FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS

PROGRAMA DE BIOLOGIA
LABORATORIO DE BIOQUMICA

PRCTICA 3. Actividad Enzimtica Parte II

Objetivos: Comprender los principios y anlisis (clculos e grficos) involucrados en la

determinacin cualitativa y cuantitativa de la actividad enzimtica e de sus parmetros
cinticos

Estrategia:

El estudiante debe leer el contenido correspondiente a la prctica y discutirla en

grupo; en caso de dudas, solicitar al profesor las claridades necesarias.
Cuando existan dudas sobre la calidad de los resultados del experimento, este debe
ser repetido.
Los resultados del experimento deben ser analizados posteriormente mediante el
tratamiento grfico y/o estadstico correspondiente.

Experimento: Estudio del efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin

enzimtica

En este experimento el estudiante evaluar el efecto de la temperatura en la velocidad de

reaccin catalizada por la -amilasa salivar. La actividad enzimtica ser determinada por
la liberacin del azcar reductor, utilizndose el reactivo DNS, conforme al mtodo descrito
por Miller (1950). Por ese experimento, el estudiante deber obtener una curva que
relaciona la temperatura e velocidad de reaccin, determinando el rango de temperatura
ideal para la accin de esta enzima.

1. Colecta de amilasa salivar

Cada grupo realizar la colecta de saliva, a travs de un embudo con algodn, hasta
obtener aproximadamente 2mL de saliva filtrada. Es importante, que la saliva sea
mantenida en hielo durante y despus de la colecta, para evitar desnaturalizacin
trmica de la enzima;
Probar la actividad de la amilasa salivar en las concentraciones: no diluida y diluida
1:10;
Para diluir, pipetear 0,5mL de saliva filtrada y adicionar 4,5mL de la solucin salina
tamponada.
Toda la vidriera que va a ser utilizada debe limpiarse rigurosamente para reducir el
efecto de contaminantes que puedan inhibir la actividad enzimtica.

Procedimiento:
 Numerar 8 tubos conforme la instruccin de la tabla 2;
Hervir una alcuota de muestra de saliva para los controles negativos (b: blanco);
Adicionar 0,2mL de solucin de amido al 1% a cada uno de los tubos. Antes de la
adicin de la muestra de saliva a los tubos conteniendo amido, debern ser pre-
incubados por 5min en las temperaturas de 12C (Tubos 1 y B1), 25C (2 y B2),
35C (3 y B3), 65C (4 y B4)
Despus de la pre-incubacin de amido, adicionar (en los tubos en Bao de Mara)
0,1mL de la muestra de saliva, conforme a las instrucciones de la Tabla 2; para los
tubos con la marca B, adicionar 0,1mL de la muestra de saliva hervida;
Dejar reaccionar por 10min a cada una de las temperaturas y detener la reaccin
para adicionar 0,1mL del reactivo DNS, conforme a los tiempos de la tabla.
Despus de la adicin de DNS, incubar los tubos en bao de Mara hirviendo por
5min.
Esperar enfriar, adicionar 5mL de agua destilada y leer la absorbancia a 550nm. El
espectrofotmetro debe ser calibrado antes de iniciar las lecturas de absorbancia
de los ensayos enzimticos, con la solucin salina tamponada.
Anotar los valores de absorbancia para cada uno de los tubos.

Tabla 2. Efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin catalizada por la -amilasa

salivar
Tubos Adicin de Adicin de Absorbancia
n 0,1mL de 1mL de a 550nm
saliva (min) reactivo DNS
(min) (s)
1 0,0 10
B1 1,0 11
2 3,0 13
B2 5,0 15
3 7,0 17
B3 10,0 19
4 13,0 21
B4 16,0 23

Presentacin de resultados:

Obtener la media de las absorbancias para los ensayos en cada una de las
temperaturas;
Obtener la absorbancia referente a la actividad enzimtica substrayendo del valor
de la absorbancias (1, 2, 3 o 4, segn el caso), el valor de absorbancia de su control
negativo;
Utilizando la curva patrn de la dupla anterior, determinar la cantidad en mg de
azcar reductor producido para las reacciones enzimticas en cada una de las
temperaturas;
Determinar la velocidad de reaccin Vo, considerando que la velocidad de reaccin
ser dada por la cantidad de mg de azcar-reductor producida por min.
 Calcular U.mL-1 (unidades de actividad enzimtica por mL de muestra enzimtica)
Una unidad enzimtica ser dada por la cantidad de enzima necesaria para producir
0,1mg de azcar-reductor por min-1 de reaccin:
Trazar el grfico relacionando la temperatura de reaccin y la velocidad de reaccin
enzimtica.