Revista de Ciencia Animal

la sntesis de glicgeno, mientras que la progesterona

promueve el catabolismo del glicgeno en el tero del
visn americano ( Neovison vison )

Abstracto
La sntesis de glicgeno por el visn, el glndula uterina y el epitelio luminal (GE y LE) es
estimulada por estradiol (E 2 ) durante el estro. Posteriormente, los depsitos de glucgeno
se movilizan hasta casi completarse para satisfacer las necesidades energticas de desarrollo
e implantacin preembrionaria por mecanismos an no determinados. La hiptesis de que la
progesterona (P 4 ) fue responsable del catabolismo de las reservas de glucgeno uterino
como una de sus acciones para garantizar el xito reproductivo. El visn se trat con E2, P4
o vehculo (controles) durante 3 das y el tero recogi 24 h (E2, P4 y vehculo) y 96 h (E2)
ms tarde. Para evaluar el cebado E 2 , el visn se trat con E 2 durante 3 das, luego
P 4 durante 3 das adicionales (E 2 P 4 ) y el tero se recogi 24 h despus. El porcentaje de
contenido de glucgeno en el epitelio uterino fue mayor en E 2 + 96 h (GE = 5,71 0,55; LE
= 11,54 2,32) que E 2 +24 h (GE = 3,63 0,71; LE = 2,82 1,03) y ambos Mayor que los
controles (GE = 0,27 0,15, LE = 0,54 0,30, P <0,05). El tratamiento como E 2
P 4redujo el contenido de glucgeno (GE = 0,61 0,16; LE = 0,51 0,13), a niveles no
diferentes de los controles, mientras que concomitantemente aument la expresin del gen
de la enzima catablica (glucgeno fosforilasa m y glucosa-6-fosfatasa) Cantidad de
protena fosfo-glicgeno sintasa (inactiva) en homogeneizados uterinos. Curiosamente,
E 2 P 4 aumento glucgeno sintasa 1 mensajero ARN (mRNA) y hexokinase 1mRNA y
protena. Nuestros hallazgos nos sugieren que mientras que E 2promueve la acumulacin de
glucgeno por el tero de visn durante el estro y el embarazo, es P 4que induce el
catabolismo del glicgeno uterino, liberando la glucosa que es esencial para apoyar la
supervivencia y la implantacin preembrionarias.

Introduccin
El crecimiento pre-embrionario, la implantacin y el desarrollo fetal temprano dependen de
las secreciones de las clulas epiteliales glandulares y luminales uterinas (histotrficas) que
contienen glucosa, glucgeno, aminocidos, grasas, iones y hormonas (Burton et al ., 2002 ,
Hempstock Et al ., 2004 ). Aunque la gluconeognesis no se produce en el tero (Zimmer &
Magnuson 1990 , Ynez et al ., 2003 ), la glucosa es absorbida, transportada al lumen
uterino, metabolizada como un sustrato energtico y cuando est en exceso almacenada
como glucgeno.
La sntesis de glucgeno comienza con la fosforilacin de la glucosa por hexoquinasa que
produce glucosa-6-fosfato, que se isomeriza en glucosa-1-fosfato y se convierte en uridina-
difosfato-glucosa (Ferrer et al ., 2003 ). Las unidades de glucosilo de estas ltimas se
transfieren a los extremos no reductores de las molculas de glucgeno por la glucgeno
sintasa. El glicgeno se cataboliza por glucgeno fosforilasa, liberando glucosa-1-fosfato,
que puede ser isomerizado a glucosa-6-fosfato y entrar en la va glicoltica, o ser
desfosforilado por glucosa-6-fosfatasa, liberando glucosa para la exportacin a la circulacin
sistmica y / O lumen uterino.
El contenido de glucgeno uterino en los picos de los roedores durante el proestro al estro, y
se moviliza durante la implantacin y el embarazo (Demers et al ., 1972 ; Greenstreet &
Fotherby 1973a ). De forma similar, el tero humano almacena grandes cantidades de
glucgeno durante las fases de proliferacin tarda a secrecin temprana, que se moviliza por
la fase secretora tarda (Verma 1983 , Cornillie et al ., 1985 , Spornitz 1992 ). En el visn, el
contenido de glicgeno epitelial uterino glandular y luminal disminuy 99% entre el estro y
el perodo de peri-implantacin (Dean et al ., 2014 ). Mink son reproductores estacionales
que exhiben una diapausa embrionaria obligatoria y pueden tener blastocistos (hasta 17) en
un estado de desarrollo detenido durante 50-60 das despus del coito , lo que da lugar a una
implantacin tarda (Hansson 1947 ; Enders 1952 ). Es probable que las reservas de
glicgeno uterino de visn sean una fuente potencial de energa que apoye la supervivencia
y la implantacin preembrionarias. Como evidencia, el contenido de glucgeno uterino en
las mujeres estriles o en las que exhiben abortos espontneos disminuy considerablemente
en comparacin con las mujeres normales y, en algunos casos, ausentes (Hughes et
al. , 1963 , Rubey et al., 1965 , Maeyama et al., 1977 , Zawar et al ., 2003 , Girish et
al., 2012 ).
La sntesis de glucgeno uterino es estimulada por estradiol (E2) en ratas, conejos, cobayas
(Demers et al., 1972 , Demers et al ., 1973a ) y visn (Rose et al ., 2011 ). En la rata
ovariectomizada, E2 exgeno aument el contenido de glucgeno uterino como se esperaba
(Paul & Duttagupta 1973 ). Sin embargo, cuando se trataron concomitantemente con E2 y
progesterona (P4), las concentraciones de glicgeno uterino se redujeron cuando se
compararon con E2 solo. Demers y Jacobs ( 1973 ) trataron conejos ovariectomizados y
conejillos de indias con E2 seguido de P4 (E2 P4) para simular el cebado de E2 y
reportaron una reduccin en el contenido de glucgeno uterino y un aumento de dos veces
en la actividad de glucgeno fosforilasa, Comparado con E2 solo. Estos hallazgos sugieren
que P 4 promueve el catabolismo del glicgeno uterino y / o antagoniza las acciones
glucognicas de E 2 .
Las concentraciones circulantes de E2 en el visn aumentan despus del apareamiento,
luego disminuyen durante el perodo variable de diapausa embrionaria y aumentan de nuevo
durante el perodo peri-implantacin (Lagerkvist et al ., 1992 ). Las concentraciones
plasmticas de P 4 en el visn permanecen bajas hasta el equinoccio vernal
(independientemente del momento del apareamiento), y luego aumentan concomitantemente
con E 2 durante el perodo peri-implantacin. Es posible que E 2 promueva la acumulacin
de glucgeno durante el proestro y el estro, y que despus del apareamiento y la ovulacin,
P 4 induce la movilizacin del glucgeno. Si esto es cierto, el tero de visn debe ser
extremadamente sensible a P4 en este momento, ya que las concentraciones circulantes del
esteroide, mientras aumentan, son muy bajas hasta la diapausa tarda (Lagerkvist et
al ., 1992 ). Sin embargo, el aumento de la sensibilidad uterina a P 4 , en respuesta a
E 2 inducida por la regulacin de los receptores P 4 , puede resultar en un tero que
responde a las concentraciones de P 4 (quiz inmutables).
Para determinar si P4 podra inducir el catabolismo del glucgeno y / o disminuir la sntesis
de glucgeno en el tero de visn, los animales fueron ovariectomizados bilateralmente y
tratados con E2 y P4 solos o para simular E2 cebado, E2 seguido por P4 (E2
P _ { 4} ). Uteri se analizaron para: contenido de glucgeno de endometrio, miometrio,
estroma, epitelios glandular y luminal; (Ii) niveles de expresin de mRNA relativos para
glucgeno sintasa 1, glicgeno fosforilasa m, hexoquinasa 1 y glucosa-6-fosfatasa 3, y (iii)
niveles de protena para glicgeno sintasa y hexoquinasa 1.
Materiales Y Mtodos
Animales
Veinticinco adultos (18-19 meses de edad) visones hembras premiparas (6-8 descendientes
por litera), fueron trasladados de las condiciones al aire libre del rancho a la instalacin de
animales de interior en la Universidad Estatal de Idaho (ISU) a principios de noviembre. El
visn se aloj individualmente, se aliment una mezcla de pollo y subproductos de pescado
diariamente y se recibi agua ad libitum. Los animales fueron expuestos a un fotoperiodo
diario que se aproxima a los cambios fotoperidicos naturales para el sureste de Idaho
(Rose 1995 ) a temperatura ambiente entre 22-28 C. Todos los procedimientos
relacionados con el cuidado de los animales, la ciruga y los tratamientos hormonales fueron
aprobados por el Comit Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la ISU y
conformados con la Gua para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Protocolo #
6410909).
Hormonas
Inicialmente se disolvieron Estradiol 17 beta (E2, R187933, Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO, EE.UU.) y progesterona (P4, P0130: Sigma Chemical Co.) en alcohol etlico al 95%
(EtOH) y despus se mezclaron En aceite de ssamo como vehculo para la inyeccin
subcutnea.
Tratos
En el da 0 (17 de noviembre), todos los visones se ovariectomizaron bilateralmente a travs
de una nica incisin ventral media, mientras que bajo anestesia con hidrocloruro de
ketamina (50 mg / kg de peso corporal, Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA,
EE.UU. Los animales fueron posteriormente devueltos a sus jaulas durante 11 das, para
permitir la recuperacin y la eliminacin natural de las hormonas ovricas residuales. El da
12, los animales fueron asignados al azar a uno de los cinco grupos (Fig. 1 , n = 5 /
grupo). El visn en los grupos 2,3 y 4 se inyect una vez al da los das 12,13 y 14 con E2
(50 g / kg de peso corporal). En el grupo 5 cada uno recibi inyecciones diarias de P4 (25
mg / kg de peso corporal) en los das 12, 13 y 14 mientras que el visn en el grupo 4 recibi
inyecciones de P4 los das 15, 16 y 17. Los animales del grupo 3 recibieron cada uno
Inyecciones diarias de vehculo en los das 15, 16 y 17 mientras que el visn en el grupo 1
reciba vehculo solo a los das 12, 13 y 14 y representaba los controles.Veinticuatro horas
despus de la ltima perturbacin, los animales fueron sacrificados con una dosis letal de
Sleep-A-Way (Fort Dodge Animal Health), se recolectaron teros y se congelaron
rpidamente en nitrgeno lquido.
Veinticinco visones hembra adultos fueron ovariectomizados bilateralmente el 17 de
noviembre (da 0). El da 12, los visones fueron asignados aleatoriamente a uno de los cinco
grupos ( n = 5 / grupo) y los tratamientos iniciados. El visn en los grupos 2, 3 y 4 se inyect
una vez al da, los das 12, 13 y 14 con estradiol 17beta (E2, 50 g / kg de peso corporal). En
los mismos das, el visn en el grupo 5 recibi inyecciones diarias de progesterona (P4, 25
mg / kg de peso corporal).Visn en el grupo 3, recibieron inyecciones diarias de vehculo en
los das 15, 16 y 17, mientras que visn en el grupo 4 recibieron inyecciones diarias de P4
en los mismos das para simular el cebado E2. El visn en el grupo 1 recibi inyecciones de
vehculo solamente a los das 12, 13 y 14 y represent los controles. Todos los animales
fueron sacrificados 24 h despus de la ltima perturbacin () con una dosis letal de Sleep-
A-Way (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA, EE.UU.), el tero recogido y
congelado rpidamente en nitrgeno lquido. D = da.
Concentraciones de glicgeno en homogeneizados uterinos
Las concentraciones de glicgeno se determinaron usando un procedimiento modificado de
Good et al . ( 1933 ). El tejido uterino (70-120 mg) de cada visn se liofiliz durante 3 das y
se homogeneiz en 20 volmenes de KOH al 30%. Se incub una alcuota de 125 l del
homogeneizado a 100 C durante 30 minutos para desnaturalizar las enzimas y destruir la
glucosa libre. Para aislar el glicgeno, las muestras se diluyeron con 1,2 volmenes (150 l)
de EtOH al 95%, se congelaron a -80C durante 60 min, se descongelaron y se centrifugaron
a 9600 xg durante 10 min. Despus de descartar el sobrenadante, los tubos se invirtieron y el
grnulo se sec durante la noche. Posteriormente, se aadieron 100 \ mu L de HCl 1,0 N al
grnulo, se calentaron a 100C durante 2,5 h para descomponer el glucgeno en D -
glucosa. Las concentraciones de glucosa, como indicador del contenido de glucgeno, se
determinaron usando Wako Glucose Auto Kit (439-90901, Wako Chemicals USA, Inc.,
Richmond, VA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La glucosa se
cuantific espectrofotomtricamente ( = 505 nm) comparando incgnitas con una curva
estndar de concentraciones crecientes de glucosa. Todas las muestras se analizaron por
duplicado, en un solo ensayo con un coeficiente de variacin intra-ensayo del 2,0%.
Localizacin de depsitos de glucgeno en secciones transversales
uterinas
Las muestras uterinas se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, se deshidrataron y
se montaron en bloques de parafina. Secciones transversales uterinas (7 m) fueron
incubadas con cido peridico-Schiff (PAS) reactivo y counterstained con hematoxilina. Las
imgenes fueron capturadas digitalmente a 25, 200 y 400 y analizadas utilizando el
software ImageJ (Ambramoff et al. , 2004 ). Para la cuantificacin del contenido de
glucgeno endometrial y miometrial, se analizaron tres imgenes de corte transversal uterino
consecutivas de cada visn a 25 (seccin transversal uterina completa), mientras que para
el contenido de glicgeno epitelial glandular y luminal, una porcin (a 400 ) de cada una de
Se analizaron tres secciones transversales uterinas consecutivas. Debido a que la PAS tie
los carbohidratos adems del glucgeno, se trat previamente una seccin transversal
adicional con diastasa (A8220, Sigma Chemical Co.), para digerir el glicgeno antes de la
tincin con PAS y sirvi como control negativo. El contenido de glicgeno de cada tejido se
cuantific restando valores de control negativos de secciones teidas con PAS sin diastasa y
luego se expres como un porcentaje del rea que se ti positiva para el glucgeno.

El aislamiento de ARN y la conversin a ADN complementario (cDNA)

Se aisl ARN total de 20-30 mg de tejido uterino de cada visn utilizando Qiagen RNeasy
Fibrous Tissue Mini Kit (74104, QIAGEN, Valencia, CA, EE.UU.) como se describi
anteriormente (Rose et al ., 2011 ).Las muestras se examinaron para determinar la
contaminacin de protenas midiendo la absorcin de luz de cada muestra a 260 nm (ADN y
ARN) y 280 nm (protena). Para el anlisis cuantitativo de PCR (qPCR) slo se usaron
preparaciones de ARN con una proporcin 260/280 de 1,9 o superior. Para eliminar
cualquier ADN contaminante, las muestras se trataron con tampn wipeout de ADN
genmico (gDNA) antes de la reaccin de transcripcin inversa. La conversin de ARN
inestable a transcritos de cDNA estables (transcripciones de primera cadena) se consigui
utilizando el Kit de Transcripcin Inversa QuantiTect (205311; QIAGEN) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
Diseo del cebador
Para producir cebadores especficos para el ADNc de visn, primero utilizamos la
Herramienta de Bsqueda de Alineacin Local Bsica (BLAST) del Centro Nacional de
InformacinDeBiotecnologa(NCBI;NIH http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezdbgenom
e ) Y dise cebadores de PCR convencionales para cada gen de inters basado en regiones
de homologa entre ratas y otras especies. Utilizando estos cebadores, amplificamos el
cDNA de visn utilizando el Qiagen HotSTarTaq Master Mix Kit (203443; QIAGEN). Se
separaron los fragmentos de ADNc resultantes por electroforesis en gel y la banda que
contena el fragmento gnico de inters se purific usando un Filtro Centrfugo de ADN
Ultra Libre Millipore (42600, Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU.). La secuencia
de nucletidos para cada gen de inters se determin entonces usando Analizador Gentico
Biosystems 3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Basndose en la
secuencia de nucletidos de visn resultante para cada gen diana de inters, se disearon
cebadores para qPCR (Tabla 1 ), y se compraron a Integrated DNA Technologies
(Coralville, IA, USA).

QPCR
Todas las reacciones de qPCR se llevaron a cabo por triplicado utilizando el Kit de PCR
Verde SYTTEC SYBR (204143; QIAGEN) segn las instrucciones del fabricante. Las
concentraciones de cebador directo e inverso se optimizaron previamente y se aadieron a 5
l de plantilla de ADNc (100-200 ng) por reaccin.Los productos de PCR se detectaron en
tiempo real midiendo la fluorescencia verde de SYBR durante la fase de recocido usando el
sistema de PCR en tiempo real MJ Research Chromo4 (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA, EE.UU.).
 Temperatura
Los cebadores directo e inverso (5 Amplicn N de
Genes de fusin (
'a 3') (pb) acceso
C)

1. Gys1 , glicgeno sintasa 1; Pygm , glucgeno fosforilasa-msculo; Hk1 , hexoquinasa 1; G6pc3 , glucosa - 6 - fosfatasa
3; Gapdh , gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa.

Gys1 AAGATGGCAGCCACGGACAAATTC 110 87,5 0,50 KM084858

TCAATAGTAGTGCCGACAGGGTCA

Pigmeo TCATCACCCTGTACAACCGCATCA 80 79,0 \ pm 0,35 KM084856

AGCCTTCCCTCCAATCATCACAGT

Hk1 AATGCCAAAGAAATCCTGACCCGC 163 84,1 \ pm 0,43 KM026508

TGGGTGTGCCCTTGTTATCTCGAA

G6pc3 CCCTACTGCCTCGCCCAGGT 117 86,4 \ pm 0,50 KM015512

TGGGCTTGTGAGCTGGCCCTA

Gapdh AGGTCATCCATGACAACTTCGGCA 152 84,8 \ pm 0,45 KM025344

ACCAGTGGAAGCAGGGATGATGTT

Tabla 1. Cebadores para PCR cuantitativa de transcritos de genes uterinos de

visn y caractersticas de amplicn

La eficacia de la duplicacin del amplicn durante cada ciclo de PCR fue: gliceraldehdo 3-
fosfato deshidrogenasa 97%; Glucgeno sintasa 1, 103%; Glucgeno fosforilasa m,
98%;Glucosa-6-fosfatasa 3, 97%; Y hexoquinasa 1, 100%. Los controles negativos no
contenan plantilla y la amplificacin nunca estuvo por encima del fondo. La especificidad
del cebador se determin usando anlisis de la curva de fusin, lo que dio como resultado
una nica temperatura de fusin para cada amplicn.
Los cambios de pliegue en la expresin gnica se determinaron usando el mtodo de curva
estndar relativa (Pfaffl 2001 ). Se generaron curvas estndar a partir de tres pocillos
controlados agrupados. El ADNc de estos teros se diluy (1:10, 1: 100, 1: 1000 y 1:10.000)
o no diluido para construir curvas estndar (cDNA ng / mL frente al ciclo de cuantificacin,
Cq) para cada gen de inters ( R 2 = 0,98-0,99).Los datos se promediaron por grupo de
tratamiento ( n = 5 mink / grupo, cada ensayo en triplicado) y se expresaron en trminos de
diferencia de pliegue relativo en comparacin con los controles.
Se eligi la gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa con la que normalizar nuestros datos, ya
que mostr la menor variacin en la expresin (gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa Cq
para E 2 + 24 h = 21,59 0,22, para E 2 + 96 h, Cq = 21,54 Para P 2 + P = 4 , Cq = 21,64
0,55, para P 4 + 24 h = 21,72 0,33 y para controles, Cq = 22,28 0,22), en comparacin
con 18s rRNA (18s rRNA Cq para E 2 + Para E2 + 96h, Cq = 18,34 0,39, para E2 P4,
Cq = 17,97 0,07, para P4 + 24 h = 18,60 0,56 y para los controles, Cq = 23,05 \ pm
0,48).
Anlisis de Western Blot
Las protenas uterinas se aislaron usando tampn de lisis RIPA (sc-24948 Santa Cruz
Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las
concentraciones de protena se determinaron utilizando el kit de ensayo de protenas Pierce
BCA (23225, Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Las protenas enzimticas de
inters se resolvieron por peso molecular utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida
de dodecilsulfato sdico (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se
bloquearon durante 1 h en tampn de leche al 5% que contena solucin salina tamponada
con Tris-Tween 20 : BP337 - 100, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.) para reducir la
unin no especfica. Las membranas se incubaron posteriormente durante la noche a 4C con
anticuerpos primarios especficos para la glucosa sintasa (3886S, Cell Signalling
Technology, Danvers, MA, USA, dilucin 1: 5000), glucgeno sintasa fosforilada (3891S,
Cell Signalling Technology, dilucin 1: 5000) Y hexoquinasa 1 (2024S, Cell Signaling
Technology, dilucin 1: 1000). Posteriormente, las membranas se lavaron en TBS-T para
eliminar el exceso de anticuerpos primarios. En ese momento se incubaron las membranas
con anticuerpo secundario (inmunoglobulina G anti conejo conjugada con peroxidasa de
rbano picante, 7074, Cell Signaling Technology, dilucin 1: 1000) durante 2 h para detectar
las protenas enzimticas de inters.Concomitantemente (como control de carga) incubamos
membranas con un anticuerpo primario conjugado con peroxidasa de rbano picante (HRP)
contra actina beta (Actb-HRP, 5125S, Cell Signalling Technology, dilucin 1: 10.000)
durante 2 h. A las transferencias con HRP conjugado con el anticuerpo secundario se aadi
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrato (WBKLS0100; Millipore
Corporation), mientras que las muestras que se incubaron con Actb-HRP se incubaron con
Novex HRP Chromogenic Substrato (100002903 Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.
). Las transferencias resultantes se fotografiaron usando Bio-Rad VersaDoc 3000 Imager
(Bio-Rad Laboratories). La cantidad relativa de cada protena de inters se determin
utilizando ImageJ gel analizador para cuantificar la densidad de banda y luego normalizado
a beta actina como un control de carga, con todas las muestras ensayadas en triplicado.
Para validar el uso de anticuerpos primarios contra las protenas de visn, tanto el visn
como las protenas de rata se analizaron simultneamente. Para cada protena ensayada se
detect slo una banda nica correspondiente al peso molecular correcto de cada protena
(glucgeno sintasa, fosfo-glucgeno sintasa y hexoquinasa 1) tanto en la rata y visn tejido
uterino (datos no presentados). Todos los anticuerpos primarios se produjeron contra
protenas humanas y fueron validados por el fabricante contra protenas de rata. Los
anticuerpos contra la glucgeno sintasa no eran especficos de una nica isoforma y por lo
tanto se uniran tanto a la glucgeno sintasa 1 (msculo) como a la glucgeno sintasa 2
(hgado).
 Anlisis Estadstico
Todos los datos se analizaron mediante un anlisis de varianza unidireccional, seguido por la
prueba post hoc de Tukey (SigmaPlot, versin 12.5, Systat Software Inc., San Jos, CA,
EE.UU.). Las diferencias se consideraron significativas a P 0,05.
Resultados
El rea endometrial uterina fue cuatro veces mayor a las 24 h y seis veces mayor a las 96 h
despus de la ltima inyeccin de E 2 en comparacin con los controles ovariectomizados
(Tabla 2 , P 0,05). El rea endometrial del visn tratado como E 2 P 4 , fue menor que
E 2 + 96 h de animales tratados ( P 0.05), pero no difiri de E 2 + 24 h mink. Aunque el
rea endometrial del visn tratado con E2 P4 y P4 + 24 h tendi a ser mayor que los
controles, las diferencias no fueron significativas. El rea del miometrio fue mayor a las 24 h
(3,5 veces) y 96 h (2,5 veces) despus de la ltima inyeccin de E 2 en comparacin con los
controles (Tabla 2 ; P 0,05). El rea miometrial del visn tratado como E 2 P 4 no
difiri del visn tratado con E 2 solamente (24 y 96 h) y fue mayor en comparacin con los
controles ( P 0.05). El rea de mioma del visn tratado con P 4 + 24 h no difiri de los
controles ovariectomizados.

Grupo Tratamiento rea endometrial, rea del miometrio

(Pxeles x 104) (Pxeles x 104)

1. Dentro de una columna, los medios sin un superndice comn difieren ( P 0.05).

1 Controlar 3,87 \ pm 0,65 a 7,13 0,57 a

2 E 2 + 24 h 16,14 1,83 b 24,96 4,00 b

3 E 2 + 96 h 24,87 3,64 c 19,58 1,20 aC

4 E2P4 11,55 1,37 ab 20,31 4,14 aC

5 P 4 + 24 h 8,59 \ pm 0,45 ab 9,67 0,54 ac

Tabla 2. Promedio ( SE) del endometrio uterino y las reas del miometrio (pxeles
10 4 ). El visn en los grupos 2, 3 y 4 se inyect una vez al da a los das 12, 13 y 14
con estradiol 17beta (E2, 50 g / kg de peso corporal). En los mismos das, el visn en
el grupo 5 recibi inyecciones diarias de progesterona (P4, 25 mg / kg de peso
corporal). El visn en el grupo 3 recibi el vehculo solamente en los das 15, 16 y 17
mientras que el visn en el grupo 4 recibi inyecciones diarias de P4 en los mismos
das. El visn en el grupo 1 recibi el vehculo solamente en los das 12, 13 y 14 y
represent los controles. Todos los visones fueron sacrificados aproximadamente 24 h
despus de la ltima perturbacin
Las concentraciones brutas de glucgeno uterino en el visn tratado como E 2 + 24 h fueron
mayores que para todos los otros tratamientos (Tabla 3 , P 0.05). En E2 + 96 h de visn tratado,
las concentraciones de glicgeno uterino fueron superiores a los controles ( P 0.05), pero
aproximadamente 50% menos que para E2 +24 h de visn tratado ( P 0.05). Para el contenido de
glicgeno uterino tratado con viscosa E2 P4 fue un 70% menor que para los animales tratados
con E2 + 24 h ( P 0,05) y 40% menos que el visn tratado como E2 + 96 h. El tratamiento con
P 4 + 24 h no tuvo efecto sobre el contenido bruto de glucgeno uterino en comparacin con los
controles.

Tabla 3. Concentraciones medias ( SE) de glucgeno (mg / g peso seco) en todo el

tero, y porcentaje de contenido de glucgeno del endometrio y del miometrio (% rea
peridica cido-Schiff (PAS) 10). El visn en los grupos 2, 3 y 4 se inyect una vez al
da, los das 12, 13 y 14 con estradiol 17beta (E2, 50 g / kg de peso corporal). En los
mismos das, el visn en el grupo 5 recibi inyecciones diarias de progesterona (P4, 25
mg / kg de peso corporal). El visn en el grupo 3 recibi el vehculo solamente en los
das 15, 16 y 17, mientras que el visn en el grupo 4 recibi inyecciones diarias de P4 en
los mismos das. El visn en el grupo 1 recibi el vehculo solamente en los das 12, 13 y
14 y represent los controles. Todos los visones fueron sacrificados aproximadamente
24 h despus de la ltima perturbacin. El aumento de plegado relativo por encima de
los controles se indica entre parntesis
Los anlisis de ImageJ revelaron que tanto el contenido de glicgeno endometrial como miometrial
fue mayor en E 2 + 24 h y E 2 + 96 h de visn tratado, en comparacin con todos los otros
tratamientos (Tabla 3, P 0.05). El contenido de glicgeno de ambos tejidos tendi a ser menor en
E 2 + 96 h visn en comparacin con E 2 + 24 h animales, pero las diferencias no fueron
significativas. El visn tratado como E 2 P 4 tena concentraciones de glicgeno endometrial y
miometrial que no difieren de los controles o visn tratados como P 4 + 24 h.
El contenido de glicgeno de los epitelios glandular y luminal fue mayor en E2 + 96 h visn en
comparacin con todos los otros tratamientos (Tabla 4 ; P 0.05). En E2 + 24 h visn, el contenido
de glucgeno de ambos epitelios fue menor que para E2 + 96 h visn, pero mayor que el visn
tratado con P4 + 24 h, E2 P4 o como controles ( P 0.05). No hubo diferencias en el contenido
de glucgeno de epitelios glandular y luminal entre el visn tratado como E 2 P 4 , P 4 + 24 h o
controles. El contenido de glucgeno en las clulas estromales fue mayor en E2 + 96 h de visn
tratado en comparacin con todos los otros tratamientos ( P 0.05). No hubo diferencias en el
contenido de glucgeno de las clulas estromales entre el visn tratado como E 2 P 4 , E 2 + 24 h
o los controles. El contenido de glucgeno estromal fue menor en respuesta a P 4 + 24 h en
comparacin con todos los otros grupos ( P 0.05).
La expresin de ARNm de hexoquinasa uterina 1 en E2 + 24 h mink fue 30% mayor que los
controles (Figura 3 ; P 0,05). No hubo diferencias en la expresin del gen en E 2 + 96 h
mink o en respuesta a P 4+ 24 h, en comparacin con los controles. Cuando el visn se
imprim con E2 y posteriormente se trat con P4 (E2 P4), la expresin de ARNm de
hexoquinasa 1 fue mayor que para todos los dems tratamientos ( P 0.05).
Discusin
El contenido de glucgeno en el mitomo uterino del visn, el endometrio, el estroma, el
epitelio luminal y el epitelio glandular se incrementaron por E2 exgeno a las 24 y 96 h
despus de la ltima inyeccin en comparacin con los controles (Tablas 3 y 4 ,
Figura 2 ; P 0.05). Estos hallazgos apoyan nuestras observaciones previas para el visn
(Rose et al ., 2011 ) y estn de acuerdo con las de ratas, conejos y cobayas (Bitman et
al ., 1965 , Bitman y Cecil, 1967 , Gregoire et al, 1967 , Hall y Khaligh, 1968 , Demers Et
al, 1973a , Tripathi 1983 ).
Debido a que las concentraciones de E2 circulantes en el visn estn aumentando durante
semanas antes del proestro y el estro (Pilbeam et al ., 1979 ), parecera que parte de los
efectos de E2 en el tero del visn son teleolgicamente, promover la acumulacin de
glucgeno en preparacin para La temporada de cra. Nuestros hallazgos recientes del
contenido mximo de glucgeno uterino en el visn durante el estro, que disminuyeron
durante la implantacin y el embarazo (Dean et al ., 2014 ), apoyan esta hiptesis. No parece
irrazonable proponer que sin reservas adecuadas de glucgeno uterino y su posterior
movilizacin, los preembriones de visn podran no sobrevivir y / o desarrollarse hasta la
fase de blastocisto. Esto podra tener un impacto muy negativo en el tamao resultante de la
camada.
El contenido de glucgeno en todo el tero de E2 + 96 h de visn tratado fue menor que para
E2 + 24 h de animales tratados (Tabla 3 , P 0,05). De forma similar, el contenido de
glucgeno del endometrio y del miometrio mostr la misma tendencia, aunque las
diferencias no fueron significativas. Tales hallazgos podran sugerir que el catabolismo de
glicgeno predomin sobre la sntesis de glucgeno entre las horas 24 y 96 y que se
requieren concentraciones elevadas de E2 por encima de cierto nivel crtico para mantener
una mayor relacin de sntesis de glicgeno a catabolismo. Sin embargo, el contenido de
glucgeno de los epitelios glandulares, el epitelio luminal y el estroma fueron mayores en
visones tratados como E 2 + 96 h que E 2 + 24 h (Tabla 4 ; P 0.05). Razonamos que las
determinaciones de glucgeno realizadas por el anlisis ImageJ de las mediciones de
endometrio, miometrio, estroma y glucgeno uterino completo fueron bajas a las 96 h
despus de la ltima inyeccin de E 2 , como resultado de ser diluidas por la cantidad
relativamente grande de material extracelular y clulas no Que contiene glicgeno
(figura 2 ). Como se mencion anteriormente, el rea endometrial fue aproximadamente
cuatro veces mayor a las 24 h y seis veces mayor a las 96 h despus de la ltima inyeccin
de E 2 (Tabla 2 , P 0,05) cuando se compar con los controles.
Incluso despus de usar ImageJ para aislar el compartimiento estromal del endometrio, el
contenido de glucgeno para el estroma fue rdenes de magnitud por debajo de la detectada
para el epitelio glandular y luminal. Debido a la pequea cantidad de glucgeno detectada
dentro de un rea tan grande, creemos que nuestras mediciones de contenido de glucgeno
para el estroma pueden haberse acercado a los lmites de deteccin mediante el anlisis de
ImageJ y puede no ser una representacin exacta del contenido de glucgeno de las clulas
estromales. Por el contrario, el epitelio puede ser delimitado con precisin por
ImageJ. Como resultado, creemos que las determinaciones de contenido de glucgeno para
epitelios glandular y luminal son las mediciones ms precisas y fisiolgicamente
significativas, ya que el epitelio es la fuente inmediata de histotropo uterino.
El contenido de glucgeno de los epitelios glandulares, el epitelio luminal y el estroma
fueron significativamente mayores en E 2 + 96 h que E 2 + 24 h de animales tratados
(Tabla 4 ). Esto ilustra que E2 tuvo efectos prolongados sobre la sntesis de glucgeno en
estas clulas. De acuerdo con este hallazgo, los niveles de ARNm de glicgeno sintasa 1 en
los homogenados uterinos fueron mayores en E2 + 96 h visn en comparacin con E2 + 24 h
o controles (Figura 3 ; P 0,05). Aunque no pudimos detectar diferencias en la protena de
glucgeno sintasa total mediante anlisis de transferencia de Western entre E2 + 24 h, E2 +
96 h y controles (Figura 4 ), la cantidad de protena fosfo-glicgeno sintasa (inactiva) fue
significativamente menor en E 2 + 24 h mink, en comparacin con los controles, lo que
podra haber contribuido al aumento de la sntesis de glucgeno.
Exgeno E 2 no tuvo ningn efecto sobre la expresin del gen g glucgeno fosforilasa a las
24 o 96 h despus de la ltima inyeccin (Fig. 3 ). Esto est de acuerdo con el consenso
general de que E 2 es glucognico en el tero. Sin embargo, cuando el visn se trat como
E2 P4 o P4 + 24 h, la expresin del gen m glicgeno fosforilasa uterina fue mayor que E2
+ 24 h, E2 + 96 h o controles (Figura 3 ; P 0.05 ).Adems, la protena fosfo-glicgeno
sintasa y el ARNm de glucosa-6-fosfatasa 3 tambin fueron ms altas en respuesta al
tratamiento E2 P4 (Figs. 3 y 4 ). De acuerdo con esta observacin que anteriormente
mostr que la expresin de la glucosa-6-fosfatasa 3 mRNA fue cinco veces mayor durante la
diapausa tarda (como P 4 niveles estn aumentando) y 3,5 veces mayor durante el
embarazo, en comparacin con el estro (Dean et al . 2014 ). Colectivamente, estos hallazgos
sugieren que P 4 promueve el catabolismo de glicgeno y la movilizacin de glucosa en el
tero de visn.
Es bien sabido que la sntesis de glicgeno y el catabolismo ocurren concomitantemente
dentro de las clulas y que el contenido neto de glicgeno refleja los niveles relativos de los
procesos anablicos y catablicos. As, a pesar de que las reservas de glucgeno en el tero
de visn estn casi agotadas antes de la implantacin, el nivel de actividad anablica todava
podra ser muy alto en este momento y desempear un papel significativo en el secuestro de
glucosa materna en el tero. De acuerdo con esta suposicin, mostramos que el ARNm y la
protena de la hexoquinasa 1 eran ms altos en el visn en respuesta a E2 P4 en
comparacin con todos los otros tratamientos (Figuras 3 y 4 ). Recientemente, se demostr
que la protena hexoquinasa 1, detectada por inmunohistoqumica en el epitelio uterino de
visn, fue alta durante el estro y la periimplantacin (Dean et al ., 2014 ). Es posible que el
aumento de la expresin de hexoquinasa en respuesta a P 4 contribuya al aumento de la
captura de glucosa, a partir de la circulacin materna; Incluso despus de agotar las reservas
de glucgeno uterino. De forma similar, el aumento de la expresin de glicgeno sintasa en
respuesta a E2 P4 (incluso si el catabolismo predominaba sobre el anabolismo), podra
servir para desviar la glucosa materna al tero. Por lo tanto, no fue sorprendente descubrir
que algunos procesos glicognicos en el tero se han mejorado en el visn tratado con E2
P4.
Mink uterino imgenes en seccin transversal. Los animales fueron inyectados con E2
durante 3 das y sacrificados 24 h (E 2 + 24 h) y 96 h (E 2 + 96 h) despus de la ltima
inyeccin. Para simular el cebado con E2, el visn se trat durante 3 das con E2 y despus
durante 3 das adicionales con P4 y se sacrific 24 horas ms tarde (E2 P4). El visn
tambin se trat con P4 durante 3 das y se sacrific 24 h despus (P4 + 24 h). Los controles
(CON) recibieron inyecciones de vehculo slo durante 3 das y se sacrificaron 24 h
despus. Todas las secciones (7 m) se tieron con cido peridico-Schiff (PAS) y se
contracoloraron con hematoxilina. Las imgenes fueron capturadas en 25 (columna
izquierda), 200 (columna media) y 400 (columna derecha). Las flechas identifican reas
de tincin PAS positiva en los lmenes glandulares. M, miometrio; E, endometrio; GE,
epitelio glandular; LE, epitelio luminal.
La expresin de mRNA de glucgeno sintetasa uterina 1 fue mayor en respuesta a E2 P4
en comparacin con todos los otros tratamientos, seguido por E2 + 96 h y P4 + 24 h
(Figura 3 ; P 0.05).Mink tratado como E 2 + 24 h exhibido glucgeno sintasa 1 mRNA
expresin niveles que no difieren de los controles.

Niveles de expresin relativa de ARNm mensajero relativo (media SE) para la

hexoquinasa 1, glicgeno sintasa 1, glicgeno fosforilasa m y glucosa-6-fosfatasa en
homogenatos uterinos de visn. Los animales fueron inyectados con E2 durante 3 das y
sacrificados 24 h (E 2 + 24 h) y 96 h (E 2 + 96 h) despus de la ltima inyeccin. Para
simular el cebado con E2, el visn se trat durante 3 das con E2 y despus durante 3 das
adicionales con P4 y se sacrific 24 horas ms tarde (E2 P4). El visn tambin se trat
con P4 durante 3 das y se sacrific 24 h despus (P4 + 24 h). Los controles (CON)
recibieron inyecciones de vehculo slo durante 3 das y se sacrificaron 24 h despus. Los
niveles de expresin representan la media de cinco visones, cada uno analizado en
triplicado. Los grupos sin letra comn difieren en P 0.05.
La expresin de mRNA de glicgeno fosforilasa m en homogeneizados uterinos enteros para
E2 + 24 h y E2 + 96 h de visn tratado no difiri de los controles (Figura 3 ). Mink cebado
con E 2 y luego tratado con P 4 (E 2 P 4 ) o P 4 + 24 h tena mayores niveles de
expresin gnica del glicgeno fosforilasa m cuando se comparaba con el visn tratado
como E 2 + 24 h, E 2 + 96 h o Como controles ( P 0,05).
La expresin de mRNA de glucosa 6-fosfatasa 3 uterina fue mayor para E2 + 96 h de visn
tratado comparado con E2 + 24 h o controles (Figura 3 : P 0,05). Mink tratado como
E 2 P 4 mostr el ms alto nivel de glucosa-6-fosfatasa 3 expresin gnica, seguido por el
tratamiento con P 4 + 24 h.
La cantidad de Hexokinase 1 y protenas de glicgeno sintasa en homogeneizados uterinos
enteros para el visn tratado como E 2 + 24 h y E 2 + 96 h o en respuesta a P 4 + 24 h no
difiri de los controles (Figura 4 ).La cantidad de ambas protenas en respuesta a E 2
P 4 fue mayor en comparacin con todos los otros tratamientos ( P 0,001). De forma
similar, la cantidad de protena fosfo-glicgeno sintasa fue mayor en respuesta a E2 P4 en
comparacin con todos los dems tratamientos ( P 0.05). En comparacin con los
tratamientos E2 P4 o E2 + 96 h ( P 0.05), el vislumbre tratado como E 2 + 24 h
present menor contenido de fosfo-glicgeno sintasa y tendi a ser menor que el visn
tratado con P4 + 24 marido.
Anlisis de transferencia de Western para la hexoquinasa 1, fosfo-glucgeno sintasa 1 y
protenas de glicgeno sintasa en homogeneizados uterinos de visn. Los animales fueron
inyectados con E2 durante 3 das y sacrificados 24 h (E2 + 24 h) y 96 h (E2 + 96 h) despus
de la ltima inyeccin. Para simular el cebado con E2, el visn se trat durante 3 das con E2
y despus durante 3 das adicionales con P4 y se sacrific 24 horas ms tarde (E2 P4). El
visn tambin se trat con P4 durante 3 das y se sacrific 24 h despus (P4 + 24 h). Los
controles (CON) recibieron inyecciones de vehculo slo durante 3 das y se sacrificaron 24
h despus. Los niveles de expresin representan la media de cinco visones, cada uno
analizado en triplicado.Los grupos sin letra comn difieren en P 0.05
En resumen, concluimos que la supervivencia y desarrollo preembrionario del visn al
estadio de blastocisto dependen en parte del catabolismo del glicgeno uterino inducido por
P4 y la liberacin de glucosa. Durante la implantacin, a medida que las concentraciones
circulantes de E2 y P4 aumentan, las acciones de P4 pueden predominar sobre E2, dando
como resultado un mayor nivel de catabolismo de glucgeno que la sntesis. Sin embargo,
E2 independientemente o en combinacin con P4 puede todava promover la sntesis de
glucgeno en este momento. Este ltimo efecto podra promover el secuestro continuo de la
glucosa desde la circulacin materna hasta el tero, asegurando un soporte nutricional
adecuado para la implantacin embrionaria y el embarazo precoz. Adems, creemos que las
concentraciones de P4 en circulacin deben estar por encima de un nivel crtico, entre el
apareamiento y la implantacin, para asegurar el xito reproductivo y para maximizar el
tamao de la camada. Como evidencia reciente demostr que las concentraciones de P4
fecal de visn femenino apareado aumentaron ms temprano y fueron significativamente
mayores en todos los animales que parieron cuando se compararon con aquellos que no
pudieron criar (Cao et al., 2016 ). Proponemos que los fallos reproductivos en el visn
pueden deberse en parte a: (i) una cantidad insuficiente de glucgeno acumulado por el tero
durante el pro-estro y el estro; (Ii) movilizacin inadecuada de reservas de glucgeno uterino
durante el desarrollo e implantacin preembrionaria; Y / o (iii) falla en desviar cantidades
suficientes de glucosa de la circulacin materna al tero durante el embarazo
temprano. Adems de las muchas acciones documentadas de P 4 en el tero, ahora parece
que la regulacin del metabolismo del glucgeno uterino por la hormona debe atraer la
atencin de los investigadores como un objetivo potencial para aumentar el rendimiento
reproductivo, as como el desarrollo de nuevas y quizs Medios ms seguros de control de la
natalidad.
Expresiones de gratitud
Esta publicacin fue posible gracias a: (i) el Programa INBRE, las Subvenciones NIH P20
RR016454 (Centro Nacional de Recursos de Investigacin) y P20 GM103408 (Instituto
Nacional de Ciencias Mdicas Generales); (Ii) los premios de la Fundacin de Investigacin
de Agricultores Mink (Comisin de la piel de EE.UU., Coronado, CA, EE.UU.); Y (iii) el
Colegio de Ciencia e Ingeniera en Idaho State University a Jack Rose. Mink fueron
generosamente donados por los Sres. Lee y Ryan Moyle, de Moyle Mink y Tannery,
Heyburn, Idaho.
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