ANLISIS DE ANTIOXIDANTES:

QU Y CMO SE DEBEN MEDIR?

El amplio reconocimiento cientfico de que un mayor consumo de
alimentos ricos en antioxidantes redunda en claros beneficios para la
salud de la poblacin ha llevado a que los consumidores se interesen,
cada vez ms, en conocer cual es efectivamente la riqueza
antioxidante de los productos que el mercado les ofrece?

Si bien hasta hace poco la sola mencin del trmino antioxidante, sea
a travs de una campaa de promocin o inscrito en el envase de un
producto, fue suficientemente atrayente para que los consumidores se
inclinen por dicho producto, recientemente, y en forma creciente, los
consumidores buscan distinguir entre aquellos productos cuyo
marketing simplemente reclama tener antioxidantes y aquellos en
los cuales el contenido de estos compuestos es debidamente
sustentado y cuantitativamente descrito en su rotulacin.

En el marco de lo anteriormente mencionado, en la presente seccin

se aborda, entre otras, interrogantes como las siguientes: Que
Antioxidantes deben medirse en un Alimento?, Cules son los
principales ensayos y mtodos analticos disponibles para su
medicin?, Por qu es importante medir y rotular el contenido de
polifenoles y el valor ORAC en los Alimentos? Qu diferencia existe
entre medir y certificar el contenido y la actividad antioxidante de un
alimento?
Para enfrentar la interrogante Qu Antioxidantes deben medirse
en un Alimento?, es preciso responder previamente a lo siguiente:
Cules son los principales antioxidantes presentes en los
alimentos?La riqueza antioxidante de los alimentos est
generalmente dada por la suma e interaccin de numerosas molculas.
Si bien la estructura qumica de tales molculas puede ser
significativamente diferente, entre los principales antioxidantes
presentes en los alimentos es posible distinguir:
i) Las Vitaminas antioxidantes, que comprenden al Acido ascrbico
(o Vitamina C); la Vitamina E, un trmino que incluye no solo al alfa
tocoferol, sino adems, a las isoformas, alfa, beta, gama y delta, de
los tocoferoles y los tocotrienoles; y los compuestos Pro-Vitamina
A (representados por el beta-caroteno, el alfa-caroteno y la
beta- criptoxantina).
ii) Los Carotenoides, entre los cuales destacan la lutena, el licopeno,
la zeaxantina y la astaxantina. Bajo la denominacin de carotenoides
se incluyen tambin aquellos compuestos que son Pro-Vitamina A
(arriba mencionados). Desde un punto de vista qumico, los
carotenoides comprenden los carotenos (alfa-caroteno, beta-caroteno
y licopeno), que no incluyen tomos de oxgeno en su estructura, y las
xantofilas (beta-criptoxantina, lutena, astaxantina y zeaxantina), que
s lo presentan, mayormente bajo la forma de hidroxilos.
iii) Los Polifenoles. Los polifenoles dan cuenta de la riqueza
antioxidante de la parte mayor de los alimentos habitualmente
consumidos por la poblacin. Todos los polifenoles exhiben en su
estructura, a lo menos, uno o ms grupos hidroxlos unidos a un anillo
aromtico. Entre los polifenoles es posible distinguir dos tipos mayores
de compuestos: los flavonoides, para los cuales se han descrito varios
miles en el reino vegetal) y cuya estructura comprende dos anillos
aromticos unidos un heterociclo de tres tomos de carbono y uno de
oxgeno (C6-C3-C6), y los llamados no-flavonoides (algunos cientos)
que comprenden, mayormente, alcoholes mono-fenlicos, cidos
fenlicos y estilbenos.
Detallada informacin respecto a cual es la composicin antioxidante
de los principales alimentos ingeridos por la poblacin, se encuentra la
seccin Antioxidantes en alimentos: Principales fuentes y sus
contenidos.
Ahora bien, conociendo cuales son los tipos de antioxidantes que ms
predominan en un determinado alimento, es posible volver a la
interrogante de Que antioxidantes deben medirse en un
alimento? Aunque la respuesta a esta interrogante est sujeta a la
naturaleza del alimento a analizar, en trminos generales ser posible
medir en los alimentos:
(I) el contenido especfico de aquellos antioxidantes que dicho alimento
ms concentra, o la de aquellos cuya presencia es ms relevante para
su distincin como fuente o aporte de dicho compuesto; por ejemplo,
el contenido de cido ascrbico, el de alfa-tocoferol, el de licopeno, o
el de algn flavonoide en particular;

(II) el contenido total de un determinado tipo de antioxidante, por

ejemplo, el contenido total de polifenoles o el contenido total de
flavonoides presentes en un alimento;

(III) la actividad antioxidante del alimento. A diferencia de la sola

medicin del contenido de un antioxidante determinado, la medicin
de la actividad antioxidante de un alimento permite cuantificar la
capacidad que tendran todos los compuestos antioxidantes presentes
en ste (vitaminas + carotenoides + polifenoles + otros que no
responden a las categoras anteriores) para actuar simultneamente
como una mezcla de compuestos antioxidantes.

Pero entonces, Qu debe medirse?

Si se pretende realizar una caracterizacin de un alimento desde el
punto de vista de su riqueza antioxidante, idealmente se debera
cuantificar el contenido individual de cada uno de aquellos
antioxidantes que a priori se sabe que dicho alimento contiene, y se
debera medir la actividad antioxidante que -como resultado de la suma
e interaccin de sus componentes antioxidantes- dicho alimento
presenta.
Sin embargo, el propsito de medir en forma individual el contenido de
cada uno de los componentes antioxidantes de un alimento resulta
excesivamente costoso y analticamente complejo, dado que en
aquellos alimentos que son ms ricos en antioxidantes, estos
compuestos comprenden, regularmente, un gran nmero y una
enorme diversidad de estructuras.

Qu alternativa existe a la medicin del contenido individual

de cada uno de los componentes antioxidantes de un
alimento? Como alternativa a la medicin individual, se puede
cuantificar el contenido total que presenta un alimento en trminos de
un tipo determinado de antioxidantes. Por ejemplo, cuando la riqueza
antioxidante de un alimento reside mayormente en una alta presencia
de polifenoles, la medicin se acota a la caracterizacin del contenido
antioxidante bajo la forma de polifenoles totales (PFT). Si se precisa,
junto a la medicin de PFT es posible medir, en forma ms precisa, el
contenido de flavonoides totales, y an ms especfica, el contenido de
determinados subtipos de flavonoides, como seran las antocianidinas
totales, los flavonoles totales o los flavan-3-oles totales. Mayores
detalles respecto a la qumica y presencia de estos compuestos en los
alimentos se describe en la seccin Antioxidantes en alimentos:
Principales fuentes y sus contenidos.
Cmo se determina el contenido de polifenoles totales? El
contenido de PFT es determinado a travs de un ensayo que emplea el
reactivo de Folin-Ciocalteu (F-C). Todos los mtodos hasta ahora
publicados que emplean dicho reactivo miden la capacidad que tienen
los polifenoles para reducir (donar un electrn) el Mo(VI) a Mo(V)
presente en el complejo molibdotungstato que caracteriza el reactivo
de F-C. Como resultado de tal reduccin, el reactivo, de color amarillo,
adquiere un intenso color azul, el cual es cuantificado
espectrofotometricamente a 765 nm. Si bien todos los mtodos
disponibles que emplean el reactivo de F-C aseguran la oxidacin total
de todos aquellos compuestos capaces de reducirlo, stos difieren en
cuanto a las concentraciones de dicho reactivo empleadas, al tipo de
base y concentracin empleada para alcalinizar el medio (carbonato
versus hidrxido de sodio), a los tiempos de incubacin necesarios para
hacer cuantitativa la reduccin del reactivo (3-120 min), y las
temperaturas de incubacin de las muestras durante su anlisis (20-
50 C).
Cmo se expresa el contenido de polifenoles totales de una
muestra?El contenido de polifenoles totales resultante de la aplicacin
de cualesquier mtodo que se base en el uso del reactivo de Folin-
Ciocalteu es regularmente expresado como mg de equivalentes de
cido glico (EAG)/100 g de alimento. El cido glico es un compuesto
fenlico simple ampliamente empleado en este ensayo como estndar
de comparacin. Sin embargo, ocasionalmente se emplea tambin
como estndar de comparacin y expresin de resultados polifenoles
como catequina o los cidos tnico, clorognico, cafico, vanlico y
ferlico.
Para encontrar un listado completo de los valores de contenido de PFT
en frutas producidas y/o consumidas en Chile, visite nuestra seccin
Base de Datos de Antioxidantes.
Son los mtodos que emplean el reactivo de Folin-Ciocalteu
especficos para la determinacin de polifenoles? Tal como se
menciono anteriormente, en el ensayo de Folin-Ciocalteu se mide la
capacidad que tienen los polifenoles para actuar como reductores de
Mo(VI) en el complejo molibdotungstato. Si bien el ensayo de
reduccin del reactivo es simple, sensible y preciso, debe sealarse que
dicho reactivo es susceptible de ser reducido no solo por todos los
polifenoles, sino tambin por reductores como cido ascrbico,
metabisulfito de sodio, sales de hierro(II), EDTA, ciertos aminocidos,
fructosa y glucosa, entre otros. Esto ltimo es extremadamente
importante ya que cuando se aplica este mtodo a muestras que
contengan uno o ms de dichos interferentes, sin tomarse las medidas
correctivas, se obtendr equivocadamente un resultado que representa
una sobre-estimacin del valor real de polifenoles totales.
Por ejemplo, se ha visto que la aplicacin del ensayo en presencia de
fructosa (5 g/L), un azcar abundantemente presente en frutas, da
lugar a una recuperacin del contenido de cido glico (10 mg/L) que
se ve equivocadamente incrementada en alrededor de 58%.
Como resultado del efecto interferentes que tendran compuestos como
fructosa, glucosa o cido ascrbico, normalmente presentes en frutas,
verduras, y en numerosos alimentos procesados, es de enorme
importancia que, en la aplicacin de cualquier mtodo que emplea el
reactivo de F-C, se tenga presente la incorporacin de controles
adecuados, idealmente, empleando modificaciones al mtodo original
que permitan discriminar analticamente entre la contribucin que
hacen a la reduccin del dicho reactivo los polifenoles que se desea
medir y aquellos componentes interferentes no-polifenlicos
presentes en una muestra.

Que limitaciones de interpretacin supone la sola medicin de

PFT en la caracterizacin de la riqueza antioxidante de un
alimento? Si bien la medicin de PFT es ampliamente empleada y
reconocida como una forma preliminar de caracterizar la riqueza
antioxidante de un alimento, debe tenerse presente que, como tal, la
medicin de PFT no distingue la medida ni la proporcin en que los
diversos subtipos de polifenoles presentes en un alimento estn
individualmente contribuyendo al contenido polifenlico total. Dicho
ensayo tampoco evala el valor que tendra la interaccin entre los
distintos polifenoles presentes en un alimento.
No obstante, la medicin de PFT, cuando es debidamente realizada
(esto es con correccin de interferentes) constituye una aproximacin
buena, simple y prctica al propsito de caracterizar inicialmente a un
alimento en trminos de su contenido antioxidante, especialmente
cuando se trata de aquellos en los cuales los polifenoles dan
mayormente cuenta de su composicin antioxidante. Sin embargo,
cuando los polifenoles solo dan cuenta en forma parcial de la riqueza
antioxidante de un alimento, la sola medicin de los PFT como una
forma de evidenciar tal riqueza podra suponer una sub-estimacin
proporcional a la contribucin que hacen compuestos de naturaleza no-
polifenlica a la riqueza antioxidante total del alimento analizado.

Para evitar tal sub-estimacin, y dado que muchos alimentos ricos en

antioxidantes poseen no slo compuestos fenlicos, sino tambin
antioxidantes de naturaleza no-fenlica (diversas vitaminas
antioxidantes y carotenoides), es muy importante que la
caracterizacin de la riqueza antioxidante de los alimentos comprenda,
adems, la medicin de su actividad antioxidante.

Pero, realmente Qu se mide cuando se determina la actividad

antioxidante de un alimento? Lo primero a destacar es que la
medicin de la actividad antioxidante de un alimento supone la
cuantificacin de virtualmente todas las molculas antioxidantes
presentes en este.
La mayor parte de los ensayos empleados para la determinacin de la
actividad antioxidante de un alimento se basan en la medicin de: (1)
la capacidad que tienen los compuestos antioxidantes para reaccionar
con un radical libre determinado, o (2) el potencial que tales
compuestos tendran para reducir un complejo formado entre iones
Fe(III) y el reactivo TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina).
Entre aquellos ensayos que se basan en la medicin de la capacidad de
los antioxidantes para reaccionar con un radical libre, cabe destacar los
siguientes:

Ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity, o Capacidad

de Absorcin de Radicales de Oxgeno)

Ensayo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, o

Capacidad Antioxidante como Equivalentes Trolox)

Ensayo DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidrazil).

Existe consenso que para caracterizar la actividad antioxidante de un

alimento, el ensayo ORAC destaca entre todos los ensayos disponibles
por su alta sensibilidad, precisin y reproducibilidad.

Qu es el ensayo ORAC?
A diferencia de la simple medicin del contenido de los antioxidantes
presentes en un alimento, el ensayo ORAC mide la actividad o
capacidad global que tienen todos los antioxidantes presentes en una
muestra para apagar o neutralizar (scavenging) radicales peroxilo.
Estos ltimos son especies reactivas comparables y por tanto
relevantes a aquellos ROS biolgicamente generados en el organismo.
En el ensayo ORAC, los radicales peroxilo, generados a partir del azo-
compuesto AAPH o ABAP ([2,2-azobis(2-amidinopropano]),
reaccionan con fluorescena como sustrato. Como resultado de tal
reaccin, la fluorescencia de este ltimo compuesto decrece a travs
del tiempo, configurando un rea bajo la curva (fluorescencia versus
tiempo). Cuando dicha reaccin tiene lugar en presencia de
compuestos antioxidantes, el rea bajo la curva se incrementa en
forma lineal y proporcional a la concentracin de antioxidantes.

Para actuar como tal, los antioxidantes deben, donar ya sea un electrn
(SET), o un tomo de hidrgeno a los mismos (HAT) los radicales libres
que se pretende estabilizar. El ensayo ORAC mide la capacidad que
tienen todos los antioxidantes presentes en un alimento (o muestra de
este) para donar tomos de hidrgeno a los radicales peroxilo. Por
ende, el mtodo ORAC cuantifica la capacidad que tendra un alimento
para actuar como antioxidante a travs del mecanismo HAT.

El ensayo ORAC comprende la medicin del aporte que hacen a la

actividad antioxidante tanto los polifenoles como aquellos compuestos
de naturaleza no-polifenlica presentes en un alimento dado, y por
tanto permite comparar la actividad antioxidante, valor ORAC, de
alimentos que no necesariamente tienen polifenoles como sus
principales componentes con aquellos que si lo tienen. Por ejemplo, es
posible comparar el valor ORAC de un tomate (rico en licopeno pero
pobre en polifenoles) con el de una manzana (que es rica en polifenoles
pero no contiene licopeno).
 El
ensayo ORAC no slo refleja el contenido total de los compuestos
antioxidantes, sino tambin, la interaccin aditiva, sinrgica o de
potenciacin que resulta de la simultnea presencia de estos, dando
como resultado un valor que refleja la capacidad global o actividad
antioxidante de un alimento.

Cmo se expresa el valor ORAC de una muestra? El valor ORAC

se expresa como micromoles de equivalentes Trolox/100 g de
muestra. El Trolox es un anlogo de la vitamina E que, por su fcil
solubilidad en agua es empleado como estndar de comparacin.
Dado que el mtodo ORAC permite comparar alimentos de naturaleza
muy diversa en cuanto a su riqueza antioxidante, el ensayo ORAC
representa en la actualidad la forma ms empleada de evaluar la
actividad antioxidante de alimentos. Como tal, el valor ORAC
constituye el ndice ms reconocido al momento de definir el potencial
aporte que podra suponer el consumo de un alimento a la capacidad
antioxidante de nuestro organismo.

Si bien la confianza que se tiene en torno a los valores de actividad

antioxidante generados a travs del empleo del mtodo ORAC se
desprende, en gran medida, de la alta sensibilidad, precisin y
reproducibilidad del mtodo, es claro que para asegurar tales
caractersticas el ensayo debe ser ejecutado por un laboratorio que
este dotado no solo de una instrumentacin adecuada que permita su
automatizacin, sino que adems, que vele por el cumplimiento del
protocolo analtico estandarizado del mtodo.

Para encontrar un listado completo de los valores de actividad

antioxidante ORAC de frutas producidas y/o consumidas en Chile, visite
nuestra seccin Base de Datos de Antioxidantes.
En que difiere el mtodo ORAC de otros mtodos de
determinacin de la actividad antioxidante? Si bien otros
mtodos, como el TEAC y el DPPH evalan tambin la capacidad de los
antioxidantes de una muestra para apagar o neutralizar un radical
libre, tanto el TEAC como el DPPH emplean como radicales libres
molculas que difiere totalmente de cualquier radical libre o especie
reactiva generada por nuestro organismo. Mientras en el primer caso
se emplea el catin radical ABTS+, en el segundo se emplea el radical
DPPH. Si bien la alta estabilidad de ambos radicales hace ms simple
su empleo, la misma condicin sita a los mtodos TEAC y DPPH como
aproximaciones analticas muy distantes de la alta reactividad que
tpicamente caracteriza a los ROS normalmente generados en sistemas
biolgicos. Por tanto, la relevancia de estos mtodos es
frecuentemente cuestionada. Ambos mtodos suelen ser tiles para
realizar un ranking de compuestos/preparados antioxidantes dentro
de un batch, un experimento o un estudio determinado, pero, ms
all de su simpleza tcnica, la relativamente baja sensibilidad y
reproducibilidad de ambos mtodos limita la posibilidad deseable de
comparar los valores TEAC o DPPH.
Puede una igualdad de valores ORAC entre dos alimentos
distintos suponer igual valor nutricional? Es fundamental aclarar
que una eventual igualdad en el valor ORAC entre un alimento y otro
(sean stos de igual naturaleza o no), no necesariamente significa
igualdad en el valor nutricional de ambos. En efecto, este ltimo estar
dado por la presencia (contenido y tipo) de numerosos nutrientes,
entre otros, protenas, grasa, carbohidratos, vitaminas, y
micro/macrominerales.
De modo similar, una igualdad en la actividad antioxidante tampoco
permitira suponer una equivalencia en el potencial beneficio que por
concepto de ingesta de los antioxidantes presentes en dichos
alimentos, tendra para la salud humana el consumo indistinto de
estos. Como se describe en la seccin Antioxidantes y salud:
Evidencias cientficas, si bien todos los polifenoles comparten su
capacidad para actuar como antioxidantes, la existencia de an
pequeas diferencias en sus estructuras suele, a menudo, resultar en
significativas diferencias tanto en la biodisponibilidad (absorcin y
posterior disponibilidad de stos en la sangre) como en el perfil de
accin biolgica de dichos compuestos (ya que stos actan no slo
como atrapadores de radicales libres).
Por qu es importante medir y rotular el contenido de
polifenoles y el valor ORAC en los Alimentos?
En nuestro pas, advertidos de la excelente disposicin que los
consumidores tambin tienen para optar por productos en los cuales
se destaca la presencia de antioxidantes, diversas empresas
promueven activamente el consumo de productos que, aunque no
certifican su contenido y actividad antioxidante, los rotulan como ricos
en antioxidantes. Ejemplos de esto ltimo son ciertas marcas de t,
de caf y de cervezas que reclaman ser naturalmente ricas en
antioxidantes, as como ciertas marcas de aguas minerales y otras
bebidas que, tras la adicin de antioxidantes a su formulacin, son
tambin generalmente promocionadas como bebidas con
antioxidantes. De acuerdo a la opinin de expertos en el rea de
antioxidantes, para seguir avanzando con seriedad en la promocin del
consumo de alimentos ricos en antioxidantes, es esencial distinguir
entre aquellos productos cuyo marketing simplemente reclama tener
antioxidantes y aquellos en los cuales el contenido de estos es
sustentado y cuantitativamente descrito en su rotulacin.
Crecientemente, ciertos actores de la industria nacional han tomado ya
conciencia de esto ltimo, avalando a travs de anlisis independientes
el contenido y actividad antioxidante en el rtulo de algunos de sus
productos. Ejemplos de esto ltimo, son ciertos chocolates elaborados
por importantes empresas del rubro alimentario, como Costa-Carozzi
y Nestl, que por ser elaborados con un alto contenido de cacao, son
en la actualidad debida y validamente comercializados como fuentes
de antioxidantes naturales. Del mismo modo, empresas como Corpora
Tresmontes han sabido validar tambin el contenido de PFT y la
actividad antioxidante ORAC de sus productos jugos en polvo Livean-
Antiox, los cuales incorporan extractos de t verde como fuente de
antioxidantes naturales. Para tener plena seguridad acerca de la real y
continua presencia de un valor de polifenoles totales y de ORAC en un
producto determinado, es fundamental que ste cuente con el respaldo
que supone su anlisis regular y/o certificacin.

Bibliografa de la seccin (para acceder al Abstract, pinchar el

ttulo de la Referencia):
Mara Luisa Soto, Andrs Moure, Herminia Domnguez, Juan Carlos
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PAGINA: http://www.portalantioxidantes.com/analisis-de-antioxidantes/

Los valores ORAC, son una referencia, pero no la

"biblia del antioxidante"
Muchas enfermedades crnicas y degenerativas, como el cncer, Alzheimer,
Parkinson y enfermedades del corazn son causadas en parte por el estrs
oxidativo, originado por losradicales libres. El envejecimiento est tambien
causado entre otros factores como el cromosmico (telmeros), por la accin de los
radicales libres sobre las estructuras celulares.

Los antioxidantes naturales, presentes en los alimentos, como la vitamina

C, vitamina E, selenio y fitoqumicos, pueden neutralizar y eliminar estos
radicales libres.

Metodos de medicin de la capacidad antioxidante de los

alimentos

Existen diferentes mtodos para medir la capacidad antioxidante de los alimentos y

los fitoqumicos: Capacidad de Absorcin de Radicales de Oxgeno
(ORAC), Reduccin de la energa de in frrico (FRAP) y la equivalencia de
Trolox capacidad antioxidante (TEAC) .

El mtodo ms popular es la determinacin de ORAC, que fue desarrollado por el

Instituto Nacional de Salud, en Baltimore. ORAC mide el efecto inhibitorio de los
radicales libres mediante una reaccin qumica azo-inducida por la oxidacin de
fluorescena. Es decir, la intensidad de la fluorescencia de fluorescena disminuye
despus de la adicin de un azo-iniciador, que acta como un generador de
radicales libres. En otras palabras, cuanto ms fluorescencia hay, quiere decir que
menor es la presencia de radicales libres, viceversa. As la degeneracin de la
fluorescena (efecto fluorescente) se reduce por la presencia de antioxidantes. A
mayor fluorescencia, mayor capacidad antioxidante.
Los valores de ORAC de los alimentos

El Departamento de Agricultura FDA

(http://www.ars.usda.gov/sp2userfiles/place/12354500/data/orac/orac07.pdf) reco
mienda una ingesta de alrededor de 3000 a 5000 unidades diarias.

Los valores de ORAC de un determinado alimento pueden ser diferentes debido a

las condiciones de cultivo, las condiciones de procesamiento, el procedimiento de
anlisis y la variedad.

La tabla adjunta contiene una seleccin de alimentos y sus valores ORAC

Tabla Orac
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Limitaciones del mtodo ORAC

El mtodo de ORAC slo se mide la degradacin de la fluorescena, pero no
identifica a los radicales libres implicados.Tampoco hay relacin entre los valores de
ORAC y el beneficio para la salud porque hay tambin otros factores involucrados,
tales como el metabolismo de los fitoqumicos y la absorcin en la sangre y las
clulas.

Los valores ORAC son tambin ms valorados por los vendedores de

suplementos alimenticios, que slo anuncian el valor de ORAC sin tener en
cuenta los beneficios reales para la salud.

Las plantas tambin contienen componentes beneficiosos sin valor ORAC,

como las xantonas, minerales y fibras.

En conclusin, los valores ORAC son una importante referencia, pero no son una
ciencia exacta. Lo importante cara a la alimentacin, es ingerir frutas y verduras
variadas, y si son de muchos colores, mejor, ya que el color lo proporcionan los
fitoquimicos, y estos al final, son los que tienen la capacidad antiOX.

PAGINA: http://cocina-antiox.blogspot.pe/2009/12/los-valores-orac-son-una-
referencia.html