1.

Introduccin
Los antioxidantes presentes en frutas y verduras han adquirido un gran reconocimiento
en el campo de la nutricin ya que, de acuerdo a mltiples evidencias tanto clnicas
como epidemiolgicas, su mayor consumo est fuertemente asociado a un menor riesgo
relativo de desarrollo de aquellas enfermedades que en la actualidad ms afectan a la
poblacin mundial (cardiovasculares, tumorales y neurodegenerativas).
El reconocimiento del beneficio que supone para la salud un mayor consumo de
alimentos ricos en antioxidantes ha generado, tanto entre profesionales de los sectores
salud y agro-alimentario, como entre consumidores en general.
- La actividad antioxidante es la capacidad de una sustancia para inhibir la
degradacin oxidativa ; debe distinguirse entre capacidad antioxidante y
reactividad. Mientras que la capacidad antioxidante da informacin acerca de la
duracin del efecto antioxidante, la reactividad caracteriza solo la dinmica de
inicio del efecto antioxidante a una concentracin fija de compuesto.
- Los antioxidantes en los alimentos, como la vitamina C, vitamina E, selenio y
muchos fitoqumicos pueden eliminar estos radicales libres. Existen diferentes
mtodos para medir la capacidad antioxidante de los alimentos y
fitoqumicos: Radicales de Oxgeno Capacidad de Absorcin (ORAC), de in frrico
Reduccin de la energa (FRAP) y Trolox Equivalencia capacidad antioxidante
(TEAC) entre otros.
- El mtodo ms popular es la determinacin del ORAC, que fue desarrollado por
los Institutos Nacionales de Salud, en Baltimore. El mtodo ORAC mide el efecto
inhibidor de los fitoqumicos en la oxidacin inducida de la azo-de fluorescena. La
intensidad fluorescente de la fluorescena disminuye despus de la adicin del azo-
iniciador, que acta como un generador de radicales libres. La degeneracin de la
fluorescena se reduce por la presencia de antioxidantes.

2. Capacidad antioxidante
3. Mtodo orac
Concepto
Ecuacin
Mecanismos en el mtodo ORAC
Zet
Hat
4. Comparacin de los mtodos para la determinacin de la capacidad antioxidante

La determinacin de la actividad antioxidante de los alimentos es importante para predecir

el potencial antioxidante in vitro de los mismos antes de ser ingeridos; as mismo, nos
permite determinar la proteccin frente a la oxidacin y el deterioro del alimento que
disminuye su calidad y valor nutricional.

Los mtodos de determinacin de la actividad antioxidante se basan en distintos sistemas

generadores de radicales libres. Dichos radicales reaccionaran con la muestra y en virtud de
la capacidad antioxidante de esta se inhibira la generacin de los primeros. As, lo que se
determina realmente es el efecto antioxidante ya que la actividad antioxidante no se puede
medir de forma directa. Lo ideal sera medir la actividad antioxidante de cada componente
de la muestra por separado, sin embargo, y sobre todo en el caso de muestras naturales, es
muy difcil determinar el nmero y concentracin de los compuestos antioxidantes
presentes en la muestra.
En la actualidad, debido a la complejidad de los procesos de oxidacin, no existe un mtodo
que refleje de forma completa el perfil antioxidante de una muestra, por tanto, es bueno
trabajar con varios mtodos para facilitar la comparacin e interpretacin de los resultados.
Las caractersticas ideales que debe reunir un mtodo de determinacin de capacidad
antioxidante son: sencillez, mecanismo qumico definido y punto final fijo, reproducibilidad,
adaptabilidad a sustancias antioxidantes hidroflicas y lipoflicas y elevado rendimiento de
anlisis.

Las medidas de la actividad antirradicalaria se pueden realizar mediante dos estrategias

distintas, en funcin de la informacin que se desea obtener (Snchez- Moreno, 2002):

Determinacin directa: El radical se emplea como un factor de cuantificacin (produce

una seal analtica). La adicin del antioxidante, antes o despus de la generacin del
radical, provoca una disminucin de la seal. En el ensayo de post- adicin se forma el
radical en ausencia de la muestra y as, cuando se aade la sustancia antioxidante se
produce un descenso en la seal debido a la disminucin de la concentracin del radical.
En ensayos de inhibicin, la muestra se aade a los sustratos de oxidacin antes que sea
generado el radical, La reaccin comienza con la adicin del oxidante (ABTS+, DPPH,
etc).

Determinacin indirecta: La presencia de radicales libres produce la prdida o aparicin

de un reactivo, y por tanto, en presencia de un antioxidante se provoca el aumento o
disminucin de la seal (mtodos, ORAC, FRAP, etc).

Las caractersticas ideales que debe reunir un mtodo de determinacin de capacidad

antioxidante son:

sencillez,

mecanismo qumico definido y punto final fijo,

reproducibilidad

adaptabilidad a sustancias antioxidantes hidroflicas y lipoflicas

elevado rendimiento de anlisis.

Mtodo del ABTS+ (cido 2,2-azinobis (3- etilbenzotiazoln)-6- sulfnico).

El radical ABTS+ se genera a partir de su precursor el cido 2,2-azinobis (3-

etilbenzotiazoln)-6-sulfnico (ABTS). El radical catinico obtenido es un compuesto de
color verde-azulado, estable y con un espectro de absorcin en el UV-visible.

Es un radical artificial que no mimetiza bien la situacin in vivo, termodinmicamente

puede ser reducido por compuestos que tengan un potencial redox menor que el del
ABTS (0.68V), pudiendo reaccionar con el radical, muchos compuestos fenlicos con un
potencial ms bajo. El punto final de la reaccin lo marca la sustancia antioxidante
empleada, fijando tiempos cortos o muy elevados que pueden interferir en los
resultados finales, lo cual, es un inconveniente.

La ventaja de este ensayo es que puede realizarse tanto en muestras hidrosolubles como
liposolubles, eligiendo el disolvente apropiado en cada caso.
 Existen varios mtodos de generacin del radical ABTS+:

Enzimticamente (mioglobina, peroxidasa de rbano).

Qumicamente (Dixido de manganeso, persulfato potsico, radicales peroxilo).

Electroqumicamente.

Mtodo FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power).Benzi y strain,1996; Pulido y

col; 2000

En este mtodo se determina la capacidad antioxidante de forma indirecta. Se basa en

el poder que tiene una sustancia antioxidante para reducir el Fe3+ a Fe2+ que es menos
antioxidante. El complejo frrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro es reducido
al complejo ferroso coloreado.

Se trata de un mtodo espectrofotomtrico ya que se mide la absorbancia del Fe2+. As,

cuanto ms antioxidante es la sustancia objeto de estudio, mayor es la reduccin y
mayor la concentracin de Fe2+ y ms alta la seal de absorbancia. El complejo va a
poder ser reducido por productos con potenciales redox menores a 0,7 V (potencial
redox del Fe3+ -TPTZ).

Debido a que el potencial redox del Fe3+-TPTZ es comparable con el del ABTS se pueden
analizar compuestos similares con ambos mtodos aunque las condiciones de la
reaccin sean distintas. El mecanismo del FRAP es de transferencia de electrones, a
diferencia de otros mtodos donde se produce captura de radicales libres, segn esto,
el FRAP puede ser til, en combinacin con otros mtodos, en la determinacin de la
capacidad antioxidante de productos que contengan distintos tipos de antioxidantes.

Mtodo ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity).

El fundamento del mtodo ORAC se basa en la habilidad que tienen los compuestos
antioxidantes para bloquear radicales libres por donacin de un tomo de hidrgeno:

X + AH XH + A

En este mtodo, el radical artificial AAPH (2,2-Azobis-(2-aminopropano)-

dihidrocloruro) oxida a la fluorescena de forma que esta pierde su fluorescencia. De
esta forma, las sustancias antioxidantes presentes en el extracto obtenido a partir del
alimento disminuiran dicha prdida de fluorescencia.

Medicin de la actividad antioxidante de un alimento

la medicin de la actividad antioxidante de un alimento supone la cuantificacin de

virtualmente todas las molculas antioxidantes presentes.

La mayor parte de los ensayos empleados para la determinacin de la actividad

antioxidante de un alimento se basan en la medicin de: la capacidad que tienen los
compuestos antioxidantes para reaccionar con un radical libre determinado, o el
potencial que tales compuestos tendran para reducir un complejo formado entre iones
Fe y el reactivo TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina).

Entre aquellos ensayos que se basan en la medicin de la capacidad de los antioxidantes

para reaccionar con un radical libre, cabe destacar los siguientes:
 Ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity, o Capacidad de Absorcin de
Radicales de Oxigeno).

Ensayo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, o Capacidad Antioxidante como

Equivalentes Trolox)

Ensayo DPPH (2,2,-Difenil-1-picrilhidrazil).

Existe consenso que para caracterizar la actividad antioxidante de un alimento, el

ensayo ORAC destaca entre todos los ensayos disponibles por su alta sensibilidad,
precisin y responsabilidad.

5. Descripcin del equipo

6. Mtodo orac segn autores
Equipo
Reactivos (enumerados)
Preparacin de estos
Procedimiento (escrito, diagrama de flujo, imgenes)