Laboratorio de

Microbiologa
General II

Equipo 3, 2752
Adiestrar al alumno en el manejo
de la tcnica inoculacin de
embrin de pollo por las vas ms
utilizadas.

El alumno conocer las diversas

partes del embrin de pollo de 9
das de inoculacin.
 Se denomina efecto citoptico a los cambios
bioqumicos y moleculares, morfolgicos y de
viabilidad celular, visibles a microscopa
ptica, causados durante el ciclo de
replicacin viral.
Aunque todos los virus lticos producen
efecto citoptico, puede observarse una gran
diversidad de manifestaciones
 La mayor parte de las observaciones del ECP
se han realizado en clulas infectadas en
cultivo, en las que se aprecia: prdida de
adherencia al sustrato, inhibicin por
contacto, redondeamiento celular, formacin
de sincitios, cuerpos de inclusin citoslicos,
transformacin celular, lisis, etc.
 Es la conclusin del
conjunto de
alteraciones celulares
que se producen,
secuencial o
simultneamente en la
clula infectada,
liberando finalmente al
medio las nuevas
partculas virales.
 Muchos tipos de virus
inducen la aparicin de
estructuras
membranosas en el
citoplasma, en algunos
casos en forma de
grandes vacuolas
citoplasmticas o
pequeas.
 Los sincicios son
grupos de clulas
fusionadas
apreciables como
una masa celular
multinucleada
 Es una alteracin en el crecimiento normal de
las clulas en cultivo con evidentes
manifestaciones morfolgicas.
Se asocia a una serie de cambio moleculares y
est especialmente ligada a virus que insertan
su genoma en el de la clula infectada, pudiendo
causar mutagnesis insercional al interrumpir
antioncogenes o activar pro-oncogenes, o
alterando la correcta regulacin de la expresin
gnica celular.
 Las alteraciones bioqumicas son muy diversas y
especficas de cada virus, si bien pueden
sealarse las ms importantes a nivel general.
Algunos virus son capaces de mostrar esta
inhibicin en etapas tempranas de la infeccin
pero la mayora de los virus animales lo hacen
en etapas tardas. El efecto ms drstico suele
producirse en la inhibicin de la expresin de
protenas celulares por traduccin preferente o
casi exclusiva de protenas virales.
 1.- Inhibicin de la sntesis de protenas
celulares

2.- Inhibicin de la sntesis de DNA celular

3.- Inhibicin de la sntesis de RNA celular

 Cambios en la actividad de enzimas
presentes en las membranas.
Modificaciones en la funcionalidad del
sistema vesicular.
Aumento de la permeabilidad de la
membrana plasmtica.
Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en
el laboratorio son:

1.Animales de experimentacin

2.Embriones animales

3.Cultivos celulares artificiales

La inoculacin en animales de experimentacin de muestras
clnicas o de virus para su aislamiento o propagacin.

Poco usada

Se emplea nicamente cuando se trata de propagar virus cuya

replicacin en los otros sistemas no es posible.

Los animales ms utilizados:

monos, los cobayos y los ratones
lactantes
Los ms utilizados son los embriones de pollo

los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su

inoculacin que suele oscilar entre 6 y 14 das.

Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del

embrin (cavidad amnitica, saco vitelinol etc.).
Se cultivan clulas de mamfero en una sola capa (monocapa)
sobre la superficie de un recipiente de plstico y son inoculadas
con la muestra estudiada.

Despus se observan a diario los cambios inducidos por virus

(efectos citopticos), a veces tan caractersticos que no se
requiere de ms investigacin para informarlos, sin embargo, a
menudo son necesarias algunas pruebas confirmativas, como
inmunofluorescencia.
Lneas celulares semicontinuas : Estas clulas derivan de tejido fetal humano o
animal. Poseen el cariotipo diplode normal y, por tanto, es posible utilizarlas en la
produccin de vacunas. Tienen un periodo de vida limitado y slo es posible hacer
subcultivos de unas 50 generaciones.

Lneas celulares continuas: Las ms utilizadas para el diagnostico. Derivan de un

tumor o de clulas normales que, despus de cultivos repetidos, se transforman
tanto que actan como clulas derivadas de tumor, es decir, poseen un nmero
anormal de cromosomas, Estas clulas pueden propagarse de manera indefinida.

Cultivos de linfocitos: Los linfocitos B se dividen y continan la divisin de manera

indefinida cuando estn infectados por VEB. Esta caracterstica es conocida como
inmortalizacin y se puede aprovechar como marcador del aislamiento de VEB.
Los linfocitos T crecen en presencia de una linfocina, IL-2, el descubrimiento de este
fenmeno ha sido fundamental para el estudio de los retrovirus humanos (VIH y
HTLV) que logran propagarse en cultivos celulares con la formacin de clulas
gigantes sincitiales.
Tipo de cultivo Caractersticas Ejemplos Uso primario

Primario Diploide: Tipos Primario de rion de Influenza;

celulares mezclados; mono parainfluenza;
1 2 pasajes algunos enterovirus

Lneas celulares Diploides: Fobroblastos Herpes simplex:

fibroblastos; pasajes dipliodes humanos citomegalovirus;
limitados. (< 50-70) (WI-38, MRC-5 o varicela zoster,
HRL) rinovirus.

Lneas celulares Heteroploides: GeLa; Hep-2 Tadenovirus: RSV

establecidas pasajes continuos in
vitro.
La inoculacin animal sigue
siendo un mtodo de gran
valor para estudiar:

La oncognesis viral
La patologa de los
padecimientos virales
La respuesta inmune a los
virus
El efecto de los factores
ambientales sobre
infecciones virales
Corpsculos hallados por Negri en las clulas del
sistema nervioso central de los animales muertos de
rabia; son especficos de esta enfermedad. Se trata de
reacciones de la clula contra el virus. No se hallan en
los animales inoculados con la rabia experimental.
El virus de la Rabia en el cerebro de animales infectados
produce Cuerpos de Negri de varias formas (menores
de 1 micrmetro de dimetro, con masas redondas u
ovales, y cintas de 2 a 10 micras de dimetro).
Estos son inclusiones eosinoflicas intracitoplasmticas
formadas por agregados de nucleocpside en las
neuronas de cerca de 50 a 80% de los humanos
infectados.
 Histopatologa de la rabia, cerebro. Cuerpos de
Negri caractersticos estn presentes con una clula
de Purkinje del cerebelo en este paciente que
falleci por rabiaHistopatologa de la rabia,
cerebro. Cuerpos de Negri caractersticos estn
presentes con una clula de Purkinje del cerebelo
en este paciente que falleci por rabiaVVV
 Se reconoce el embrin que esta vivo porque
en la transiluminacin se ven como telaraa
venas que forman la membrana
corioalantoidea y se observa que se desplaza
un punto negro intermitente (el ojo).
 Al morir, los vasos se
desintegran y este yace fijo
al polo superior del huevo.

A medida que aumenta de

tamao disminuye el
volumen de los lquidos
extraembrionarios
 UTILIDAD: Es una fuente de tejido vivo conveniente y fcil de manipular
que se utiliza en la propagacin, titulacin e identificacin de virus, as como
en la preparacin de algunas vacunas virales.

Se emplean huevos con 5 a 14 das de incubacin, segn la

va de inoculacin:

Membrana corioalantoidea
Cavidades alantoidea y amnitica
Saco vitelino
Intracerebral
Endovenosa.
 MIXOVIRUS
-Influenza
-Parotiditis

HERPESVIRUS
POXVIRUS
Herpes
Viruela
simplex
 Con colorante se observa: liquido alantoideo,
albumina y cmara de aire teidos
Liquido alantoideo: virus hemaglutinantes o
produccin de hemaglutininas
Embrin de 9-12 das, inoculo de 0.1-0.2ml
 Con colorante: lquido amnitico, cmara de
aire
Primoaislamiento de cepas de influenza
Embrin de 7-15 das, inoculo de 0.1-0.2ml
 Con colorante: Saco vitelino, Cmara de aire
Cultivo de clamidias y ricketsias
Embriones de 5-8das, inoculo de 0.2-1ml
Inoculacin en saco vitelino
 Con colorante: membrana corioalantoidea
Permite cuantificar aquellos grupos virales
que producen lesiones localizadas
Embrion de 10-12 das, inoculo de 0.1-0.5ml
 La infeccin puede producir una lesin tisular local
conocida como pstula (caracterstico de virus)

A veces se inyecta el virus directamente en el embrin

en desarrollo: IV, intraperitoneal, o intracerebral.

Tambien influye: la dilucin, la cantidad del inculo, la

temperatura y tiempo de incubacin tras la
inoculacin
MEMBRANA VIRUS TIPO DE CANTIDAD DE SIGNOS DE
EMBRIN INOCULACIN CRECIMIENTO

Saco vitelino Herpes simple Se emplean 0.2 1 ml Muerte

Neumona y embriones de
Rickettsias 5 8 das
Cariolantoes Herpes simple Se emplean 0.1 0.5 ml Muerte
Poxvirus embriones de 10 12 Pstulas
Sarcoma de Rous das Pstulas
Varicela
Virus de
Laringotraqueitis Focos o pstulas
aviar fcilmente visibles
Enfermedad de Beyer
Alantoides Influenza Se emplean 0.1 0.2 ml Hemoglutinacin
New Castle embriones de
Virus de la bronquitis 9 12 das
infecciosa

Amnitica Parotiditis 7 15 das 0.1 0.2 ml Muerte

Virus de la Gripe

Intravenosa Virus de la Leucemia 10 - 15 das 0.02 - 0.05 ml. Pstulas

Intracerebral Virus del herpes 8 14 das 0.01 0.02 ml Alteraciones

Rabia cerebrales
 VENTAJAS DESVENTAJAS
Control preciso y fino del medio ambiente (fcil tcnica sensible
manipulacin)
Caracterizacin y homogeneidad de la muestra calidad y costos
Economa
Inestabilidad
No es necesario el espacio ni el cuidado que
requieren los animales. Apreciacin difcil durante los tres
Mantenimiento de los cultivos celulares. primeros das de edad del embrin

Se pueden cuantificar aveces al correlacionar el

numero de pustulas con la dilucin viral inoculada.
(Herpes y vaccinia).

Se emplea para preparar vacunas (influenza, fiebre

amarilla)

Aislamiento para diagnostico (viruela, herpes,

influenza)

Hacer ensayos de nuevos agentes virales

Estructura normal

Iluminar con Cortar cascara

ovoscopio a nivel de
Identificar y cmara de aire
marcar cmara
Depositar en
de aire y
mancha ocular caja petri
Iluminar con Perforar
ovoscopio (entre cmara
de aire y
Succionar en
cmara de
(cmara de punto de aire
inoculacin
aire)

Dividir Aguja del 27,

Sealar punto
imaginariam de inoculacin depositar
(a final de
ente (3 primer tercio)
0.1ml
partes) colorante
 Colocar embrin
Introducir aguja larga
horizontal y encontrar
Iluminar y marcar cmara de aire del 22 con 0.1ml de
saco vitelino (mancha
colorante
oscura y densa)
 Perforar
puntos
Aprox. 5 mm Localizar zona marcados
Marcar cmara y
por debajo de libre de vasos Inocular 0.1
Punto en la camara Marcar punto de ml con aguja
cima lado opuesto 27 corta
O 22 larga
en camara
iluminar
 Marcar camara y
Iluminar
punto en la cima

Marcar punto de
Inocular con aguja
inoculacin (donde
22, 0.1ml
esta embrion)
 Jean D. Acton. Virologa. Interamerica.
Mexico. 1977 pp. 13-17