, tanpa dibarengi garis-garis lain dalam spektrum sumber cahaya yang
timbul dari katode logam atau gas lambannya.

Metode AAS berprinsip pada absorpsi cahaya oleh atom. Atom-atom

menyerap cahaya tersebut pada panjang gelaombang tertentu, tergantung pada
sifat unsurnya. Misalkan Natrium menyerap pada 589 nm, uranium pada 358,5 nm
sedangkan kalium pada 766,5 nm. Cahaya pada gelombang ini mempunyai cukup
energi untuk mengubah tingkat elektronik suatu atom. Dengan absorpsi energi,
berarti memperoleh lebih banyak energi, suatu atom pada keadaan dasar dinaikkan
tingkat energinya ke tingkat eksitasi. Tingkat-tingkat eksitasinya pun bermacam-
macam. Misalnya unsur Na dengan nomor atom 11 mempunyai konfigurasi
elektron 1s2 2s2 2p6 3s1, tingkat dasar untuk elektron valensi 3S, artinya tidak
memiliki kelebihan energi. Elektron ini dapat tereksitasi ketingkat 3p dengan
energi 2,2 eV ataupun ketingkat 4p dengan energi 3,6 eV, masing-masing sesuai
dengan panjang gelombang sebesar 589 nm dan 330 nm. Kita dapat memilih
diantara panjang gelombang ini yang menghasilkan garis spektrum yang tajam
dan dengan intensitas maksimum, yang dikenal dengan garis resonansi. Garis-
garis lain yang bukan garis resonansi dapat berupa spektrum yang berasosiasi
dengan tingkat energi molekul, biasanya berupa pita-pita lebar ataupun garis tidak
berasal dari eksitasi tingkat dasar yang disebabkan proses atomisasinya.

B. Pengertian Atomic Absorption Spectrometry

Atomic Absorption Spectrophotometry (AAS) atau Spektrofotometri

Serapan Atom (SSA) adalah salah satu jenis analisa spektrofometri dimana dasar
pengukurannya adalah pengukuran serapan suatu sinar oleh suatu atom, sinar
yang tidak diserap, diteruskan dan diubah menjadi sinyal listrik yang terukur.
AAS pertama kali diperkenalkan oleh Welsh (Australia) pada tahun 1955. AAS
merupakan suatu metode yang populer untuk analisa logam, karena disamping
sederhana, ia juga sensitif dan selektif.

Spektrofotometri Serapan atom (AAS) adalah suatu metode analisis untuk

penentuan unsur-unsur logam dan metaloid yang berdasarkan pada penyerapan
(absorpsi) radiasi oleh atom-atom bebas unsur tersebut.

Sekitar 67 unsur telah dapat ditentukan dengan cara AAS. Banyak

penentuan unsur-unsur logam yang sebelumnya dilakukan dengan metoda
polarografi, kemudian dengan metoda spektrofotometri UV-VIS, sekarang banyak
diganti dengan metoda AAS.

Prinsip pengukuran dengan metode AAS adalah adanya absorpsi sinar UV

atau Vis oleh atom-atom logam dalam keadaan dasar yang terdapat dalam bagian
pembentuk atom. Sinar UV atau Vis yang diabsorpsi berasal dari emeisi cahaya
logam yang terdapat pada sumber energi HOLLOW CATHODE.

Sinar yang berasal dari HOLLOW CATHODE diserap oleh atom-atom

logam yang terdapat dalam nyala api, sehingga konfigurasi atom tersebut menjadi
keadaan tereksitasi. Apabila elektron kembali ke keadaan dasar GROUND
STATE maka akan mengemisikan cahayanya. Besarnya intensitas cahaya yang
diemisikan sebanding dengan konsentrasi sampel (berupa atom) yang terdapat
pada nyala api.

C. Prinsip Atomic Absorption Spectrometry

Prinsip dasar dari pengukuran secara AAS ini adalah, proses penguraian
molekul menjadi atom dengan bantuan energi dari api atau listrik. Atom yang
berada dalam keadaan dasar ini bisa menyerap sinar yang dipancarkan oleh
sumber sinar, pada tahap ini atom akan berada pada keadaan tereksitasi. Sinar
yang tidak diserap oleh atom akan diteruskan dan dipancarkan pada detektor,
kemudian diubah menjadi sinyal yang terukur. Panjang gelombang sinar
bergantung pada konfigurasi elektron dari atom sedangkan intensitasnya
bergantung pada jumlah atom dalam keadaan dasar, dengan demikian AAS dapat
digunakan baik untuk analisa kuantitatif maupun kualitatif.

Spektrofotometri serapan atom (AAS) adalah suatu metode analisis yang

didasarkan pada proses penyerapan energi radiasi oleh atom-atom yang berada
pada tingkat energi dasar (ground state).

Penyerapan tersebut menyebabkan tereksitasinya elektron dalam kulit

atom ke tingkat energi yang lebih tinggi. Keadaan ini bersifat labil, elektron akan
kembali ke tingkat energi dasar sambil mengeluarkan energi yang berbentuk
radiasi.

Dalam AAS, atom bebas berinteraksi dengan berbagai bentuk energi

seperti energi panas, energi elektromagnetik, energi kimia dan energi listrik.
Interaksi ini menimbulkan proses-proses dalam atom bebas yang menghasilkan
absorpsi dan emisi (pancaran) radiasi dan panas.

Radiasi yang dipancarkan bersifat khas karena mempunyai panjang

gelombang yang karakteristik untuk setiap atom bebas.

Adanya absorpsi atau emisi radiasi disebabkan adanya transisi elektronik

yaitu perpindahan elektron dalam atom, dari tingkat energi yang satu ke tingkat
energi yang lain.

Absorpsi radiasi terjadi apabila ada elektron yang mengabsorpsi energi

radiasi sehingga berpindah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Emisi terjadi
apabila ada elektron yang berpindah ke tingkat energi yang lebih rendah sehingga
terjadi pelepasan energi dalam bentuk radiasi.

Panjang gelombang dari radiasi yang menyebabkan eksitasi ke tingkat

eksitasi tingkat-1 disebut panjang gelombang radiasi resonansi. Radiasi ini berasal
dari unsur logam/metalloid.

Radiasi resonansi dari unsur X hanya dapat diabsorpsi oleh atom X,

sebaliknya atom X tidak dapat mengabsorpsi radiasi resonansi unsur Y. Tak ada
satu pun unsur dalam susunan berkala yang radiasi resonansinya menyamai unsur
lain.

Hal inilah yang menyebabkan metode AAS sangat spesifik dan hampir
bebas gangguan karena frekuensi radiasi yang diserap adalah karakteristik untuk
setiap unsur. Gangguan hanya akan terjadi apabila panjang radiasi resonansi dari
dua unsur yang sangat berdekatan satu sama lain.
D. Bagian-Bagian Spectrometry AAS dan fungsinya

Gambar 1. Atomic Absorption Spectrometry

Gambar 2. Bagian-bagian Atomic Absorption Spectrometry

a. Sumber radiasi resonansi

Sumber radiasi resonansi yang digunakan adalah lampu katoda berongga

(Hollow Cathode Lamp) atau Electrodeless Discharge Tube (EDT). Elektroda
lampu katoda berongga biasanya terdiri dari wolfram dan katoda berongga dilapisi
dengan unsur murni atau campuran dari unsur murni yang dikehendaki.

Tanung lampu dan jendela (window) terbuat dari silika atau kuarsa, diisi
dengan gas pengisi yang dapat menghasilkan proses ionisasi. Gas pengisi yang
biasanya digunakan ialah Ne, Ar atau He.
 Pemancaran radiasi resonansi terjadi bila kedua elektroda diberi tegangan,
arus listrik yang terjadi menimbulkan ionisasi gas-gas pengisi. Ion-ion gas yang
bermuatan positif ini menembaki atom-atom yang terdapat pada katoda yang
menyebabkan tereksitasinya atom-atom tersebut. Atom-atom yang tereksitasi ini
bersifat tidak stabil dan akan kembali ke tingkat dasar dengan melepaskan energy
eksitasinya dalam bentuk radiasi. Radiasi ini yang dilewatkan melalui atom yang
berada dalam nyala.

b. Atomizer

Atomizer terdiri atas Nebulizer (sistem pengabut), spray chamber dan

burner (sistem pembakar). Nebulizer berfungsi untuk mengubah larutan menjadi
aerosol (butir-butir kabut dengan ukuran partikel 15 20 m) dengan cara
menarik larutan melalui kapiler (akibat efek dari aliran udara) dengan pengisapan
gas bahan bakar dan oksidan, disemprotkan ke ruang pengabut. Partikel-partikel
kabut yang halus kemudian bersama-sama aliran campuran gas bahan bakar,
masuk ke dalam nyala, sedangkan titik kabut yang besar dialirkan melalui saluran
pembuangan. Spray chamber berfungsi untuk membuat campuran yang homogen
antara gas oksidan, bahan bakar dan aerosol yang mengandung contoh sebelum
memasuki burner. Burner merupakan sistem tepat terjadi atomisasi yaitu
pengubahan kabut/uap garam unsur yang akan dianalisis menjadi atom-atom
normal dalam nyala.

c. Monokromator

Setelah radiasi resonansi dari lampu katoda berongga melalui populasi

atom di dalam nyala, energy radiasi ini sebagian diserap dan sebagian lagi
diteruskan. Fraksi radiasi yang diteruskan dipisahkan dari radiasi lainnya.
Pemilihan atau pemisahan radiasi tersebut dilakukan oleh monokromator.

Monokromator berfungsi untuk memisahkan radiasi resonansi yang telah

mengalami absorpsi tersebut dari radiasi-radiasi lainnya. Radiasi lainnya berasal
dari lampu katoda berongga, gas pengisi lampu katoda berongga atau logam
pengotor dalam lampu katoda berongga. Monokromator terdiri atas sistem optik
yaitu celah, cermin dan kisi.

d. Detektor

Detektor berfungsi mengukur radiasi yang ditransmisikan oleh sampel dan

mengukur intensitas radiasi tersebut dalam bentuk energi listrik.

e. Rekorder

Sinyal listrik yang keluar dari detektor diterima oleh piranti yang dapat
menggambarkan secara otomatis kurva absorpsi.
 f. Lampu Katoda

Lampu katoda merupakan sumber cahaya pada AAS. Lampu katoda

memiliki masa pakai atau umur pemakaian selama 1000 jam. Lampu katoda pada
setiap unsur yang akan diuji berbeda-beda tergantung unsur yang akan diuji,
seperti lampu katoda Cu, hanya bisa digunakan untuk pengukuran unsur Cu.
Lampu katoda terbagi menjadi dua macam, yaitu :

Lampu Katoda Monologam : Digunakan untuk mengukur 1 unsur

Lampu Katoda Multilogam : Digunakan untuk pengukuran beberapa logam

sekaligus, hanya saja harganya lebih mahal.

Soket pada bagian lampu katoda yang hitam, yang lebih menonjol
digunakan untuk memudahkan pemasangan lampu katoda pada saat lampu
dimasukkan ke dalam soket pada AAS. Bagian yang hitam ini merupakan bagian
yang paling menonjol dari ke-empat besi lainnya.

Lampu katoda berfungsi sebagai sumber cahaya untuk memberikan energi

sehingga unsur logam yang akan diuji, akan mudah tereksitasi. Selotip
ditambahkan, agar tidak ada ruang kosong untuk keluar masuknya gas dari luar
dan keluarnya gas dari dalam, karena bila ada gas yang keluar dari dalam dapat
menyebabkan keracunan pada lingkungan sekitar.

Cara pemeliharaan lampu katoda ialah bila setelah selesai digunakan,

maka lampu dilepas dari soket pada main unit AAS, dan lampu diletakkan pada
tempat busanya di dalam kotaknya lagi, dan dus penyimpanan ditutup kembali.
Sebaiknya setelah selesai penggunaan, lamanya waktu pemakaian dicatat.

g. Tabung Gas

Tabung gas pada AAS yang digunakan merupakan tabung gas yang berisi
gas asetilen. Gas asetilen pada AAS memiliki kisaran suhu 20.000K, dan ada
juga tabung gas yang berisi gas N2O yang lebih panas dari gas asetilen, dengan
kisaran suhu 30.000K. Regulator pada tabung gas asetilen berfungsi untuk
pengaturan banyaknya gas yang akan dikeluarkan, dan gas yang berada di dalam
tabung. Spedometer pada bagian kanan regulator merupakan pengatur tekanan
yang berada di dalam tabung.

Pengujian untuk pendeteksian bocor atau tidaknya tabung gas tersebut,

yaitu dengan mendekatkan telinga ke dekat regulator gas dan diberi sedikit air,
untuk pengecekkan. Bila terdengar suara atau udara, maka menendakan bahwa
tabung gas bocor, dan ada gas yang keluar. Hal lainnya yang bisa dilakukan yaitu
dengan memberikan sedikit air sabun pada bagian atas regulator dan dilihat
apakah ada gelembung udara yang terbentuk. Bila ada, maka tabung gas tersebut
positif bocor. Sebaiknya pengecekkan kebocoran, jangan menggunakan minyak,
karena minyak akan dapat menyebabkan saluran gas tersumbat. Gas didalam
tabung dapat keluar karena disebabkan di dalam tabung pada bagian dasar tabung
berisi aseton yang dapat membuat gas akan mudah keluar, selain gas juga
memiliki tekanan.

h. Ducting

Ducting merupakan bagian cerobong asap untuk menyedot asap atau sisa
pembakaran pada AAS, yang langsung dihubungkan pada cerobong asap bagian
luar pada atap bangunan, agar asap yang dihasilkan oleh AAS, tidak berbahaya
bagi lingkungan sekitar. Asap yang dihasilkan dari pembakaran pada AAS, diolah
sedemikian rupa di dalam ducting, agar polusi yang dihasilkan tidak berbahaya.

Cara pemeliharaan ducting, yaitu dengan menutup bagian ducting secara

horizontal, agar bagian atas dapat tertutup rapat, sehingga tidak akan ada serangga
atau binatang lainnya yang dapat masuk ke dalam ducting. Karena bila ada
serangga atau binatang lainnya yang masuk ke dalam ducting , maka dapat
menyebabkan ducting tersumbat.

Penggunaan ducting yaitu, menekan bagian kecil pada ducting kearah

miring, karena bila lurus secara horizontal, menandakan ducting tertutup. Ducting
berfungsi untuk menghisap hasil pembakaran yang terjadi pada AAS, dan
mengeluarkannya melalui cerobong asap yang terhubung dengan ducting

i. Kompresor

Kompresor merupakan alat yang terpisah dengan main unit, karena alat ini
berfungsi untuk mensuplai kebutuhan udara yang akan digunakan oleh AAS, pada
waktu pembakaran atom. Kompresor memiliki 3 tombol pengatur tekanan,
dimana pada bagian yang kotak hitam merupakan tombol ON-OFF, spedo pada
bagian tengah merupakan besar kecilnya udara yang akan dikeluarkan, atau
berfungsi sebagai pengatur tekanan, sedangkan tombol yang kanan merupakan
tombol pengaturan untuk mengatur banyak/sedikitnya udara yang akan
disemprotkan ke burner. Bagian pada belakang kompresor digunakan sebagai
tempat penyimpanan udara setelah usai penggunaan AAS.

Alat ini berfungsi untuk menyaring udara dari luar, agar bersih.posisi ke
kanan, merupakan posisi terbuka, dan posisi ke kiri merupakan posisi tertutup.
Uap air yang dikeluarkan, akan memercik kencang dan dapat mengakibatkan
lantai sekitar menjadi basah, oleh karena itu sebaiknya pada saat menekan ke
kanan bagian ini, sebaiknya ditampung dengan lap, agar lantai tidak menjadi
basah dan uap air akan terserap ke lap.

j. Burner

Burner merupakan bagian paling terpenting di dalam main unit, karena

burner berfungsi sebagai tempat pancampuran gas asetilen, dan aquabides, agar
tercampur merata, dan dapat terbakar pada pemantik api secara baik dan merata.
Lobang yang berada pada burner, merupakan lobang pemantik api, dimana pada
lobang inilah awal dari proses pengatomisasian nyala api.
 Perawatan burner yaitu setelah selesai pengukuran dilakukan, selang
aspirator dimasukkan ke dalam botol yang berisi aquabides selama 15 menit, hal
ini merupakan proses pencucian pada aspirator dan burner setelah selesai
pemakaian. Selang aspirator digunakan untuk menghisap atau menyedot larutan
sampel dan standar yang akan diuji. Selang aspirator berada pada bagian selang
yang berwarna oranye di bagian kanan burner. Sedangkan selang yang kiri,
merupakan selang untuk mengalirkan gas asetilen. Logam yang akan diuji
merupakan logam yang berupa larutan dan harus dilarutkan terlebih dahulu
dengan menggunakan larutan asam nitrat pekat. Logam yang berada di dalam
larutan, akan mengalami eksitasi dari energi rendah ke energi tinggi.

Nilai eksitasi dari setiap logam memiliki nilai yang berbeda-beda. Warna
api yang dihasilkan berbeda-beda bergantung pada tingkat konsentrasi logam
yang diukur. Bila warna api merah, maka menandakan bahwa terlalu banyaknya
gas. Dan warna api paling biru, merupakan warna api yang paling baik, dan paling
panas.

k. Buangan pada AAS

Buangan pada AAS disimpan di dalam drigen dan diletakkan terpisah pada
AAS. Buangan dihubungkan dengan selang buangan yang dibuat melingkar
sedemikian rupa, agar sisa buangan sebelumnya tidak naik lagi ke atas, karena
bila hal ini terjadi dapat mematikan proses pengatomisasian nyala api pada saat
pengukuran sampel, sehingga kurva yang dihasilkan akan terlihat buruk. Tempat
wadah buangan (drigen) ditempatkan pada papan yang juga dilengkapi dengan
lampu indicator. Bila lampu indicator menyala, menandakan bahwa alat AAS atau
api pada proses pengatomisasian menyala, dan sedang berlangsungnya proses
pengatomisasian nyala api. Selain itu, papan tersebut juga berfungsi agar tempat
atau wadah buangan tidak tersenggol kaki. Bila buangan sudah penuh, isi di dalam
wadah jangan dibuat kosong, tetapi disisakan sedikit, agar tidak kering.

E. Penerapan Spektroskopi Serapan Atom (SSA) Dalam Analisis Kimia

Untuk metode serapan atom telah diterapkan pada penetapan sekitar 60

unsur, dan teknik ini merupakan alat utama dalam pengkajian yang meliputi
logam runutan dalam lingkungan dan dalam sampel biologis. Sering kali teknik
ini juga berguna dalam kasus-kasus dimana logam itu berada pada kadar yang
cukup didalam sampel itu, tetapi hanya tersediasedia sedikit sampel dalam
analisis, kadang-kadang demikianlah kasus dengan metaloprotein misalnya.
Laporan pertama mengenai peranan biologis yang penting untuk nikel didasarkan
pada penetapan dengan serapan atom bahwa enzim urease, sekurang-kurangnya
dari organisme pada dua ion nikel per molekul protein. Sering kali tahap pertama
dalam analisis sampel-sampel biologis adalah mengabukan untuk merusak bahan
organik. Pengabuan basa dengan asam nitrat dan perklorat sering kali lebih
disukai daripada pengabuan kering mengingat susut karena menguap dari unsur-
unsur runutan tertentu (pengabuan kering semata-mata adalah pemasangan sampel
dalam satu tanur untuk mengoksidasi bahan organik). Kemudian serapan atom
dilakukan terhadap larytan pengabuan basa atau terhadap larutan yang dibuat dari
residu pengabuan kering.

Segi utama serapan atom tentu saja adalah kepekaan. Dalam satu segi,
serapan atom menyolok sekali bebasnya dari gangguan. Perangkat tingkat-tingkat
energi elektronik untuk sebuah atom adalah unit untuk unsur itu. Ini berarti bahwa
tidak ada dua unsur yang memperagakan garis-garis spektral yang eksak sama
panjang gelombangnya. Sering kali terdapat garis-garis untuk satu unsur yang
sangat dekat pada beberapa garis unsur yang lain, namun biasanya untuk
menemukan suatu garis resonansi untuk suatu unsur tertentu, jika tak terdapat
gangguan spektral oleh unsur lain dalam sampel.

Gangguan utama dalam serapan atom adalah efek matriks yang

mempengaruhi proses pengatoman. Baik jauhnya disosiasi menjadi atom-atom
pada suatu temperatur tertentu maupun laju proses bergantung sekali pada
komposisi keseluruhan dari sampel. Misalnya jika suatu larutan kalsium klorida
dikabutkan dan dilarutkan partikel-partikel halus CaCl2 padat akan berdisosiasi
menghasilkan atom Ca dengan jauh lebih mudah daripada paertikel kalsium
fosfat, Ca3 (PO4)2.

Dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang dieksistensikan dengan makin

banyaknya publikasi penelitian dalam bidang spektroskopi serapan atom, tampak
bahwa tekhnik spektroskopi serapan atom masih dalam taraf penyempurnaan.
 Spektrofotometri

A. Teori Singkat Spektrofotometri

Spektrofotometri adalah suatu metode analisis yang berdasarkan pada

pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada
panjang gelombang yang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma
atau kisi difraksi dan detector vacum phototube atau tabung foton hampa. Alat
yang digunakan adalah spektrofotometer, yaitu sutu alat yang digunakan untuk
menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan
mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari
konsentrasi. Spektrometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang
gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau diabsorbsi (Harjadi, 1990).

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban

suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran
menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan
spektrofotometri (Basset, 1994).

Spektrometri UV-Vis adalah salah satu metoda analisis yang berdasarkan

pada penurunan intensitas cahaya yang diserap oleh suatu media. Berdasarkan
penurunan intensitas cahaya yang diserap oleh suatu media tergantung pada tebal
tipisnya media dan konsentrasi warna spesies yang ada pada media tersebut.
Spektrometri visible umumnya disebut kalori, oleh karena itu pembentukan warna
pada metoda ini sangat menentukan ketelitian hasil yang diperoleh. Pembentukan
warna dilakukan dengan cara penambahan pengompleks yang selektif terhadap
unsur yang ditentukan (Fatimah, 2005).

Spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya penyerapan energi

cahaya oleh suatu sistem kimia itu sebagai suatu fungsi dari panjang gelombang
radiasi, demikian pula pengukuran penyerapan yang menyendiri pada suatu
panjang gelombang tertentu (Underwood, 1986).

Spektrofotometri ini hanya terjadi bila terjadi perpindahan elektron dari

tingkat energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Perpindahan
elektron tidak diikuti oleh perubahan arah spin, hal ini dikenal dengan sebutan
tereksitasi singlet (Khopkar, 1990).

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban

suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran
menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan
spektrofotometri. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu
pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi.
Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan
dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas
untuk komponen yang berbeda (Saputra, 2009).

Salah satu contoh instrumentasi analisis yang lebih kompleks adalah

spektrofotometer UV-Vis. Alat ini banyak bermanfaat untuk penentuan
konsentrasi senyawa-senyawa yang dapat menyerap radiasi pada daerah
ultraviolet (200 400 nm) atau daerah sinar tampak (400 800 nm). Analisis ini
dapat digunakan yakni dengan penentuan absorbansi dari larutan sampel yang
diukur.

B. Pengertian Spektrofotometer

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur

absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu
pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya
tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya
yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet.
sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan
fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang
gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan
atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.
Kelebihan spektrofotometer dibandingkan fotometer adalah panjang
gelombang dari sinar putih lebih dapat terseleksi dan ini diperoleh dengan alat
pengurai seperti prisma, grating ataupun celah optis. Pada fotometer filter, sinar
dengan panjang gelombang yang diinginkan diperoleh dengan berbagai filter dari
berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang
gelombang tertentu.
Pada fotometer filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang
benar-benar monokromatis, melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-40 nm.
Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar
terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma.
Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu,
monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat
untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun
pembanding.

C. Prinsip Kerja Spektrofotometer

Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun

campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan
dipantulkan, sebagian diserap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai
yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena
memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel.
D. Bagian-bagian Spektrofotometer

Gambar 3.Spektrofotometer

Gambar 4. Bagian-bagian Spektrofotometer

Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :

a. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki
pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang
biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah
lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini
mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah 350
2200 nanometer (nm).
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya
polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu
(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).
 c. Cuvet
Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat
contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars,
plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm
dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau
plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca
mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di
daerah sinar tampak (visible).
d. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya
pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi
sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk
jarum penunjuk atau angka digital.
Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk
menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.
Spektrofotometer akan mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan
membandingkan ke intensitas cahaya sebelum melewati sampel (Io).
Rasio disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase (% T)
sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T.

E. Penerapan Spektrofotometri

Aplikasi (penerapan) yang paling umum dalam spektrofotometri dengan

memanfaatkan instrumen spektrofotometer adalah menentukan konsentrasi suatu
analit dalam larutan tertentu. Dengan mengetahui konsentrasi suatu analit dalam
larutan tertentu dimanfaatkan dalam kehidupan sehari-hari meliputi kegiatan
industri (misal : Industri tekstil |menentukan konsentrasi optimal bahan pewarna
pakaian |; Industri makanan | menentukan konsentrasi zat aditif pada makanan
dalam tinjauan keamanan konsumsi pangan |) selain itu dalam kegiatan riset (
misal: Bioteknologi dan farmasetika ).
 Hight Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

A. Dasar Teori Hight Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut
dengan HPLC (Hight Performance Liquid Chromatography ) dikembangkan pada
akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan,
bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan
KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk
analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi
senyawa-senyawa kiral.
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, High Performance Liquid
Chromatography) merupakan suatu tekhnis analisis obat yang paling cepat
berkembang. Cara ini ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan
biologi, karena sederhana dan kepekaannya tinggi.
KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-
protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat,
produk hasil samping proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan
farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan ; memurnikan
senyawa-senyawa dalam suatu campuran ; memisahkan polimer dan menentukan
distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti
jalannya reaksi sintetis.

B. Pengertian Hight Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid

chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair
yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk
memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat
tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya
merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan
beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif
antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detector serta
integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram memuat waktu
tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.
C. Prinsip Hight Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau
zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini
melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh
distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.

D. Bagian-bagian Hight Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Gambar 5. Bagian-bagian Hight Performance Liquid Chromatography

(HPLC)

1. Wadah fase gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum
menggunakan fase gerak harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada
pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat
membuat pelarut pada fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan
pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih
terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat
KCKT (HPLC grade).
2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel.
Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal
penting dalam pemilihan fase gerak.
Beberapa deret eluotropik KCKT :

Parameter
Parameter
kekuatan UV cut off
Pelarut kekuatan pelarut
pelarut (nm)
(partisi)
(adsorbsi)
n-heksana 0,01 0,1 195
Sikloheksana 0,04 -0,2 200
Tetraklorometan 0,18 1,6 265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang yang mana pada

kuvet 1 cm, pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi.
Sangat dianjurkan untuk menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak
bertepatan atau di sekitar panjang gelombang pemenggalan UV pelarut yang
digunakan sebagai fase gerak.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos alkohol.
3. Pompa
Syarat pompa yang digunakan adalah : harus inert terhadap fase
gerak.Bahan yang umumnya dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan
batu nilam. Mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit
Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat.Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan
konstan dan pompa aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum
dibandingkan dengan tekanan konstan.
4. Injektor (penyuntikan sampel)
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase
gerak yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan
keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
 Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar
sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke
kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD
0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering
digunakan untuk autosampler pada KCKT.
5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :

Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor

Tabung Stainless steel
kolom Panjang 3,10,15,20 dan 25
cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran kecil,
silika yang dimodofikasi
secara kimiawi (bonded
phase), atau polimer-
polimer stiren/divinil
benzen.Rata-rata diameter
partikel 3,5 atau 10m
dengan kisaran sempit.
Tekanan 500-3000 psi
operasional (35-215 bar
Stainless steel
Panjang 25 dan 50 cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 1 atau 2 mm
Porous, silika ukuran kecil, silika
yang dimodofikasi secara kimiawi
(bonded phase), atau polimer-
polimer stiren/divinil benzen.Rata-
rata diameter partikel 3,5 atau
10m dengan kisaran sempit.
1000-5000 psi
(70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut terklorinasi

terklorinasi atau alkohol
untuk fase normal. Untuk
fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol
atau asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir : 1-3
ml/menit
Kinerja Efisiensi meningkat dengan
bekurannya ukuran partikel
fase diam, akan tetapi umur
kolom dengan ukuran
partikel 3 m lebih pendek.
atau alkohol untuk fase normal.
Untuk fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol atau
asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir 10-100
l/menit.Modifikasi instrumen
Sistem penghantaran pelarut yang
mampu memberikan kontrol aliran
di bawah 10l/menit.Katup injeksi
sampekl bervolume kecil;sel
detektor bervolume kecil.
Sangat efisiensi dan sensitif, akan
tetapi lambat,konsumsi fase gerak
hanya dari kolom konvensional.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan
kolom konvensional, yakni :
1. Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10-100 l/menit)
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal
sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan
kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu
gugus silanol (Si-OH).
Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-
reagen yang akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-
gugus fungsional yang lain. Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase
terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-
O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu karekateristik kromatografi dan
selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C18 )merupakan fase diam paling sering
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran
yang rendah, sedang maupun tinggi.
Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor
(tailing peak) pada penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan
oleh adanya interaksi adsorbsi antara solut-solut ini dengan residu silanol dan
pengotor logam pada silika.Masalah ini dapat diatasi dengan end-chapping yakni
proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus trimetilsilil dan
menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi
(kandungan logam <1ppm)
7. Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektro spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, detektor Fluoresensi dan
elektrokimia.
 Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengoperasiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8l atau lebih kecil,
sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 l atau lebih kecil lagi.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

E. Kegunaan Hight Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa

organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian
(impurities) ; analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan
molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion ; isolasi dan pemurnian
senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan
senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak
dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif
dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. Hight Performance Liquid Chromatography

http://indonesiakimia.blogspot.co.id/2011/05/high-performance-liquid-
chromatography.html

Farzumzal. 2011. Aplikasi Spektrofotometer

http://blendedlearning.itb.ac.id/web5/index.php/forum/detail/7556

Saisal nakhdiah. 2011. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

http://nakhdiahsaisal.blogspot.co.id/2011/12/kromatografi-cair-kinerja-
tinggi- hplc.html

Toni. 2013. Makalah AAS. https://tonimpa.wordpress.com/2013/04/25/makalah-

atomic-absorption-spectroscopy-aas/

Yazhid. 2013. Makalah Spektrofotometer.

http://yazhid28bashar.blogspot.co.id/2013/04/makalah-
spektrofotometer.html