Cuantificacin mediante

la tcnica de PCR en tiempo real

Usos y aplicaciones

Paula Fernndez

Instituto de Biotecnologa. CICVyA. INTA-Castelar

PCR Standard vs. PCR Tiempo
Real

Anlisis de punto final Anlisis de la cintica de

Deteccin del producto por
la reaccin
Electroforesis en gel Deteccin del producto en
cada ciclo de la reaccin
 VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TCNICAS

ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ

DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado especfico o productos amplificados previamente)
Geles de agarosa.

* Baja precisin
* Baja sensibilidad
* Baja resolucin
* No automatizado
* Discriminacin slo por tamao
* Resultados cualitativos
 Consiste en dos pasos:
Transcripcin reversa
RT-PCR PCR
mRNA

OBJETIVO:
Deteccin de la expresin de cDNA (simple cadena)
un gen por presencia de
mRNA
cDNA (doble cadena)

PCR
 PCR en tiempo real

La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con

capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de
luz de una longitud de onda determinada y de detectar la
fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.
Real Time PCR
Step One Applied Biosystems
 Fluorforo que se intercala en
el surco menor de la doble
cadena de ADN
Desventaja: se une a CUALQUIER
ADN de doble cadena (dmeros
de primers y productos
inespecficos).
Observacin del proceso de amplificacin

Se adquieren los datos cuando la amplificacin est

todava en la fase exponencial. Esto est
determinado por la identificacin del nmero de
ciclo al cual la intensidad de emisin del fluorforo
aumenta con respecto al ruido de fondo (background)
Este nmero de ciclo se llama ciclo umbral
(Ct: threshold cycle). El Ct est determinado en la fase
exponencial de la reaccin y es ms confiable que las
mediciones a punto final convencionales. El Ct es
inversamente proporcional al nmero de copias del
target templado: a mayor concentracin de templado, Concepto de eficiencia
menor Ct medido.
 Ecuacin de la PCR

Xn
Xn = X0(1 + E)n

Xn = producto de PCR luego del ciclo n

X0 = nmero inicial de copias
E = eficiencia de amplificacin
n = nmero de copias X0
Nmero de
ciclos
 Las ecuaciones de PCR

Idealmente, cada ADN target en la

muestra original se duplica de ciclo en
ciclo

Esto equivale a una eficiencia de

transcripcin E=2 o de (E-1)x100=100%

La eficiencia no siempre alcanza el

mximo terico.
 Eficiencia

La eficiencia de la reaccin puede ser calculada por la siguiente

ecuacin: E=10(-1/slope). La eficiencia de la PCR debera ser de aprox.
90-100% (pendiente ideal = 3.32)

Diversos factores afectan la eficiencia como puede ser: el largo del

amplicn, la estructura secundaria y el diseo de primers (entre
otros).
 Efecto de la eficiencia de
amplificacin

Caso 1: E = 0.9 Caso 2: E = 0.8

Xn = X0(1+E)n
Xn = 100 (1+0.9)30 Xn = 100 (1+0.8)30
Xn = 2.3 x 1010 Xn = 4.6 x 109

Resultados
Una diferencia de 0.1 en la eficiencia de amplificacin result en u
nmero final de copias significativamente menor.
 log view

Las cinco diluciones alcanzan el plateau en el mismo punto aunque cada curva muestra
un recorrido diferente. Esto refuerza el hecho de que si las mediciones fueran tomadas a
lo largo del plateau los datos no representaran la cantidad inicial del target.
 En la prctica uno no observa los
amplicones sino una medida indirecta
de su abundancia.

Lo que se mide es la fluorescencia de la

muestra amplificada

Se supone que la fluorescencia es

proporcional al nmero de amplicones
Cmo sera
11.0

9.9

una curva 8.8

terica de 7.7

fluorescencia 6.6

Fluorescencia
en funcin del
5.5

4.4

nmero de 3.3

ciclos? 2.2

1.1

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Ciclos
Cmo es
8.0

7.0

una curva de 6.0

fluorescencia 5.0

real en
Fluorescencia
4.0

funcin del 3.0

nmero de 2.0

ciclos? 1.0

0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Ciclo
 La mayora de las curvas de fluorescencia
presentan valores errticos para los
ciclos iniciales de la reaccin cuyo origen
es diverso.

La curva de fluorescencia no crece

indefinidamente.

La cantidad de reactivos limita la reaccin.

 Como interpretar Rn?

Rn
Sample

Threshold Rn
Rn

Rn
No Template
Control
CT
0 10 20 30 40
Cycle number
 Rn

* Rn+ es el valor Rn de una reaccin que contiene todos los

componentes (muestra de inters, GOI, blanco); Rn- es el valor
Rn detectado in NTC
(valor de base)
* Delta Rn es la diferencia entre Rn+ and Rn-. Es adems un
indicador de la magnitud de seal generada por la PCR
* El grfico de Delta Rn versus el nmero de ciclos y muestra las
curvas de amplificacin para estimar los valores de Ct

NTC: no template control

GOI: gene of interest
 PROBLEMAS

PRODUCTOS NO ESPECFICOS (artefactos): que pueden

incrementar el valor de fluorescencia obtenida durante la
reaccin. Esto es mas frecuente cuando se utiliza SYBR-green.

ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:

Unin inespecfica de primers (mispriming): por unin de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
Dmeros: los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeos
 CURVA DE DENATURALIZACIN

Muestra el perfil de denaturalizacin de los productos

amplificados.
Si un producto presenta un perfil de denaturalizacin
diferente (valores de Tm diferentes), significa que es otro
producto (no especfico) de amplificacin, pueden ser
dmeros.
CURVA DE DENATURALIZACIN DE DILUCIONES
(se observan dmeros, de menor temperatura de fusin)

dmeros
DISEO EN PLACA
 Relative expression

( media Cq ( control ) media Cq ( muestra ))gen objetivo

E
R
gen objetivo
( media Cq ( control ) media Cq ( muestra )) gen referencia
Egen referencia

Pfaffl M.W. Horgan G.W., Dempfle L. (2002) Relative expression

software tool (REST) for group-wise comparison and statistical
analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids
Research, 2002, Vol. 30, No. 9 e36
 Ventajas del PCR en tiempo real
Simple y rpida (semi-automatizada).
No hay manipulacin post-PCR.
Eliminacin de contaminacin por amplicones.
Cuantificacin del DNA o RNA molde inicial.
Muy sensible.
Deteccin de productos inespecficos con la opcin
curva de desnaturalizacin (Melt-Curve).
Deteccin de ms de un producto especfico en una
misma reaccin.
Extraordinariamente especfico.
Desventajas del PCR en tiempo real

Laborioso y dificultoso de poner a punto

Determinacin de genes presuntos constitutivos

Alta sensibilidad
Determinacin del ciclo umbral (Cq) y eficiencias de la
reaccin de PCR cuantitativa (LinReg PCR)
 Normalizacin con genes de referencia

Usualmente son genes abundantes y expresados a un nivel

celular/tisular constante
Los ms usados son en general los menos confiables
Usar una combinacin de varios genes
 Valor M: ndice de estabilidad de control interno
(nivel de expresin de dos genes constitutivos debe ser idntica)

Media aritmtica de los desvos de los dos genes constitutivos (j y k)

Limitantes:
Dependencia de genes analizados
Evala media aritmtica de los desvos estndard de a pares de genes
Supuesto de estabilidad de todos los genes 40
 Bsqueda de genes de referencia

Modelo estadstico

CL1: Control leaf 1

CL2: Control leaf 2
FE1: Flower excision 1
FE2: Flower excision2
D: Dehydrated1

Fernandez y col. 2011

Bsqueda de genes de referencia

Uso de geNorm
Functional Genomics Strategies applied to the study
of senescence in sunflower

Contro Water stress

l
Leaf sampling at different
development stages

Physiological Metabolomic Transcriptomi

approach approach c approach
Chlorophyll GC-TOF-MS 4 x 44 Agilent
Sugars Sunflower
Nitrogen Microarray
Leaf area
Bioinformatics data analysis
and integration

Biomarkers (genes,
transcripts & metabolites)
of senescence process in
Moschen 2009
 Normalizacin de PCR cuantitativa y
bsqueda de genes de referencia

Imposibilidad de usar un solo gen constitutivo para todas las

especies (Coker y Davies 2003)

Tubulina es el ms estable en hoja, raz y flor (ms conveniente para

anlisis dentro de clonotecas en tomate) y en Populus pero el menos
estable en Arabidopsis.

DNA-J-like protein ms estable en su expresin media (Ct) entre

todas las clonotecas (tomate).

Alta abundancia de 18S o 28S RNA frente a mRNA (Kim y col. 2003)
(refutado por Solanas y col. 2001).
 Sunflower Unigene Resource (SUR v.1.0)

133,682 EST Genbank (release May 2009)

Helianthus annuus L.

VecScreen
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/UniVec.html)

Trimseq EMBOSS
(http://emboss.sourceforge.net/)

28,089 singletons and 12,924 contigs = 41,013 Sunflower microarray

unigenes 42,386 probes
(CAP3 software: http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)
74 specific control probes
(10x: 740 controls, previous
Functional annotation and KEGG mapping cDNA chip)
(Blast2GO software: www.blast2go.org) 1,417 Agilent controls
38,485 GO terms resulted in 49.6% of
total sequences with GO annotation

Fernndez y col 2012

Resultados preliminares microarreglo

T-1 T-2 T-3 T-1 T-2 T-3

Hoja 10 CONTROL Hoja 10 stress hdrico

Campo Invernculo

Slo Control :1945 probes

Slo Control :6280 probes
Slo Estres: 587 probes
Slo Estres: 3781 probes
C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1
F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2

T111
F230
F209
T234
F550
F401

H411
H322
H387
H125

F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3
S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3

C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1
F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2

F192
F210
T253
F137
H136
H385
H302
H123
H124
H110

F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3
S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3

C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1
F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2

T322
F171
F175
T221
F549
F543
T289

H304

F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3

EF624
EF502

S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3
expresados

C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1 F1
F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2 F2

T187
T107
F216
T340
F231
F443

H209
H111
H354

F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F3
EF432

S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3
Validacin por qPCR de genes diferencialmente

Perfil de expresin

80 genes candidatos
para cada uno de los
 Estudios de expresin de genes candidatos
frente a estreses abiticos

Validacin de genes por PCR cuantitativa (PCR en tiempo real)

De los 15 genes que fueron seleccionados para su validacin se evaluaron 12,

confirmndose la expresin diferencial de 10 de ellos (Mtodo 2 -Ct Livak y
Schmittgen, 2001).
(BU671806) (BU671910)
EST T124 EST EF502
7
7

6
6

5
5

4 FH
4 FH Rn SH
Rn

SH 3 CH
3
CH
?

2
2

1
1

34
35
36
37
38
39
40
32
33
21
22
23
24
25
26
27

31
28
29
30
0
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40

-1
-1
Ciclo
Ciclo
 Mtodos de deteccin por hidrlisis de ADN
(Sondas TaqMan)

Permiten medir la produccin de productos de PCR mediante un sistema de sondas

marcadas mediante dos fluorocromos.

Su utilidad radica en que poseen un fluorforo en su extremo 3' y una molcula en el 5'
que bloquea su emisin de fluorescencia (denominada en ingls quencher); esta
sonda marcada hibrida especficamente en la parte central del producto de PCR a
obtener.

Cuando la polimerasa se topa con la sonda la hidroliza mediante su actividad

exonucleasa 5'-3', lo cual provoca la separacin del quencher del fluorocromo y, por
tanto, se emite fluorescencia.