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M,a,nual Pra,ctico pa,ra el Control de Calidadlnterno en el Labor,ator'io TOJli,coiogico

Dr. Carlos A. GoteJU



Centro Panarnericano de Ecologia Humana y Salud Division de Salud y Ambiente

Organizacion Panamericana de la Salud Organizacion Mundial de [a Sa] ud

Metepec, Edo. de Mexico, 1993

Manual Practico para el Control de Calidad Interno en el Laboratorio TOJlicol6gico

Dr. Car/os A. Gotelli

Centro Panamericano de Ecologia Humana y Salud Division de Salud y Ambiente

Organizacion Panamericana de la Salud Organizacion Mundial de la Salud

Metepec, Edo. de Mexico, 1993

A mis hijos:

Mariano Javier Diego Nahuel

PRDLOGO

EI "MANUAL PRAcTICO PARA EL CONTROL DE CAUDAD INTERNO EN EL LASORA TORIO TOXICOL6GICO" que nos ofreee el eminente y experimentado investigador, Carlos A. Gotelli, eonstituye una obra de gran importaneia en el campo de la toxieologia.

Los laboratorios espeeializados en analisis toxicoloqicos deben ajustarse a normas 0 preceptos aqui descritos, que los ayuden a alcanzar el control de los diversos dispositivos que integran, en su conjunto, el reeurso valido dentro de la cieneia, que satisfaga con exactitud y seguridad plenas los requerimientos que se recaban eonstantemente en el ambito asistencialtoxicol6gieo.

Una publieaci6n de este genero constituye un componente de consulta practica, competente, insustituible para el correcto ejercieio de la especialidad en su aspecto eminentemente analltico.

EI doctor Gotelli detalla con ordenamiento y simplicidad idiomatica las previsiones que deben adoptarse para controlar, sistematica y peri6dieamente, el funcionamiento adecuado de un laboratorio con tales caracteristicas. Con elias sera posible registrar resultados fidedignos y confiables en las diversas instancias de la toxicoloqia,

Las disposiciones tecnicas sobre Control de Calidad Interno que integran esta publicacion se distribuyen en capitulos variados, a saber: Practica adecuada de laboratorio; Limpieza del material de vidrio; Calibraci6n del material volumetrico: Control y calibracion de Instrumentos; Selecci6n de rnetodos y estandares; Criterios de operaclon: Deteccion de errores; Seguridad en el laboratorio y Sibliografia. Adernas, contiene indicaciones precisas para un cumplimiento efectivo que permite administrarcon eficacia el proceso analitico ulterior.

Esta contribuci6n tan meritoria ha sido desarrollada de forma objetiva, clara, intelegible, la que, adernas, incluye referencias y comprobaciones precisas, documentadas, con el indudable aval de la experiencia tecnlca adquirida a traves de una prolongada, esmerada y efectiva actividad del esclarecido especialista e investigador, Dr. Carlos A. Gotelli. Es por ello que no tengo ninguna duda en decir que, aparte de la recepcion oportuna que dlspensaran a esta publicacion quienes se dedican a disciplinas similares, nos ofrece una informacion practice autentlca, acertada, acorde con los objetivos expuestos por el autor en el proemio.

Prof. Dr. Manuel A. Guatelli

Prof. Emerito de la Universidad de Buenos Aires Ex Perito Quimico de la Justicia Naciona1.

I'

INDICE

PROLOGO v

CAPiTULO 1

INTRODUCCION 1

CAPiTULO 2

PRAcTICA ADECUADA DE LABORATORIO 3

CAPiTULO 3

LlMPIEZA DEL MATERIAL DE VIDRIO 7

CAPiTULO 4

CALIBRACION DEL MATERIAL

VOLUMETRICO 11

CAPiTULO 5

CONTROL Y CALIBRACION DE INSTRUMENTOS

CAPiTULO 6

SELECCION DE METODOS Y ESTANDARES 41

CAPiTULO 7

CRITERIOS DE OPERACION 51

CAPiTULO 8

DETECCION DE ERRORES 53

CAPiTULO 9

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 59

CAPiTULO 10

BIBLlOGRAFiA 63

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L '

CAPiTULO 1

INTRODUCCION

Sin lugar a dudas, es en el campo de la Toxicologia Analitica donde el aporte dellaboratorio constituye un elemento de singularimportancia yen muchos cas os de gravitaci6n decisive para el conocimiento certero de procesos tan variados y complejos como el diagn6stico de intoxicaciones accidentales 0 voluntarias; la contaminaci6n de alimentos, aguas, suelos, aire; la evaluaci6n de la exposici6n profesional a sustancias t6xicas; etc.

Todas estas situaciones presentan dos caracterlsticas fundamentales: en primer lugar, la gran variedad de sustancias que las pueden provocary, en segundo termino, la gran variedad de concentraciones posibles de dichas sustancias en relaci6n con el fen6meno en estudio.

Estas dos caracteristicas nos demuestran la enorme versatilidad yalta complejidad con que debe operar un Laboratorio de Toxicologia AnaHtica. Versatilidad por los innumerables rnetodos, tecnicas y procedimientos con que debe contar para poder abordar la busqueda de las multiples sustancias t6xicas que pueden estarpresentes en matrices tan variadas y complejas como son los medios biol6gicos, aire, suelos, aguas, alimentos, etc., y la alta complejidad por el instrumental complicado y la infraestructura operativa necesarias para poder estructurar y poner en marcha con eficiencia las tecnicas anaHticas adecuadas para cada circunstancia.

Algunas de las principales limitaciones para la difusi6n de estos laboratorios en los parses en vias de desarrollo son: el alto costo de instalaci6n y mantenimiento de estos laboratorios, la necesidad de contarcon profesionales y tecnicos con experiencia

OJ

y adecuado entrenamiento, una actualizacion bibliografica permanente y el acceso a bases de datos internaclonales,

Resulta paradcjico que en estos parses la frecuencia y riesgo de accidentes toxlcos es mayor, debido a la existencia de plantas quimicas en zonas urbanas, bajo nivel de concientizacion en temas de higiene y seguridad industrial de las autoridades y los operarios, ignorancia de las normas de seguridad y usc indiscriminado, de sustancias tales como plaguicidas, solventes, acidos, etc.; transporte de sustancias peligrosas desatendiendo las medidas de seguridad, y muchas otras circunstancias que condicionan el escenario de posibles accidentes toxicos cuya dimension y gravedad abarca desde el producido en el hogar, hasta una catastrote quimica.

Dentro de este contexto tan dificil, se hace real mente imprescindible contar con laboratorios toxicoloqicos capaces de generar y producir datos con la precision, exactitud y reproducibilidad necesarias e imprescindibles para lograr la correcta dimension del problema en estudio.

A fin de lograr este objetivo, los laboratorios toxlcoloqlcos deben poner en practica, en forma rutinaria y continua, un programa ajustado de Control de Cali dad Interno que debe complementarse con la participaci6n en un programa de Control de Calidad Externo.

EI presente manual recopila y detalla en forma practlca y accesible todas las operaciones para controlar adecuadamente los equipos e instrumentos basicos can que debe contar un laboratorio para realizar anallsts toxlcoleqlcos.

Tambien se detalla el criterio rnetodoloqico de trabajo que debe aplicarse a fin de obtener los resultados analiticos optimos y asi Ilegar a un nivel de eficiencia y rendimiento continuo que consoliden la gestion dellaboratorio.

CAPITULO 2

PRAcTICA AOECUADA DE

LABORATORIO

La practice adecuada de laboratorio es la que resulta de aplicar normas y criterios rigurosos que van desde la calidad de las drogas y reactivos utlllzados, hasta las pruebas que confirmen los resultados obtenidos. Ese amplio abanico incluye la necesidad de contar con profesionales y tecnlccs especializados y experimentados, equipos e instrumental adecuado, bibliografia actualizada y muchas otras facilidades que, en su conjunto, configuran el perfil de eficiencia y credibilidad de un laboratorio toxicoloqicc.

Tres premisas basi cas constituyen el basamento de la confiabilidad de un laboratorio: la precision, la exactitud y la reproducibilidad de los resultados analiticos.

Precisi6n: es la repeticlon de los resultados obtenidos por multiples anahsls, independientemente del verdadero valor que corresponde a la sustancia analizada.

La vanacicn de los resultados de un grupo de mediciones nos da una idea de la imprecision, que se expresa mediante la desvtaclon estandar 0 el coeficiente de variaci6n.

Exactitud: es la proximidad entre el resultado obtenido y el valor verdadero de la sustancia analizada. Depende fundamentalmente de la especifidad del metod 0 y de su eficiencia en la recuperaci6n.

La inexactitud de un resultado, es la diferencia entre la media de un conjunto de determinaciones y el valorverdadero de la sustancia analizada.

Reproducibilidad: es la caracteristica de una metodologia, que aplicada por diferentes operadores en distintas oportunidades permite obtener resultados similares.

En los esquemas siguientes se grafican los conceptos selialados con anterioridad.

GRAFICO 1

x X X X

Imprecisi6n e inexactitud

Precisi6n e inexactitud

Imprecisi6n yexactitud

Precisi6n y exactitud

En el contexto de la Practica Adecuada de Laboratorio distinguimos tres etapas 0 partes interrelacionadas:

.. La muestra

.. Ellaboratorio y su logistica

.. EI anal isis

La Muestra:

Las muestras del analisls quimico toxicoloqico son (micas en el Tiempo y en el Espacio, si se las compara con las requeridas para definiciones clinicas industriales u otras.

Unicas en el Tiempo porque la dinamlca de los procesos biol6gicos, metabolicos, los cambios fisico quimicos en el medio ambiente, la diluci6n en el aire y en el agua y otras muchas posibilidades de transformaci6n, prescriben que una muestra tomada en un determinado tiempo puede ser sustancialmente diferente a otra de igual naturaleza, tomada a pocas horas de diferencia; y (micas en el Espacio porque la distribuci6n de los t6xicos puede no ser hornoqenea en medios tales como liquidos biol6gicos y excretas, agua, aire, suelo, vegetales, etc., motivos que condicionan la selecci6n de las muestras por analizar y su consecuente representatividad.

Tambien son de fundamental importancia la cantidad de muestra, el tipo de envase utilizado para la recolecci6n de la muestra, el uso de conservadores 0 estabilizantes, el tiempo de recolecci6n, el envio y anallsis de la muestra, condiciones de envio, condiciones de almacenamiento; etc.

Las observaciones anteriores deben tenerse muy en cuenta, porque del cuidado y manejo de cada una de elias dependera la utilidad del resultado analltico que se obtenga.

EI Laboratorio y su Logistica:

La analitica toxicoloqica es una disciplina que requiere la disponibilidad de laboratorios de alta complejidad, dotados con equipo e instrumental complejo que debe ser operado por profesionales y tecnicos altamente capacitados y especializados.

Sin embargo, es posible realizar estudios toxlcoloqicos con exito, si no se cuenta con laboratorios complejos, pero trabajando bajo condiciones de confiabilidad y seguridad respaldadas por una buena practlca de laboratorio. EI Control de Calidad Intemo es un conjunto de normas y procedimientos que configuran una metodologia de trabajo segura que garantiza la seriedad y confiabilidad del laboratorio.

Para ello es necesario contar con espacios adecuados, ventilados e iluminados correctamente; provision de energia electrlca estabilizada; disponibilidad de agua potable en abundancia; empleo de drogas y reactivos de cali dad analitica; control y calibrado permanente de equipos e instrumentos; empleo de estandares de alta, media y ba]a concentraclon; ejecucion de tecnicas y metodos de exactitud, precision y reproducibilidad probadas; actuallzacton permanente de profesionales y tecnicos: acceso a bibliografia y bases de datos actualizadas.

EI esquema se cierra participando en un Programa de Control de Calidad Externo. Esta condiclon configura una verdadera auditoria cientifica del laboratorio y permite conocer, de manera indubitable, la eficiencia y confiabilidad del mismo.

EI Analisis:

EI resultado que se obtenga en un analisis toxicoloqico debe ser preciso, exacto y reproducible.

Para conseguirlo, es necesario que la muestra por analizar sea suficiente, representativa y no se contamine, que la metodologia a utilizar sea sensible y especifica, que las droqas, reactivos y normas sean de calidad analitica, que los equipos e instrumentos respondan a los criterios de calibraci6n y control y, finalmente, que el operador sea experimentado y eficiente para ejecutar los anausts.

Cuando se cumplen todos estos requisitos, aun sin contar con equipos muy sofisticados, se puede trabajar con seguridad en analltica toxlcolcqlca y as; contribuira satisfacer una necesidad impostergable en los distintos campos de la toxicologia (clinica, industrial, alimentaria, social, forense, etc.)

CAPiTULO 3

LIMPIEZA DEL

MATERIAL DE VIDRIO

Es imprescindible que todo el material de vidrio (volurnetrico, recipientes para muestras, etc.) esten escrupulosamente limpios, en especial libres de metales, sustancias grasas y cualquier otro elemento que bajo la forma de contaminaci6n pudiese alterar 0 interferir en el proceso analitico.

EI volumen no podria medirse con exactitud si las paredes contienen grasa, por minima que sea la cantidad. Si las paredes pr6ximas estan engrasadas puede distorsionarse el menisco de la soluci6n y con ello provocar un error sensible de Jectura.

Las sustancias que habitualmente man chan 0 contaminan el material, pueden ser:

Solubles en agua: la mayorfa de las sales inorqanicas y algunas sustanclasorqanlcas (alcohol, glicerinas, acetonas, etc.).

Solubles en acidos: metales y sus sales.

Solubles en alcalis: sustancias orqanlcas, en especial grasas. Solubles ensolventes organicos: aceites, resinas, alquitranes,

etc.

EI analista por 10 general sa be que contuvo el material por limpiar, raz6n que Ie permitira decidir el agente limpiador que debe utiJizar.

Cuando se ignora esta circunstancia se debe actuar en el siguiente orden:

1. eliminar con la ayuda de una varilla 0 espatula todos los depositos, partfculas 0 curnulos de sustancias adheridas al recipiente;

2. enjuagar con agua;

3. tratar con potasa alcohollca;

4. enjuagar con agua;

5. tratar con solucion sulfocr6mica 0 similar;

6. enjuagar con abundante agua destilada;

7. dejar escurrir 0 secar con chorro de aire.

Existen numerosos agentes de limpieza y diferentes rnodalidades de operaci6n para satisfacer las exigencias de limpieza que van de acuerdo con los requerimientos de la analitica toxicoloqica. Los mas comunes son:

3.1 Detergentes:

EI uso de los detergentes sinteticos permite eliminar inconvenientes que presentan los jabones: alcalinidad de sus soluciones, ineficiencia en soluciones acldas, ineficiencia en aguas duras, etc. Los detergentes sintetlcos pracficarnente son neutros y pueden utilizarse en aguas duras y, en general, en soluciones depH inferioresa 10.5sin alterarseodescomponerse. Las principales propiedades que deben reunir son: humectantes, tensoactivos y emulsionantes.

Los mas utilizados para la limpieza del labo rato rio son los detergentes ani6nicos, de los cuales el dodecil-bencen sulfonato de sodio oamonio es el mas difundido. Los detergentes cati6nicos son mas caros y no ofrecen grandes diferencias en eficiencia y rendimiento.

EI empleo de detergentes esta indicado para eliminar residuos orqanicos, en especial grasas y son men os corrosivos que las mezclas oxidantes de acidos.

Pueden actuar tanto en frio como en calor y, en algunos casos, el agregado de hipoclorito de sodio aumenta el efecto

Hmpiador. AI terminar con la limpieza es imprescindible continuar can el enjuagado de agua corriente en abundancia, despues can agua destilada, para terminar con el escurrido a secado en estufa.

3.2 Mezcla Sulfocr6mica:

Existen varias form as de preparar esta soluci6n, de las cuales la siguiente composici6n es la mas frecuente:

Dicromato de potasio 100 9

Acido sulfurlco concentrado 300 mL

Agua destilada c s p 1000 mL

Disolver el dicromato en agua, agregar el acido can cuidado y refrigerar y, para finalizar, lIevar a volumen.

La forma mas comun de empleo consiste en lIenar los recipientes, 0 sumergirlos en la solucion, cejandolos actuar durante una noche, luego recuperar la soluci6n y enjuagar el material con agua en abundancia. EI efecto limpiador puede mejorarse par calentamiento.

La rnezcla sulfocr6mica debe filtrarse peri6dicamente a traves de lana de vidrio a fin de separar los residuos.

3.3 Mezcla Nitrocr6mica:

Responde a una formulaci6n similar a la rnezcla sulfocr6mica, pero el acid a sulfurico es reemplazado par acido nitrico fumante. Su empleo no esta muy difundido y la tecnica de operaci6n es semejante a la descrita para la mezcla sulfocr6mica.

3.4 Soluci6n Sulfonitrica:

Se prepara al mezclar acido sulturico concentrado y acido nitrico fumante par partes iguales.

Esta solucion es mas eficiente que las mencionadas, pero su empleo requiere particular cuidado por su alto poder caustico. EI uso es similar al descrito con anterioridad.

3.5 Soluci6n de Potasa Alcoh6lica:

Se prepara disolviendo 10 9 de hidroxido de potasio en 100 mL., de alcohol etilico. Es un desengrasante eficiente, de accion inmediata y de facil eliminaclon.

3.6 Soluci6n de ac. nitrico al 50%:

Esta indicada para eliminar residuos de cationes. Se utiliza con posterioridad al lavado con detergente 0 mezcla sulfocromica.

3.7 Ultrasonido:

La limpieza ultrasonlca se lIeva a cabo aplicando un proceso conocido con el nombre de cavitaci6n. EI proceso consiste en la formaci6n y desaparicion acelerada de millones de pequerios puntos de vacio en el interior de la masa delliquido de limpieza, (agua, solventes orqanlcos, soluciones detergentes, etc.) 10 que genera un trabajo mecanlco sobre las piezas inmersas en el mismo, con el consiguiente desprendimiento de particulas o sustancias grasas que pudieran estar adheridas a dichas piezas. Esta metodologia requiere el uso de equipos diseriados especial mente para el caso y presenta ventajas significativas: rapidez, reduce la mane de obra, no produce roturas ni ralladuras, posibilita la filtraci6n a traves de pequerios oriticios (capilares, micro-jeringas, etc.), elimina el contacto con sustancias peligrosas, etc.

CAPiTULO 4

CALIBRACION DEL

MATERIAL VOlUMETRICO

EI material que por 10 general se utiliza en ellaboratorio toxicol6gico es: matraces aforados, buretas, pipetas, micropipetas y micro-jeringas.

Es condici6n fundamental contar con una correcta calibraci6n de todos los elementos utilizados y lIevar un control peri6dico y sistematico de los mismos, en el que se registren las variaciones producidas y se corrijan aquellos materiales que tengan un excedente de error mayor del aceptado para la categoria.

Se recomienda utllizar material "clase A" del National Physical Laboratory (N.P.L.) 0 del U.S. National Institute of Standards and Technology (N.I.S.T.)

En la tabla siguiente se consignan los errores admisibles
para matraces aforados "clase An estipulados por el
N.L.P.
Volumen
contenido mL 25 50 100 250 500 1000
Tolerancia ±mL 0.03 0.04 0.06 0.1 0.15 0.2 4.1 Calibrado

EI material volurnetnco de vidrio se cali bra 0 controla su exactitud pesando la cantidad de agua contenida 0 emitida a una temperatura dada, y calculando despues el volumen a partir de la masa. No debe olvidarse que la densidad del agua y el volumen de un recipiente de vidrio varian en funci6n de la temperatura. La temperatura de referencia habitual es de 20°C (en algunos paises tropicales es de 27"C). De ahi que si se trabaja en un lugar con temperatura superiora 20"C, el volumen contenido en el recipiente sera mayory, porel contrario, menor si la temperatura es inferior a 20°C.

En las tab las siguientes se ejemplifican las variaciones de volumen por modificaciones en el continente y en el contenido.

Correcci6n de volumen, por temperaturas,
para un recipiente de vidrio de 1000 mL,
debida a la dilataci6n del vidrio
Temperatura °C 5 10 15 20 25 30
Correcci6n mL -0.39 -0.26 -0.13 0.00 0.13 0.26 Correcci6n de volumen, por temperaturas, para agua
medida en un recipiente de vidrio de 1000 mL
Temperatura °C 5 10 15 20 25 30
Correcci6n mL 1.37 1.24 0.77 0.00 -1.03 -2.30 4.2 Tecnica de calibraci6n:

4.2.1 Elementos para contener Uquidos (matraces probetas, etc.)

a) Desengrasar, lavar, enjuagar con abundante agua destilada y secar el elemento por contralar.

b) Cargar el elemento con agua destilada a la temperatura de trabaja.

Controlar dicha temperatura.

c) Pesar en una balanza de precisi6n adecuada el recipiente con su contenido.

d) Calcular el volumen real a la temperatura de trabaja medida en el punta b), mediante el cuadro siguiente:

Cuadro 1
Peso de agua en condiciones atmosfericas corrientes,
para obtener en un recipiente de vidrio, un litro a 20°C
y volumen de 1 g. de agua en las mismas condiciones
para diferentes temperaturas.
Peso Volumen corregido Peso Volumen corregido
delagua de 1 g. de agua delagua de 1 g. de agua
Temp. Temp.
°C g. mL °C g. mL
10 998.39 1.0016 23 996.6 1.0034
11 998.32 1.0017 24 996.38 1.0036
12 998.23 1.0018 25 996.17 1.0038
13 998.14 1.0018 26 995.93 1.0041
14 998.04 1.0019 27 995.69 1.0043
15 997.93 1.0021 28 995.44 1.0046
16 997.8 1.0022 29 995.18 1.0048
17 997.66 1.0023 30 994.91 1.0051
18 997.51 1.0025 31 994.64 1.0054
19 997.35 1.0026 32 994.35 1.0057
20 997.18 1.0028 33 994.06 1.006
21 997 1.003 34 993.75 1.0063
22 996.8 1.0032 35 993.45 1.0066 Nota: para calibrar los recipientes cuyovolumen sea diferentede 11, setoma el multiple correspondiente a los valores del peso del agua que figuran en el cuadro.

4.2.2 Elementos de escurrimiento de Jiquidos (pipetas, buretas, etc.)

a) Desengrasar, lavar, enjuagarcon abundante agua destilada y secar, el elemento por controlar.

b) Cargar el elemento con agua destilada a la temperatura de trabajo. Controlar dicha temperatura.

c) Escurrir el agua contenida en el elemento, en el interior de un recipiente previamente tarado.

d) Pesar en una balanza de precision adecuada el recipiente con su contenido.

e) Calcular el volumen real a la temperatura de trabajo medida en el punto b), mediante el cuadro anterior.

4.2.3 Calibraci6n de micropipetas fijas, de volumen variable, micro-jeringas y dispensadores.

4.2.3.1

Metodo primario (gravimetrico) (ver hoja de trabajo en psg., 23)

Materiales necesarios:

./ balanza analltica, cron6metro;

./ tsrmometro calibrado;

./ vase para pesar;

./ pinza;

./ agua destilada de alta pureza libre de gases.

Procedimiento:

a) Preparartodos los elementos necesarios para la calibraci6n y dejartos a la temperatura ambiente del laboratorio por 10 menos durante una hora.

b) Registrar en una planilla la siguiente informacion:

Caracteristicas de la pipeta por calibrar (marca, modelo, numero, etc.), capacidad, fecha, datos del operador, balanza utilizada y cualquier otro dato de interes.

c) Medir y registrar la temperatura del agua y la presion atmosferica.

d) Colocar el tip en la pipeta y descargar aproximadamente 15 volurnenes de agua en el va so de pesada y luego colocar una tapa (para mantener una superficie constante para la evaporacicn)

e) Disparar un cronornetro para medir el tiempo del total de la operacion siguiente:

f) Pesar el vasa tapado (tarar a 0 en la balanza electronica) y anotar el peso obtenido (WO)

g) Oestapar el vasa y descargar el volumen de la pipeta, tapar el vasa y pesar nuevamente (W1), repetir la operacicn por 10 menos 10 veces (W1,W2, ........ W10). Cambiar el tip de la pipeta antes de cada pesada.

h) Prepararun control de evapcracion repitiendo las operaciones d) y g), esta ultima sin la adicion de muestras, efectuando la pesada final cuando hubiere transcurrido el tiempo de la operacion g). La diferenda de peso la da la perdida por evaporacion.

Calculos:

a) Calcular el peso individual de cada muestra restando la lectura del peso inidal 0 tara de cada muestra.

b) Oeterminar el porcentaje de perdida por evaporacicn sumando todos los pesos controles y dividiando entre el nurnero de pesadas.

Error:

Determinar el peso promedio sumando todos los pesos de las muestras y dividir entre el numero de muestras.

Sumar al peso promedio la perdida por evaporacion. Calcular el volumen promedio a la temperatura determinada, utilizando la siguiente formula:

v =: Peso. Z

Z = factor de conversi6n volumen / peso, que es la inversa de fa densidad (1/0) del agua a la temperatura y presi6n determinada. En el cuadro siguiente se consignan los valores comunes de Z:

Cuadro 2
Valores comunes de Z
Temperatura Presion Atrnosferica
deJAgua mm Hg
DC
720 760 780
15 1.0019 1.002 1.002
17.5 1.0023 1.0024 1.0024
20 1.0028 1.0029 1.0029
22.5 1.0033 1.0034 1.0035
25 1.0039 1.004 1.0041
27.5 1.0046 1.0047 1.0047
30 1.0053 1.0054 1.0055 Para terminar se dira que el error se calcula mediante la siguiente formula:

EO/O =:

v-v

_____ 0 __ x 100

donde: V Va

=

es el volumen promedio calculado es el volumen esperado

=

Precisi6n:

Se calcula aplicando ta siguiente ecuaci6n:

L (Wi - W)2
Sd ul, = X Z
N - 1
donde: peso inicial
Wi =
W = promedio de los pesos medios
N = numero de muestras
Z = factor de conversion volumen/peso Coeficiente de variaci6n:

Se calcula aplicando la siguiente ecuaci6n:

CV% =

Sd ----X 100

V

4.2.3.2 Metodo Secundario (espectrofotometrico) (ver hoja de trabajo en pag., 24)

Materiales necesarios:

./ soluci6n madre de dicromato de potasio (K2Cr207) conteniendo 10.00 9 por litro;

./ espectrafot6metra;

./ tubas de ensaya;

./ matraces y pipetas calibradas;

./ agua destilada libre de gases;

./ soluci6n de acldo sulturico 0.005 M (diluyente).

Procedimiento:

Preparar diluciones partiendo de la soluci6n madre de dicromato de potasio: 1/100, 1/200, 1/500 Y 1/1000 empleando matraces y pipetas calibradas y utilizando como diluyente la soluci6n de acido sulfurico 0.005 M.

Medir las absorbancias de las diluciones y construir una curva de calibraci6n.

Determinarlos parametres operativos y registraren planilla de archivo (caracteristicas de la pipeta, capacidad, fecha, datos del operador, espectrofot6metro utilizado, etc.)

Preparar por 10 menos una serie minima de 10 tubos de ensayo, y con una pipeta volurnetrica calibrada introducirles soluci6n diluyente en volumen acorde a la pipeta que esta caubrandose, sequn el siguiente cuadro:

Cuadro 3
Volumen de la pipeta Diluyente Diluci6n
10 ul 1.00 mL 1 1101
10 ul 5.00 mL 1/501
20 ul 5.00 mL 1/251
20 ul 10.00 mL 1 1501
50 ul 10.00 mL 1/201
100 ul 10.00 mL 1/101 Colocar el tip en la pipeta y descargar en cada tubo que contiene el diluyente una muestra de la soluci6n madre de dicromato de potasio, cambiando el tip para cada muestra.

Agitar y determinar la absorbancia de cada tuba

Calculos:

Detenninarel promedio de las absorbancias (Ab) sumando todas las lecturas obtenidas y dividiendo entre el nurnero de muestras.

Error:

Detenninarel porciento de error (EO/O) mediante la aplicaci6n de la siguiente ecuaci6n:

v-v

o

EO/O =

x 100

donde:

A

-

V =

=

promedio de absorbancias Absorbancia extrapolada de la curva patr6n de acuerdo a la diluci6n utilizada

Volumen esperado

=

=

Precisi6n:

Para el calculo de la desviaci6n estandar aplicarla siguiente formula:

-

1: (Ai - A)2

Sd III =

x --

N - 1

Coeficiente de variaci6n:

Calcularlo mediante la siguiente ecuaci6n:

Sd

CV% =

---x100

4.2.3.3 Metodo para comparar la precisi6n entre tipos diferentes de tips

Con esta metodologia puede estudiarse de manera comparativa las calidades de diversos tipos 0 marcas de tips, y decidir en consecuencia los que se adapten a los requerimientos analiticos establecidos.

Es importante tener en cuenta que una de las principales fuentes de error en el usc de pipetas autornatlcas es la variaci6n en la calidad de los tips, dado que las fallas mas frecuentes son por inserci6n deficiente, imperfecciones en el interior que alteran el volumen, etc.

Materiales necesarios:

./ espectrofot6metro 0 colorimetro;

./ pipeta volurnetrica calibrada de 5 mL;

./ pipeta autornanca de 1 00 ~L;

./ tubos de ensayo;

./ soluci6n de rojo de fenol al 0.1 % en agua destilada;

./ soluci6n de hidr6xido de sodio 0.05 N.

Procedimiento:

En este metodo se describe un estudio comparativo entre dos tipos de tips identificados como A y B:

Seleccionar 60 tubos de en sa yo limpios y secos y separarlos en dos grupos de 30 cada uno, que se identifican A1 -> A30 y 81 -> 830.

Mediante la pipeta volumetnca de 5 mL., descargar en cada tubo 5 mL., de hidr6xido de sodio 0.05 N. Efectuar la operaci6n en forma alternada (A1,81,A2,82 ...... An.Bn), as! se dividlran los errores imperceptibles entre los dos grupos, como aquellos causados por fatiga, impaciencia, etc.

Con una pipeta automatlce descargar 0.1 mL., de rojo de fenol en cada tube, usando tips A y 8 para cada serie de tubos y alternando la operacion (A,8,A,8, ..... ). Agitar los tubos y leer a 540 nm contra un blanco de hidroxido de sodio 0.05 N. Tambien leer en forma alternada (A,8,A,8, ..... ) y registrar las lecturas de manera separada.

Calculos:

Desviaci6n estandar:

Sd ul, =

!: (Xi - X)2

N - 1

Coeficiente de variaci6n:

Sd

CV% =

--- x 100

v

Donde:
X =
X =
N = valor de absorbancia promedio de absorbancias

nurnero de muestras por cada serie de tips

Interpretaci6n:

EI tip 0 marca de tip que posea un Coeficiente de Variaci6n mas bajo sera el de mayor precision.

CUADRO 4. HOJA DE TRABAJO GRAVIMETRICO
VERIFICACION DE LA CALIBRACION DE UNA PIPETA
PIPETA N Frecuencia de reemplazo de tips
Balanza N
VOLUMEN (Vo) mL N de muestras
Tipo de TIP
TECNICO N de controles
Tiempo del cicio seg

OIA Ultimo control
PRESION ATM. (P) mmHg
Temp. agua: Inicial C
Final C Z

DATOS BAsICOS cALCULOS POSTERIORES
I Peso Wi neto ei Peso Evap. Ne10 II rN, - W) rN, -W)' I
MUESTRA acurnulativo peso mueslra Peso Perdido
(Wt1) (mg) (mg)
TARA
CONTROL
1
2
3
4

29
30
CONTROL
CAlCUlOS:
-
W (Peso Promedio) = ~ Wi 1 Ni = mg
_.! (Peso perdido promedio) = ~ ~I NO ~ mg
'!Yo (Peso promedio corregido) = W+ e = mg
V (Volumen medido) = W x Z= ul
Precision = Vol. medido - Vol. ideal x 100 = %
Vol. ideal
Oesv. Estandar (O.S.) = ) ~ (Wi -Wf x z \
N -1
-
C.V. = O.S.I V x 100 = %
CUADRO 5. HOJA DE TRABAJO ESPECTROFOTOMETRICA
VERIFICACI6N DE LA CALIBRACI6N DE UNA PIPETA
PIPETA N Frecuencia de reemplazo de tips
Soluci6n

VOLUMEN (Vo) mL Diluci6n
Tipo de TIP
TECNICO N de muestras
Es pectrofot6m etro
DIA Ultimo control
ESTANDARES A
A Curva AoNo
B Pendiente Vo
C r=
D Ao=
E
DATOS BAsICOS CALCULOS POSTERIORES
MUESTRAS I Ai Absorbancia observada I I (Ai - A) (AI-A) I
1
2
3
4

29
30
CONTROL
CALCULOS:
-
A (Absor. Promedio) = r: Ai I Ni =
V (Volumen promedio) = A x Vo = ul
Ao
Precisi6n = Vol. medido ~ Vol. ideal x 100 = %
Vol. ideal
Desv. Estandar (D.S.) = J E ~A~ ./)2\ x Vo lAo

C.V. = D.S. (V x 100 = %
CAPiTULO 5

CONTROL Y CALIBRACION

DE INSTRUMENTOS

5.1. Calibraci6n de equipos de calefacci6n y refrigeraci6n:

Todo laboratorio de analisis toxicologico debe contar con equipos de refrigeracion (heladera y congelador) para conservar las muestras, reactivos, soluciones de referencia, etc.; asi como estufas y banos con termostato para los procesos de deshidratacion, secado, determinaciones enzlmaucas, incubaciones, etc.

En todos los casos es indispensable conocer con exactitud la temperatura de trabajo y la regularidad de la misma, en virtud de que pueden darse variaciones significativas en la temperatura de consarvaclon de una muestra 0 un reactive, 0 bien, durante la reallzaclon de un estudio enzlmauco, y con ello ocasionar resultados erroneos.

EI denominador cormm es la temperatura, de modo que la responsabilidad del analista es conocerla con exactitud. Para medirla se recurre al claslco term6metro de mercurio 0 a un termemetrc electr6nico. EI rnetoco mas frecuente es el term6metro clasico, asl que es indispensable trabajar con term6metros calibrados y controlados en ellaboratorio.

EI termometro mas cornun es el que se fundamenta en la variacion del volumen de mercurio, que actua como sustancia termometrica, y que varia en relaci6n lineal con la temperatura

entre -39°C Y 360°C. Para temperaturas inferiores se utilizan alcoholes y para las muy elevadas se emplean pirornetros opticos, electrorucos, etc.

5.1.1 Calibraci6n de un term6metro de mercurio:

5.1.1.1

Punto fijo inferior:

En un recipiente de 500 mL., de capacidad colocar agua y hielo, dejar estabilizar el sistema durante 10 minutos y luego sumergir el bulbo del termornetro, esperar 3 minutos y leer 10 que indica la columna mercurial.

De esta forma se calcula el valor de lo 0 Error de Cero. Si la lectura obtenida es distinta de cero cada vez que se utilice el termornetro. debera aplicarse una correcclon L1a, donde:

=

tf - ~

tf = DoC puesto que se utilize el sistema de agua-hielo, por 10 tanto:

5,1.1.2

Punto fijo superior:

Para determinar este valor debe utilizarse un dispositlvo (grafico 2) que permita sumergir totalmente el termometro en vapores de agua hirviendo. Esta condiclon se logra si se emplea un balon de destllacion,

EI termornetro no debe tocar las paredes del dispositivo ni estar sumergido en el agua. LLevar el agua a ebullicion mediante calentamiento directo y pasados 5 minutos efectuar la lectura termornemca, que lIamamos t100

Grafica 2

5.1.1.3

Determinaci6n de la temperatura de ebullici6n (te)

A presi6n atmosterica normal, la temperatura de ebullici6n del agua es 1DDDC. Por cada mm de mercuric (mm Hg) de variaci6n de la presi6n atmostenca, el punto de ebullici6n varia 1/27DC., por 10 que la temperatura de ebullici6n del H20 (te) en nuestras condiciones de trabajo sera:

te

= 1DODC + (hD - 760)

1

x --

27

Donde hD = es la presi6n atmostsrtca en el momenta de la experiencia.

5.1.1.4 Criterio de exactitud: 0: de un term6metro

Se denomina criterio de exactitud (0:) de un term6metro a la relaci6n existente entre el grado exacto y el grado inexacto.

Si en el experimento se encuentra lo y t100 Y coincide con ~ (O°C) Y t1oo' cada divisi6n del term6metro correspondera a 1°C 6 grado exacto. Si dichos valores son diferentes, cada divisi6n del term6metro sera inexacta. Por 10 tanto:

° exacto

0: =

----- =

° inexacto

Debido a que trabajamos con agua ~ = 0

Por 10 tanto para que un term6metro sea exacto el 0: debe ser igual a 1 y ta = O.

Si el term6metro que utilizamos esta afectado de error, la lectura real se obtiene aplicando la siguiente ecuaci6n:

Lc = (U + .60) . 0:

Lc = lectura corregida

U = lectura inicial

Todos los term6metros que se utilicen deberan ser convenientemente identificados (grabados) y calibrados siguiendo la norma descrita.

5.1.2 Ejemplodecalibraci6ndeunterm6metro de mercurio

Datos experimentales:

Punto fijo inferior ta = -0.5 "C

Punto fijo superior t100 = 100.5 DC

Presi6n atmosterica 760 mm Hg

CAiculos:

~ = ~ - ta = 0 - (-0.5) = 0.5

1

te = 100 "C + (763-760). - - 100.11 "C 27

100.11

a,=

=

= 0.991

100.5 - (-0.5)

Aplicaci6n practlca:

Lectura termometrica......... 38.5 "C (l,)

La lectura corregida (Lc> se caleula aplicando la ecuaci6n

Lc = (38.5 + 0.5) . 0.911 = 38.6 "C

5.1.3 Control de aparatos:

Todas las heladeras, congelador, estufas, banos con termostato, etc. deberan controlarse a diario utilizando para ello term6metros calibrados, asentando los valores en registros en los

que debe constar: tipo de aparato controlado, fecha y hora, temperatura deseada, temperatura medida, operador.

5.2 Calibraci6n de la balanza:

Todas las operaciones anallticas, requieren del empleo de la balanza.

La preparaci6n de reactivos, de patrones, pesada de muestras, calibraci6n del material volurnetrtcc, etc. son operaciones rutinarias ligadas estrechamente al uso de la balanza anatltica.

EI empleo casi permanente de la balanza demuestra la importancia de conocer su exactitud, de establecer cualquiertipo de error, y la frecuencia de uso; pero si los operadores se cambian con frecuencia debe prestarse atenci6n a los riesgos elevados de desajuste de la misma.

La exactitud y reproducibilidad de una pes ada no depende solamente de la calidad intrinseca de la balanza utilizada sino otros tactores ffsicos y operatives que deben ser tomados en cuenta para no atectar el resultado de la misma.

A continuaci6n se describen las principales reglas que deben observarse en relaci6n con: ubicaci6n de la balanza, mesada, factores fisicos y modalidad operativa.

Estas consideraciones no reemplazan ni anulan las indicaciones especiales que para cada caso pueda hacer el fabricante del instrumento.

5.2.1 Ubicaci6n de la balanza:

La 0 las balanzas deben ubicarse, en la medida de 10 posible, en un cuarto destinado a dicho efecto, con una sola puerta de acceso y de preferencia sin ventanas.

Si bien esto no es siempre posible, es muy importante que las balanzas no se ubiquen en lugares de paso, ni en ambientes grandes con ventanas que generen corrientes de aire.

Tampoco es aconsejable que en el cuarto de balanzas se erectuen determinaciones qufmicas, preparaci6n 0 almacenado de muestras 0 reactivos, (acidos, solventes, etc.), 0 cualquierotra

actividad que por su naturaleza pueda afectar las partes vitales del instrumento.

La mejor posici6n es en los anqulos de la habitaclon, por tratarse de las areas mas rfgidas de la editicacion y estan expuestas a menos intensidad de vibraciones.

Debe cuidarse que la radiacion solar no incida directamente sobre el instrumento como ninguna otra forma de energfa, porque con ello provocaria un recalentamiento del instrumento y afectaria su rendimiento y exactitud.

De igual forma, la cercania de las fuentes cal6ricas (estufas, equipos de aire acondicionado, ventiladores, etc.) puede provocar corrientes convectivas de aire que afectan la pesada.

Debe cuidarse que en el cuarto de balanza no se produzcan cambios bruscos de temperatura ni variaciones importantes de la misma a 10 largo del dia. En el caso de micro y ultramicro-balanzas no se aceptan variaciones de temperatura de ± 1°C.

La humedad ambiente ejerce un efecto importante sobre la pesada, pudiendo provocar variaciones significativas (dependiendo tambien de la sustancia que se pesa) que conduzcan a resultados erroneos. Por esta razon la humedad ambiente debe ser monitoreada permanentemente, de ahi que se recomiende que se encuentre entre 45% y 60%.

Debe utilizar iluminaci6n artificial, preferentemente fria y de intensidad suficiente para obtener una operaci6n correcta.

La mesada en la que se ubican las balanzas debe estar construida con materiales especiales y responder a un diseno que permita anular las oscilaciones y vibraciones del area. La proximidad a una carretera, rnaquinas, via de ferrocarril, etc., pueden ocasionar estas perturbaciones, las que pueden incrementarse segun sean las caracteristicas de construcci6n del edifico. En el plano comercial pueden obtenerse mesadas asentadas sobre elementos amortiguadores, con los que soluciona satisfactoriamente el problema de oscilaciones y vibraciones.

La carga electroestanca de los materiales plastlcos, vidrios, acrilicos, etc., utilizada en la construcci6n de cajas de protecci6n, coberturas, accesorios, etc. representa otrofactorde perturbaci6n y que debe tomarse en cuenta porque puede influiren el resultado de la pesada. A fin de minimizar este efecto, es recomendable la

aspersion con un a nti estati co de los que se ofrecen habitual mente en el comercio sobre todas las superficies seflaladas.

5.2.2 Operaci6n de la balanza:

Si bien la ejecuci6n de una pesada es una operacion de gran trascendencia, el operador debe tomar todos 10 recaudos y previsiones para poder realizarla con absoluta exactitud en el menor tiempo posible. Ambos objetivos, exactitud y rapidez, no se contraponen sino que, en este caso, se complementan. Si se prolonga el tiempo de la pesada, aumenta el riesgo de que factores ambientales tales como vibraciones, variaciones de humedad y temperatura, corrientes de aire, etc., influyan sobre la pesada y con ello se prevoque un error de magnitud variable.

Encendido: la balanza debe estar conectada permanentemente a la red electrica y debe encenderse por 10 menos 60 minutes antes de su empleo.

Calibrado: cuando se trata de balanzas anaHticas electrornecarucas, es necesario contar con una pesa patron, generalmente de un gramo (casi siempre provista con fa balanza), con la que se procedera a la veriticaclon y calibraci6n de la escala en forma semanal, asentando los valores obtenidos en una planilla.

5.3 Centrifugas:

Son aparatos utilizados para acelerar el proceso de sedimentaci6n, aprovechando la fuerza centrifuga generada por un rotor de velocidad variable.

Su empleo permite separar rapldarnente las partlculas suspendidas en el seno de un liquido, romper emulsiones, lavar precipitados, etc.

Constan baslcarnente de un cabezal que puede ser horizontal 0 en anqulo fijo, en el que estan contenidos los portatubos; un eje conecta el cabezal con el motor cuya velocidad puede regularse de acuerdo con las necesidades del trabajo. Por

10 general poseen un sistema de reloj que permite fijar el tiempo de centrifugado.

Todo el conjunto esta balanceado dinarnicamente, a fin de evitar vibraciones y desequilibrios que afecten el instrumento o produzcan roturas de tubos con la consiguiente perdida de la muestra.

EI rendimiento y la duraci6n del instrumento dependera

de:

5.3.1 Mantenimiento preventivo:

a) Lubricaci6n: cumplirestrictamentecon las indicaciones del fabricante respecto de la frecuencia y los puntos por lubricar, utilizando los aceites 0 grasas adecuadas.

b) Circuito electrico: revisar con periodicidad las conexiones, bornes, puesta a tierra, etc. cuidando que no existan alteraciones, falta de aislamiento 0 cualquier otro tlpo de falla en el cableado, ademas de los elementos del circuito etectrico. Reemplazar 0 reparar de inmediato las anormalidades que surjan.

c) Motor: control peri6dico de carbones, rulemanes, aislamiento, etc. Reemplazar 0 reparar de inmediato las anormalidades que surjan.

d) Calibraci6n: la velocidad se regula, por 10 general, con una lIave de puntos 0 un potenciometro. que presenta un cuadrante numerado. Estos numeros son s610 puritos de referencia y no signifiean numero de revoluciones por minuto (rpm). Es importante eonocer las rpm del aparato para calcular la Fuerza Centrifuga Relativa, sequn la siguiente ecuaci6n:

rpm

FCR = 1.12 r( )2

1000

donde:

r = radio medido desde el centro del eje de rotaci6n

hasta el fonda de la camisa protectora de los tubos.

rpm = revoluciones por minuto, que pueden medirse con un estroboscopio 0 un tac6metro mecanlco 0 electr6nico.

5.3.2 Operaci6n:

a) La condlclon fundamental para el uso correcto y eficiente de toda centrifuga, es el equilibrio y balanceo del cabezal y portatubos.

Por 10 general el fabricante identifica con letras 0 nurneros las correspondencias entre los portatubos y su posicion en el cabezal. Controlar que no existan cambios en dichas posiciones antes del uso del aparato.

b) Mediante una balanza adecuada, equilibrar con todo cuidado cada tubo con su opuesto en el cabezal.

c) Iniciar la operacion del centrifugado en forma lenta y progresiva hasta alcanzar la velocidad deseada.

d) No abrir la centrifuga durante su funcionamiento y solo hacerlo cuando se haya detenido totalmente el rotor.

e) Limpiar de inmediato cualquier derramamiento de Ifquido y retirar todo el material (soil do 0 liquido) que pudiera haberse derramado por la rotura del tubo.

5.4 Fotocolorimetros y Espectrofot6metros

La fotometria bajo sus diferentes formas, absorci6n y ernlslon, en distintas regiones del espectro: visible, ultravioleta, infrarroja, etc. constituye una tecnica de singular trascendencia y multiples aplicaciones en el laboratorio toxicol6gico.

La comparaclon cotcrimetnca mas simple, 0 el barrido espectral de derivadas mas complicado, requieren del empleo de instrumentos, que a pesarde su diferente grado de complejidad, reconocen en su configuraci6n los mismos componentes, a saber:

a) un circuito electrico alimentado exteriormente

b) una fuente de energia radiante (lam para de tungsteno, de mercurio, de catodo hueco, etc.)

c) un selector de longitud de onda (riltros de vidrio, filtros de interferencia, red de difracci6n, prisma, etc.)

d) celda portamuestra (tubos, cubetas, atomizador, etc.)

e) un camino 6ptico (espejos, cristales, etc.)

f) detector (celda totoelectrlca, fotovoltaica, tubo fotomultiplicador, etc.)

g) un instrumento (galvanometro, lector digital, registrador, una micro-computadora con pantalla, etc.)

Del correcto funcionamiento de todas estas partes, dependera la exactitud y precision del equipo utilizado y, en consecuencia la validez del resultado que se obtenga.

5i bien los fabricantes de algunos instrumentos detallan la metodologia a seguir para calibrar y controlar los mismos, en

esta secclon se describen procedimientos confiables para calibrar dichos equipos, divididos en fotocolorimetros y espectrofotornetros.

Fotocolorimetros:

Son instrumentos simples, ldoneos para trabajos en el range visible del espectro (400-700 nrn), que utilizan filtras de vidrio, de diferentes colores, para seleccionar la longitud de onda.

Espectrofot6metros:

Son instrumentos de mayor compJejidad, cuya posibilidad de trabajo se extiende desde el ultravioleta cercano hasta el infrarrojo cercano (240-1000 nm). Pueden ser de simple 0 doble hazy algunos ofrecen la facilidad de barrerel espectro de manera autornanca.

5.4.1 Calibraci6n:

En todos los casos se recomienda realizar la callbraclon por 10 menos cada seis meses, asentando en una plan ilia toda la informacion relacionada para identificar el instrumento, las condiciones de trabajo, operador, resultados, fecha, diferencias entre lecturas obtenidas y esperadas, etc.

Existen diferentes metodos de caltbracion pero los mas practicos y eficaces son los que emplean filtros de vidrio de oxldo de holmio u oxido de didimio. Estos fHtros poseen ta particularidad deabsorberenergia a diferentes longitudes de onda, presentando picos caracteristicos y constantes que se toman como valores de referencia.

Por ejemplo, para el filtro de oxide de holmio se obtienen los picos (de diferente tamario y posibilidad de deteccion, sequn las caracteristicas del instrumento) que se tabulan a confinuacicn:

Cuadro 6
Pica N Max., nm
1 241.5
2 279.3
3 287.6
4 333.7
5 360.8
6 418.5
7 453.4
8 536.4
9 637.5 La operaci6n de calibraci6n, nos permitira establecer la diferencia 0 concordancia entre los picas obtenidos en nuestro instrumento y la longitud de onda correspondiente a los mismos, segun la tabla transcrita.

Otras metodologias mas sencillas, perotambien precisas, recurren al empleo de diferentes soluciones que absorben la luz espectral en longitudes de onda fijas:

Las principales son:

a) Soluci6n de cromato de potasio al 0.04 9 por litro, disuelto en hidr6xido de potasio 0.05 N. Esta soluci6n presenta des rnaxirnos de absorci6n a 273 y 373 nm, correspondlendoles absorbancias de 0.189 a 0.199 y 0.247 a 0.249 respectivamente.

b) Seluci6n de dicromato de potasio al 0.05 9 por litro disuelto en acldo sulturtco 0.01 N. Esta soluci6n presenta dos maximos de absorci6n a 257 y 350 nm, correspondiendoles absorbancias de 0.580.

c) Soluci6n de sulfato de niquel al 0.1 g por litro, disuelto en acido sulturico 0.01 N. Esta soluci6n presenta un maximo de absorci6n a 510 nm.

Estas soluciones son estables y pueden ser envasadas hermencamente en los tubos 0 cubetas utilizados en la lectura, y de esta manera sirven para los controles rutinarios que aseguren una respuesta del instrumento constante y repetitiva. Todas las soluciones deben prepararse con drogas de calidad anallnca.

5.4.2 Operaci6n:

a) Encenderel equipo porto menos 20 minutos antes de su empleo, para estabilizarlo adecuadamente.

b) Controlarel cero mecanico yel cero 6ptico, verificando su estabilidad durante por 10 menos 5 minutos.

c) Controlar la limpieza de las cubetas y/o tubos de lectura.

d) Controlar la limpieza de los filtros.

e) Efectuar las lecturas controlando peri6dicamente el cero y los sstandares.

f) En todos los casos, respetar las recomendaciones del fabricante del instrumento.

5.4.3 Mantenimiento:

A fin de garantizar el funcionamiento y el rendimiento de los instrumentos, es imprescindible someterlos a un riguroso programa de mantenimiento. Casi todos los equipos estan acompaliados de un manual que describe el correcto mantenimiento del mismo. Es necesario aplicarto met6dicamente para poder obtener su maximo aprovechamiento.

5.5 Peachfmetros

Su empleo es muy frecuente en ellaboratorio analitico y se utiliza para controlar el pH de muestras, de reactivos, de soluciones valoradas, soluciones buffers, etc.

Los equipos de la actualidad son de gran precisi6n y extrema sensibilidad, y algunos permiten el usc de electrodos especfficos con los cuales pueden realizarse determinaciones de interes toxicol6gico, (por ej. fluoruros en orina).

Es necesario en su empleo lIevar a cabo una calibraci6n con soluciones de pH conocido, en tres puntos de la escala: 5.0, 7.0 Y 9.0 . Estas soluciones ya pueden conseguirse preparadas y garantizadas en su titulo.

CAPiTULO 6

SELECCION DE METODOS Y

,

ESTANDARES

En ta actualidad puede contarse con variados rnetodos para la determinacion cuali-cuantitativa de la mayoria de las sustancias de interes toxicolcqico, gracias al enorme desarrollo que ha alcanzado la toxicologfa analftica a partirde la mcorporacion de la anaHtica instrumental y sus multiples variantes.

Elegir un determinado rnetodo dependera de numerosas circunstancias que van desde la disponibilidad de equipos y estructura operativa idoneos para detectar residues de alguna sustaneia, hasta tecnlcas cclorlmetricas 0 empleo de papeles sensibles, si no se cuenta con los recursos 0 bien los requerimientos analiticos toleran esta metodologfa.

Existe una serie de condiciones 0 caracterlstlcas que no deben perderse de vista al seleeeionar un rnetodo anaLitico.

Elias son:

6.1 Precisi6n:

Tal como se senate con anterioridad la repetitividad sera la que arroje el resultado en los multiples anal isis, independientemente del verdadero valor correspondiente a la sustancia analizada. EI calculo de la Desviacion Estandar es la forma rnaternatlca de medir la precision de un rnetodo, y se realiza mediante la siguiente ecuaclon:

1: (Xi - X)2

Sd J.lL =

N -1

Donde:

Xi = resultado de cada muestra

X = media aritrnetica del total de resultados

N = nurnero de resultados

6.2 Exactitud:

Es la proximidad entre el resultado obtenido y el valor real de la sustancia analizada.

EI calculo del error de un metoda, es el reflejo de la exactitud del mismo, y se hace aplicando la siguiente ecuaci6n:

X· Xref

Error % =

x 100

Xref

x =

media antmetica de n determinaciones de un EsUmdar de Referencia

concentraci6n certificada del Estandar de Referencia analizado

Xref =

6.3 Recuperaci6n:

Es un ensayo de gran utilidad que establece la presencia de sustancias interferentes y proporciona informaci6n sobre la eficiencia del metoda.

Consiste en analizar dos allcuotas de la misma muestra, a una de las cuales se Ie adiciona una cantidad conocida exactamente de la sustancia analizada.

EI ensayo debe repetirse n veces empleando tres nivele' de concentraclon: bajo, medio y alto, calculados a partir de la concentraciones esperadas 0 supuestas.

EI por ciento de recuperaclon se calcula aplicando siguiente ecuaclon:

C ('-1+T) - CM
R% = x 100
CT
Donde:
C(M+TJ = concentraci6n de 18 muestra mills testigo
CM = concentracl6n de la muestra
CT = cantidad agregada La recuperaci6n te6rica siempre deberia ser del 100%, pero en la practica se consideran recuperaciones satisfactorias las compre'ndidas entre 95 y 105 %.

6.4 Sensibilidad:

Es la concentraci6n menor de un analito que puede determinarse indubitablemente, en las condiciones analiticas fijadas con anterioridad. Se calcula con la siguiente ecuaci6n:

R

S =

C

Donde:

R = senal de respuesta del instrumento C = concentraci6n de la sustancia

6.5 Limite de detecci6n:

Es quizas el mas importante de los parametres que define y caractenza que un metodo analltlco se cumpla.

Las tecnicas incluyen en muchas ocasiones diferentes procesos 0 tratamientos (disolucion, mlneraltzaclon, extracclon, cornplexacion, etc.) hasta lIegar a la fase instrumental de cuantificacion, por 10 que es necesario tener presente que cada etapa 0 proceso introduce variantes que condicionan ellimite de deteccion y que por 10 general 10 modifican.

Portal motivo se definen tres conceptos relacionados con ellimite de deteccion, a saber:

6.6 Limite de detecci6n del instrumento (LOI):

Es la serial generada por el instrumento, cuya intensidad es dos veces mayor a la desviaclon estandar calculada para el ruido de fondo del equipo.

EI LDI puede determinarse con el 95% de confiabilidad, aplicando la siguiente ecuaclon:

LDI = t(n_1) X 5d

6.7 Limite de detecci6n del metoda (LOM):

Es la cantidad menordel anal ito, disuelto en agua dastllada, que produce en el instrumento una serial estadfsticamente diferente a la generada por el blanco, en iguales condiciones de procesamiento tecnico. La siguiente ecuaci6n permite su calculo:

-

LDM = 5s + t (n-1) • Sd

Donde:

-

Se = promedio de seriales 0 lecturas del blanco

t (n-1) = es la distribuci6n de la prueba T de

Student's para n-1 grados de libertad, con un 95% de confiabilidad (n = 7 0 mas)

Sd = desviaci6n estandar de las lecturas

6.8 Limite de detecci6n practice (LOP):

Es la cantidad menor del analito, presente en la matriz, que produce en el instrumento una serial estadistieamente diferente a la generada por el blanco en iguales condiciones de procesamiento tecnico.

Para el calculo se apliea la misma ecuaci6n que para el

LDM.

6.9 Limite de cuantificaci6n (LC):

Es un valorarbitrario fijado con la aplieaci6n de la ecuaci6n:

LC = La + 10 Sd

Donde:

La = es el promedio de n lecturas del blanco

Sd = es la desviaci6n estanoar de las lecturas

EI limite de cuantificaci6n es un valor que garantiza la calidad de los resultados analiticos y asegura que los datos obtenidos se correlacionen indubitadamente con la cantidad de analito presente.

En el siguiente esquema se representan todos los parametres definidos con anterioridad.

l

I I I

Grafica 3

LOI

LOM

LOP

LC

Cero

Blanco Lb

Lb + 10 Sd

6.10 Especificidad:

Es la condiclon de un metoda analitico que garantiza la posibilidad de identificaruna sustancia de forma certera, anulando el etecto de interferencias 0 de otros contaminantes.

6.11 Reproducibilidad:

Es la caracteristica de una metodologia, que aplicada por diferentes operadores en distintas oportunidades y diferentes lugares, permite obtener resultados similares.

6.12 Estandares:

Es indispensable el uso de Sustancias de Referencia Certificadas (SRC) 0 Materiales de Referencia Certificados (MRC) y deben incorporarse a la pracnca dellaboratorio como elementos insustituibles que garanticen la calldad analitica.

La I.S.O. (International Organization for Standarization) define a los Estimdares de Referenda como sustancias 0 materiales cuyas propiedades son conocidas con tal exactitud que pueden utilizarse para:

a) Desarrollo V evaluaci6n de metodos:

verificaci6n y control de la precisi6n y exactitud de tecnicas analfticas;

desarrollo de rnetodos "patrones" de analisis; validaci6n de especificidad de rnetodos anallticos: control de rnetodos de campo.

b) Determ;naci6n de residuos de contaminantes:

preparaci6n de materiales de referenda secundarios; desarrollo de protocolos para anal isis de residues de contaminantes;

uso directo en determinaciones de campo.

c) Garantia de calidad analitica

calibraci6n directa de instrumentos;

control de calidad interno (intralaboratorio); control de calidad externo (interlaboratorio).

6.12.1 Condiciones que deben reunir los Estandares de Referencia

contenido controlado y estequiometria definida de la sustancia;

homogeneidad y similitud entre los distintos lotes de fabricaci6n;

facilidad de disoluci6n; estabilidad;

compatibilidad quimica y miscibilidad.

Los Estandares de Referencia Certificados poseen el maximo grado de pureza y calJdad, y diferentes laboratorios establecen su cornposicton mediante tecnicas anallticas reconocidas.

Numerosas organizaciones suministran sustancias 0 materiales certificados, y de entre elias la Oficina Nacional de Normas de Estados Unidos (National Bureau of Standards), la Oficina de Referencia de la Comunidad Europea (European Community Bureau of Reference), el Laboratorio Nacional de Fisica de Inglaterra (National Physical Laboratory of the United Kingdom), la Oficina Nacional de Metrologia de Francia (Bureau National de Metrologie de France), eJ Instituto Nacional de Estudios Ambientales de Japan (National Institute for Environmental Studies, Japan), son las mas conocidas.

6.12.2 Estandares Secundarios:

Utilizados habitualmente en el laboratorio se obtienen a partir de sustancias puras y contrastados frente a Estandares de Referencia utilizando metodos analiticos de reconocida confiabilidad.

Los mas frecuentes en analitica toxicoloqica son:

Metales: preparados a partir de muestras del metal en su estado elemental que previo desengrasado con acetona se disuelve por tratamiento acido (nltrico 0 clorhidrico). En algunos cas os se puede partir de los oxides rnetalicos cuando se conoce el grado de pureza.

Drogas: (basicas, neutras y acidas), los estandares secundarios pueden obtenerse a partir de:

a) materias primas de pureza reconocida utilizadas en la industria tarmaceutica para la elaboraclon de medicamentos;

b) extraccion de los principios activos de los medicamentos de uso corriente mediante el empleo de

solventes adecuados, purificacion posterior por recristalizaciones sucesivas y finalizar con el control de pureza por dos rnetodos analiticos diferentes (ej: punto de fusion, espectrofotometria infrarroja, cromatografia gaseosa, etc.);

Plaguicidas: como en el caso anterior, es posible partir del producto de grado tecnico utilizado por los fabricantes 0 bien aislarlo por extraccion de las formulaciones comerciales. En ambos casos debe purificarse por recristalizaciones sucesivas para, al final, controlar la pureza con el criterio expuesto para el caso de drogas.

6.12.3 Conservaclon de estimdares

Los Estandares de Referencia vienen acompanados de las condiciones de almacenamiento, forma de usc, garantia de calidad y fecha de vencimiento particulares a cada sustancia.

Los Estandare s Secundarios deben conservarse respetando las siguientes recomendaciones generales:

Metales: soluci6n madre (1000 ppm): estable 1 ana a temperatura ambiente y en frasco de vidrio color am bar. soluci6n de trabajo: preparacion diaria.

Drogas: soluci6n madre: envasar en recipientes de vidrio color am bar, conservar en retriqeraclon. La estabilidad y caducidad dependen del tipo de droga.

soluci6n de trabajo: preparacion diaria.

Plaguicidas: Organoclorados y organofosforados, en envases de vidrio con tapa hermetica, conservar en refrigeracion. La estabilidad y caducidad dependen del tipo de compuesto, pero en general no sobrepasan los seis meses.

Es indispensable emplear los estandares para controlar la exactitud de los analisis y mantener un control adecuado sobre la eficiencia y validaci6n del laboratorio.

6.13 Tiempo de ejecuci6n:

En toxicologia analltica el factor tiempo es vital y de la celeridad con que se obtenga un resultado depende la certeza del diagnostico y la posibilidad del exito terapeutico que salve una vida.

Es paradouco, pero muchas tecnicas anaHticas son laboriosas y complejas, que requieren numerosas eta pas para liegar al resultado final que se logra con insumo de tiempo prolongado. Es aqui donde la experiencia, pericia e idoneidad del qutmico-toxlcoloqo son fundamentales para elegir el rnetodo que se ajuste a los requerimientos de la situaci6n y la resuelva satisfactoriamente.

6.14 Costa:

Este es el factor condicionante y limitante de las posibilidades de desarrollo y aplicacion de la toxicologfa analltlca, EI alto costa de instrumentos y reactivos, de la infraestructura de apoyo para operar un laboratorio con equipo de alta tecnologia, as! como la necesidad de capacitar adecuadamente a los profesionales encargados del mismo, exige una elevada disponibilidad de recursos para instalar ellaboratorio, mantener un flujo permanente y lograr un adecuado mantenimiento y funcionamiento del mismo. Todos estos factores son muy importantes.

CAPiTULO 7

CRITERIOS DE OPERACION

La trascendencia y las implicaciones de los resultados generados en un laboratorio toxicoloqlco, necesitan del apoyo de una metodologia de trabajo constante y que haya probado su eficiencia. Para ello es necesario ejercer un riguroso y continuo control sobre:

7.1 Muestras:

conocimiento de las condiciones de recoteccton y transporte, envasamiento adecuado, identificaci6n clara y completa, presencia de conservadores, almacenamiento en condiciones seguras, calculo de la cantidad por utilizar y la necesidad de conservar una porci6n para futuras pruebas, etc.

7.2 Reactivos:

todos los reactivos, solventes, soluciones, etc. deben ser de maxima pureza y evitar toda posibilidad de contaminaci6n, las fechas de caducidad deben ser claras, los estancares y materiales de control deben conservarse adecuadamente.

7.3 Materiales:

todos los recipientes aparatos de medida, pipetas, etc., deben limpiarse escrupulosamente y estar libres de tad a contarninaclon, ademas de calibrarlos ala conveniencia del caso.

7.4 Equipos e instrumentos:

someterlos a programas de mantenimiento preventivo

sequn las indicaciones de los fabricantes, calibrado y control peri6dico de todos los instrumentos electronlcos.

7.5 Metodo analitico:

conocimiento profundo de los fundamentos del procedimiento, posibifidades de interferencias, tiempos en la ejecucion, modificaciones operativas 0 carnbios por nuevas tecrucas.

7.6 Procedimiento:

en toda determinacion cuantitativa deben utilizarse materiales de control de tres niveles de concentracion: bajo, medio y alto, que se mtercalaran cada diez muestras. Es conveniente introducir en la serie de determinaciones una muestra ciega (estandar certificado) para el analista, 10 que Ie permlttra conocer al responsable dellaboratorio la exactitud de operacion. La ejecucion de los analisis por duplicado es una forma segura de trabajo que debe utilizarse siempre que 10 perm ita la disponibilidad de la muestra.

7.7 Resultados:

todos los resultados deben comprobarse contodo cuidado, y ellaboratorio debe poseer un programa de control y deteccion de errores que garantice la confiabilidad de los datos obtenidos.

Es condici6n fundamental para garantizar un resultado, que este sea coincidente aplicando dos tecnicas analfticas con fundamentos 0 principios diferentes y para la confirmacion del mismo se debe recurrir a la cromatografia en fase gaseosa con espectrometria de masas.

Las tecnicas habituales de "screening" por ej.: cromatografla en capa fina, Elisa, etc. son solo orientativas y los resultados deben ser confirmados necesariamente mediante la aplicacion de otras tecnicas.

CAPiTULO 8

DETECCION DE ERRORES

EI error de un resultado analitico (R), es la diferencia que existe entre dicho valor y el resultado real (V) correspondiente a la muestra analizada. La ecuacion:

E = R - V

grafica el error, que puede ser de signo variable.

En general, los errores se dividen en aleatorios y slstematicos.

EI error aleatorio: es el que se comprueba repitiendo n veces el anal isis de una muestra en forma slrnultanea. y se evidencia pordiferentes resultados que se obtienen con diferente grado de dispersion.

A esta dispersion, que no puede pronosticarse que esta siempre presente y genera una cierta incertidumbre con respecto al valor verdadero, se Ie denomina aleatorio.

Los factores responsables de este tipo de error son multiples, como pueden ser: contaminaciones, variaciones de los volurnenes medidos, tiempos de las reacciones qui micas, estabilidad de los instrumentos, diferencias de tension en la linea etectrica, etc.

EI error sistematico: es el que se introduce en el proceso analitico y que provoca una tendencia en el resultado obtenido, de modo que este sea siempre mayor 0 menor que el valor real.

La media de n resultados anaHticos de una misrna muestra, se aproxima a un valor definido J.1, a medida que aumenta el numerc de resultados. Cuando J.1 difiere del valor real (V), se dice

que existe un error sistematico de magnitud B que responde ala ecuaci6n:

B = J.1- V

La diferencia fundamental entre el error aleatorio y el error sistematico, radica en que este ultimo puede pronosticarse y medirse, 10 que hace posible introducir modificaciones para su correcci6n.

La caracteristica fundamental del Control de Calidad Interno de un laboratorio analitico, es la de l1evar un registro de toda la actividad adecuado y permanente, abarcando desde las modificaciones en las tecnicas utilizadas, cambios de estandares, reactivos nuevos, etc. y, en especial conocer la exactitud y precision de los resultados que genera, a traves de un programa de anal isis de error operativo.

Toda serie de resultados debe incluir una muestra control de valor conocido, a la que debe asignarse un limite para la aceptaclon del resultado obtenido en dicho control.

Este limite puede variar entre el ± 2% y el ± 10% dependiendo de las posibilidades analiticas (metodo, instrumentos, muestra, requerimientos clinicos, etc.)

Cuando el resultado del control excede ellimite fijado con anterioridad, debe rastrearse la causa y analizar la serie de nuevo.

Por 10 general los cambios en la calidad analitica no son abruptos sino que ocurren en forma lenta y dificil de percibir, sobretodo cuando el tipo de analisis que se efectua no es rutinario o frecuente, pero que pueden ponerse en evidencia aplicando un rnetodo grafico.

Uno de los metcdos graficos de facil apllcaclcn es el CUSUM (C) (del ingles cumulative sum). Consiste en la suma acumulativa de la diferencia positiva 0 negativa entre el valor analltlco obtenido y el valor promedio definido con anterioridad en la muestra control, 0 sea:

-

C = r (Xc - X)

donde:

Xc = resultado analitico del control

X = resultado promedio definido can anterioridad del control

EI Cusum se basa en un valor promedio de 100, asignado ala concentraci6n real del control y su representaci6n en funci6n del tiempo.

Ejemplo: para una muestra control de plorno en sangre, cuya concentraci6n real es 60 J.l.g % (100%) tenemos los siguientes resultados:

Cuadro 7
CONTROL DE CALI DAD (valor asignado = 100 )
DESVIACION
DiA DEL VALOR
ANALISIS RESULTADO ASIGNADO CUSUM
1 100 0 0
2 102 2 2
3 101 1 3
4 99 -1 2
5 97 -3 -1
6 98 -2 -3
7 100 0 -3
8 102 2 -1
9 98 -2 -3
10 102 2 -1
11 106 6 5
12 101 1 6
13 102 2 8
14 103 3 11
15 103 3 14
16 103 3 17 La graficaci6n de estos resultados nos muestra claramente el fen6meno producido.

Grafica 4

CUSUM
20


15 -

10 - •


5- •
• • •
0 • • •
• • •
-5 - .10 -

-15 -

o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dras de analisis

A partir del dta 10 se observa una variaci6n en la calidad analitica porque aparece una tendencia permanente que modifica sustancialmente el resultado del control indican do la aparici6n de un error sistematico que debe determinarse y eliminarse.

Las variaciones que se observan en los resultados obtenidos entre los dlas 1 y 10 se deben al error aleatorio.

La aplicaci6n de una variante del Cusum nos permite contar can un criteria efectivo para validar un resultado, a bien el rechazo del mismo.

EI metoda de evaluaci6n, Cusum comienza a funcionar cuando un resultado graficado como un punta excede los limites prefijados, denominados linea F (que corresponde ala desviaci6n estandar de la media), acumulando los valores.

Si algun resultado del analisis control regresa a la region delimitada por las lineas F, el Cusum se detiene y adquiere valor O.

Si un resultado excede los IImites F, el Cusum comienza a acumularse de nuevo.

La validacion del resultado, se define con un limite de aceptabilidad que por 10 general es un multiplo de la desviacion estandar (nunca mayor a 3). Cuando el valor del Cusum de un resultado analltico excede el limite de aceptabilidad, debe rechazarse dicho resultado.

Lo descrito puede ejemplificarse de la siguiente manera:

Condiciones:

Linea F = ± 1 Dssviacicn Estandar

Limite de aceptabilidad = 2.7 Desviaciones Estandar

Cuadro 8
ANAuSIS RESULTADO DESV. VALOR ESTADO
N CONTROL STD. DE LA DEL DEL CUSUM
MEDIA CUSTUM
1 102 0.2 0 --
2 103 0.6 0 --
3 98 -0.4 0 --
4 107 1.4 0.4 comienza
5 110 2 1.4 acumula
6 97 -0.6 0 termina
7 100 a a --
8 90 -2 -1 comienza
9 94 -1.2 -1.2 acumuJa
10 91 -1.8 -2 acumula
11 93 -1.4 -2.4 acumula
12 93 -1.4 -2.8 rechaza resultado Grafica 5

5 de la media

-- Valor del CUSUM

-3 -3

o 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

An'lIsls N°

D Area CUSUM igual a cero

• Area de acumulaci6n CUSUM

• Area de anallsls rechazados

En el resultado correspondiente al anallsis numero 4, el valor de la desviaci6n estandar de la media (puntos blancos en la grafica) supera el valor de la linea F y comienza a operar el Cusum (puntos negros en la grafica), en el anallsls nurnero 5 se acumula y luego vuelve a 0 en los analisis nurneros 6 y 7.

En el resultado correspondiente al analisis nornero 8, el valor de la media de la desviaci6n estandar es -2.0 y comienza nuevamente el Cusum, que se va acumulando hasta el analisis nurnero 12, para poner en evidencia la presencia de un error sistematico. En este punto el valor del Cusum supera ellfmite de aceptabilidad (2.7) y, por 10 tanto, debe rechazarse el resultado.

En las condiciones fijadas con anterioridad de linea F:::: ±1 y Ifmite de aceptabilidad:::: 2.7, la probabilidad de rechazar un resultado correcto es de 0.002.

CAPiTULO 9

SEGURIDAD EN El

lABORATORIO

EI trabajo en ellaboratorio, al igual que toda otra actividad laboral humana, debe efectuarse respetando las normas e indicaciones que garanticen la integridad y seguridad de las personas y los bienes involucrados en la tarea.

La gran cantidad de compuestos quimicos de diversa peligrosidad, la gama variada de tareas, el uso casi permanente de equipos electricos y la combustion de gases con diferentes fines, son algunas de las fuentes que pueden generar accidentes en el laboratorio. Los posibles riesgos en un laboratorio van desde pequerias cortaduras 0 quemaduras hasta una electrocucion, pasando porposibilidades de incendio, explosiones y otros.

Para evitarlos, existen suficientes reglas, indicaciones y normas, que si se aplican y respetan adecuadamente minimizan los riesgos y garantizan un trabajo seguro.

Existe gran cantidad de informacion sobre las normas de seguridad que deben aplicarse en el trabajo de laboratorio y las precauciones que deben tenerse en el maneio de equipos y reactivos peligrosos. Es por ello que en este capitulo no se rnencionaran (consultar la bibliografla en el capitulo 10).

EI interes se centrara en los cuidados para obtener, manipular, manejar y desechar las muestras bioloqicas,

Gran parte de la analitica toxicologica utiliza muestras biologicas para investigar diver~as sustancias, tales como

plaguicidas, metales, solventes y especialmente drogas de uso illcito 0 abuso indebido de tarmacos.

La posibilidad de que estas muestras sean portadoras de agentes infecciosos y muy particularmente en este momento del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) responsable del Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirido (SIDA), obllqa a que dichas muestras se manejen con todo cuidado, desde su obtencion hasta su desecho final.

Se han relacionado unicamente a la sangre, el semen, y las secreciones vaginales y cervicouterinas con la trensmislon del HIV, sin embargo existen muchos otros humores orqanlcos, tales como el liquido cefalorraquideo, exudado pleural, pus, etc., que pueden contenerhematies 0 leucocitos y serportadores del virus.

9.1 Precauciones generales:

a) NO FUMAR, COMER, BEBER, ni almacenar alimentos 0 bebidas en ellaboratorio.

b) Cuidar que todos los recipientes que contienen muestras biologicas sean de materiales resistentes, posean cierre herrnetlco, no presenten perdidas 0 salpicaduras y se almacenen en lugares seguros.

c) Utilizarguantes desechables (latexo vinflicos) para manejar las muestras y lavarse las manos con abundante agua y jabon finalizada la tarea.

d) Utilizar anteajos de seguridad y mascara protectora de nariz y boca para el manejo de muestras que puedan producir salpicaduras, preyecciones 0 liberar gases que arrastren material solido.

e) Utilizar unicamente pipetas autornaucas, de preferencia desechables para cargar las muestras.

f) Tener siempre a mana un bldon con hipoclorito de sodio (1:10).

g) Siempre que sea posible, instalar una cabina para manejar las muestras biologicas.

h) Limpiar de inmediato cualquier derrame 0 salpicadura utilizando papel absorbente que se desechara en un recipiente para el efecto, debidamente identificado, y luego lavar el area afectada con hipoclorito de sodio.

9.2 Contacto directo 0 salpicadura con sangre:

a) Contaminaclcn con piel intacta:

- lavar con abundante agua y jabon:

- lavar con solucion diluida de hipoclorito de sodio.

b) Contaminacicn de piel no intacta, membranas mucosas, puncion con aguja 0 cortes en general:

- lavar con abundante agua y jabon;

lavar con soluci6n de agua oxigenada aI3%; lavar con soluci6n diluida de hipoclorito de sodio;

si el ingreso es a traves de la boca, lavar con abundante soluci6n de agua oxigenada al 3 %;

si el ingreso es a traves de los ojos, lavar con abundante soluci6n fisiologica. Retirar lentes de contacto si los hubiese;

ponerse en contacto de inmediato con el centro medico especializado mas cercano y notificar el accidente a fin de recibir el tratamiento correspondiente.

9.3 Derrames 0 rotura de envases:

- absorber el material derramado mediante el uso de papel adecuado, utilizando guantes;

- lavar toda el area y los elementos utilizados con hipoclorito de sodio (1 :10);

- desechar todos los materiales ufillzados en una bolsa 0 recipiente debidamente identificado.

9.4 Compuestos que liberan cloro:

La cantidad de cloro libre en la soluci6n necesaria para desinfectar correctamente es de 5 9 per litro y se obtiene con las soluciones acuosas de los siguientes compuestos en las concentraciones indicadas a continuaci6n:

Hipoclortto de sodio (5% cloro disponible) 10 %

Hipoclorito de calcic (70% cloro disponible) 0.7 %

Dicloroisocianato s6dico (60% cloro disponible) 0.9 %

Cloramina (25% cloro disponible) 2.0 %

9.5 Esterilizaci6n:

A continuaci6n se transcriben las condiciones de esterilizaci6n que garantizan la inactivaci6n (muerte) de todos los virus, bacterias y esporas.

Esterilizaci6n por vapor a presi6n durante 20 minutos a 1 atmosfera y 121 DC

Esterilizaci6n por calor seco durante 2 horas a 170 DC

Tal como se serial6 precedentemente, es fundamental que todo el personal administrative. tecnico, y de maestranza del laboratorio, conozca, recuerde, uti lice y haga cumplir estas reglas como una forma eficaz de desarrollar una tarea segura para el operador y su entorno.

Todos los elementos (envases, materiales descartables, algodones, papeles absorbentes, etc.) que de alguna manera estuvieron en contacto con muestras biol6gicas, deben ser almacenadas en lugares seguros, debidamente identificados y se debe garantizar que su disposici6n final no representa ningun riesgo para la comunidad.

Revisi6n tecnlca: Dr. Mariano Cebrian

10

BIBLIOGRAFiA

Laboratory Instrumentation, Hicks, Haven, Schenken y Mc Whorter (Editores), J.B. Lippincott Co., 1987

Control de Calidad en Laboratorios de Toxicologia Ocupacional A. Aitio Centro Panamericano de Ecologia Humana y Salud, OPS/OMS; 1986

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