Titulo: Produccin de carotenoides y lpidos por Rhodococcus opacus PD630 en cultivo discontinuo

y alimentado

Resumen:

Produccin de carotenoides por Rhodococcus opacus PD630. En un medio de sal mineral modificado
formulado con glicerol como fuente barata de carbono se utiliz para la fermentacin. El acetato de
amonio fue el fuente de nitrgeno. Una concentracin de masa de clulas secas de Se pueden
producir 5,4 g / l en matraces de agitacin con una concentracin de carotenoide de 0,54 mg / l. En
el cultivo en lotes en un 5 L biorreactor, sin control del pH, la biomasa seca mxima concentracin
fue * 30% menor que en los frascos de agitacin y la concentracin de carotenoides fue de 0,09 mg
/ l. Ambos la concentracin de biomasa y la concentracin de carotenoides podra ser aumentado
utilizando una operacin de alimentacin por lotes con una alimentacin mezcla de acetato de
amonio y cido actico. Con este , la concentracin final de biomasa fue de 8,2 g / L y la
concentracin de carotenoides fue de 0,20 mg / L en un perodo de 10 das fermentacin. Un control
del pH demostr ser innecesario para maximizar la produccin de carotenoides en este
fermentacin.

Introduccion

Los carotenoides son pigmentos tetraterpenoides producidos por plantas y muchos

microorganismos [1 - 4]. La gama de carotenoides va de color de amarillo a rojo intenso y son
solubles en lpidos. En la naturaleza, los carotenoides protegen las membranas daos por la luz, la
oxidacin y los radicales libres [5]. Uno de los los carotenoides ms conocidos son el b-caroteno
(C40H56), un precursor de vitamina A. Carotenoides son beneficiosos para la salud [6, 7] y se utilizan
como colorantes alimentarios [2, 8].

La biomasa microbiana rica en carotenoides puede cultivar como cultivo puro en biorreactores
compactos utilizando sustratos econmicos y las condiciones de cultivo pueden controlado para
maximizar la produccin [3, 5]. Este trabajo informa sobre la produccin de carotenoides utilizando
la bacteria del suelo grampositiva no patgena Rhodococcus opacus PD630. Esta bacteria es
conocida por producir carotenoides [11], pero no ha sido previamente examinados en detalle para
su produccin.

La concentracin de oxgeno disuelto puede influir en la produccin de los carotenoides porque las
clulas sometidas al estrs oxidativo responden elevando la produccin de los antioxidantes
carotenoides. Por ejemplo, el estrs oxidativo a altos niveles de oxgeno disuelto estimul la
produccin de b-caroteno en el hongo patognico de la planta aerbica Blakeslea trispora [5, 12].

Adems de los carotenoides, R. opacus produce grandes cantidades de otros aceites [13, 14],
incluidos los triacilgliceroles (TAG). Las TAG son de inters potencial como materia prima para
producir biodiesel y cidos grasos de alto valor. Bajo condiciones adecuadas, R. opacus PD630 puede
acumular hasta 87% del peso de la pila seca como aceites [15]. En vista de esto, la produccin de
TAG por R. opacus PD630 se evalu en paralelo con la produccin de carotenoides.
Materiales y mtodos

Cepa y medios

Se obtuvo Rhodococcus opacus PD630 (DSM 44193) de la Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Alemania). Los medios de cultivo se utilizaron
caldo de nutrientes (NB) [16] y un mineral modificado medio salino (MSM) formulado con glicerol y
un rastro elemento (SL6).

En el MSM modificado utilizado en este trabajo, el amonio acetato de etilo (1,44 g) reemplaz al
cloruro de amonio del medio tal que la concentracin molar de amonio en los dos medios era
idntico. Acetato de amonio fue la principal fuente de nitrgeno. El MSM modificado fue formulado
con glicerol (100 g / l) como fuente de carbono [18, 19].

En el MSM modificado utilizado en este trabajo, el acetato de amonio (1,44 g) reemplaz al cloruro
de amonio del medio tal que la concentracin molar de amonio en los dos medios era idntico.
Acetato de amonio fue la principal fuente de nitrgeno. El MSM modificado fue formulado con
glicerol (100 g / l) como fuente de carbono [18, 19].

Condiciones del cultivo

Los cultivos discontinuos de biorreactor se realizaron en una mezcla de 5 l biorreactor de tanque

(FS-02-B05P-110/220 V, Major Science, Taiwn) agitado con tres propulsores de 6 palas. Los
volumen de trabajo fue de 3 L. Cada fermentacin dur 7 das. El bioreactor contena MSM
modificado con glicerol (100 g / l). La velocidad de agitacin y la temperatura de incubacin fueron
200 rpm y 30 C, respectivamente. El inicial concentracin de acetato de amonio fue de 1,44 g / L,
igual a concentracin molar de cloruro de amonio en el MSM.

Si la espuma ocurri, un agente antiespumante a base de silicio fue manualmente adicional. La

alimentacin de un solo disparo fue amonio acetato de etilo (1,44 g / l, o 19,1 mmol / l), o cido
actico (1,15 g /L, o 19,1 mmol / L), o una combinacin de ambos. Cuando ambos se utilizaron
piensos, el acetato de amonio (1,44 g / L) fue pulso alimentado en el primer da y esto fue seguido
por un tiro alimentacin de cido actico (1,15 g / L) el segundo da y de nuevo en el tercer da.

Determinacin de la concentracin de biomasa

La concentracin de peso seco celular (CDW) se determin midiendo la densidad ptica de un caldo
diluido adecuadamente muestra a una longitud de onda de 660 nm y convertirla en una la
concentracin de peso en seco a travs de una curva de calibracin se haba preparado midiendo la
densidad ptica de una muestra de cultivo diluida en serie con una clula concentracin de peso en
seco. El CDW en esta muestra haba se ha determinado recuperando la biomasa de 10 ml de el caldo
por centrifugacin (60009 g, 15 min, 4C), lavando el sedimento celular dos veces con agua
desionizada, secando en un horno de 90 C durante la noche, enfriando a temperatura ambiente
en un desecador y pesaje.
Determinacin de concentraciones glicerol y acetato

Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, Spectra-Physics, Thermo Finnigan, EE.UU.) se utiliz
para estas mediciones.

Determinacin de la concentracin de carotenoides

Los carotenoides se midieron espectrofotomtricamente (Espectrofotmetro modelo HACH

DR6000, HACH Company, Loveland, CO, USA) como equivalentes de b-caroteno despus de
extraccin con disolvente de la biomasa [1, 20, 21]. Las celdas se recuperaron a partir de un volumen
conocido (aproximadamente 1 ml) del caldo de cultivo por centrifugacin (10.0009 g, 10 min),
lavado una vez con agua destilada, resuspendido en 1 ml de acetona y se mantuvo a 55C durante
15 minutos en la oscuridad. Los se elimin el sedimento de clulas casi incoloro por centrifugacin
(10.0009 g, 10 min) y la absorbancia (A454) de la se midi el sobrenadante a 454 nm frente a un
blanco de acetona. Esta medida se compar con una calibracin curva que se haba preparado
utilizando b-caroteno como un carotenoide estndar puro. Casi todos los carotenoides tienen
coeficiente de absorcin a una longitud de onda de alrededor de 450 nm [22].

Determinacin de cidos grasos

Las clulas se recuperaron del caldo de cultivo por centrifugacin (60009 g, 15 min), se lav una vez
con agua desionizada y liofilizar. La biomasa resultante se extrajo con una mezcla disolvente de
cloroformo y metanol (2: 1, v / v) durante 1 h mientras son sonicados a temperatura ambiente.
Despus, el se centrifug la suspensin sonicada (10.0009 g, 10 min), la capa de cloroformo (la capa
inferior) que contiene la capa disuelta se elimin el lpido y se evapor el disolvente hasta obtener
los lpidos. Los lpidos extrados se convirtieron en grasas steres metlicos de cido (FAME) por
reaccin con metanol y analizados por cromatografa de gases (GC) [23] utilizando un Shimadzu
modelo GC-2010 Plus GC equipado con un sistema Agilent La columna BD-EN14103 (30 m $ 9 $ 0,32
mm, 0,25 lm de pelcula) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). El helio era el gas portador.
Se inyect una porcin de 1lL de la muestra con una relacin de divisin de 50: 1. La entrada se
mantuvo a 250C. los el perfil de temperatura de la columna fue el siguiente: 60C durante 2 min;
calentado a 200C a 10C / min; calentamiento adicional a 240C en 5 \ mu C / min y se mantuvo
durante 7 min. Un detector de ionizacin de llama fue utilizado a 250C. Los cidos grasos fueron
identificados y cuantificados en comparacin con los cromatogramas de las FAME estndar. El
contenido de lpido total de cido sulfrico se calcul como la suma de los cidos siguientes cinco
FAMEs: palmitato de metilo (C16: 0), metil estearato (C18: 0), oleato de metilo (C18: 1), linoleato de
metilo (C _ {18}: 2), y eicosapentaenoato de metilo (C _ {20}: 5).
Resultados

Efectos de la concentracin de acetato de amonio (cultivos de frascos de agitacin)

Los efectos de la concentracin inicial de amonio acetato de etilo en el medio de cultivo (1,44 7,70
g / L) la produccin de biomasa y carotenoides en frascos de agitacin se muestran en la figura 1.
Ambos medios contenan el mismo valor inicial concentracin de glicerol (100 g / l) como fuente de
carbono adicional. El consumo de acetato (derivado de amonio acetato) se midi como cido actico
[24]. Aunque el acetato se consumi fcilmente, el concentracin inicial ms alta de acetato de
amonio impacto adverso sustancial sobre la concentracin final de biomasa (Figura 1).

El perfil de crecimiento de la biomasa en acetato (Fig. 1a) era consistente con el cido diauxico
crecimiento: inicialmente, hubo un rpido crecimiento del acetato hasta fue consumido
completamente. Esto fue seguido por un perodo de 3 das de crecimiento lento durante el cual las
clulas se adaptan para consumir glicerol.

Durante el da 1 de cultivo, la concentracin de carotenoides en las concentraciones acetato

aument, pero la produccin ces tan pronto como la biomasa dej de crecer (Fig. 1b).

Por el contrario, la concentracin de carotenoides aument prcticamente en paralelo con la

concentracin de biomasa en el medio de acetato de amonio bajo (Fig. 1a) y la concentracin final
fue de casi 0,54 mg / L (Fig. 1a), o ms de diez veces mayor que la concentracin en el acetato de
amonio.

Efecto del tamao del inculo en la produccin de carotenoides en cultivos discontinuos de

biorreactores

El efecto del tamao del inculo sobre el crecimiento de la la produccin de carotenoides se

examin en biorreactores discontinuos culturas. El pH no se control, ya que la buena biomasa
crecimiento y produccin de carotenoides en lotes frascos de agitacin sin control de pH (Fig. 1a).
La concentracin inicial de acetato de amonio en estas fermentaciones fue 1,44 g / l, ya que la mayor
concentracin haba inhibido el crecimiento.

El tamao del inculo tambin afecta la produccin de metabolitos en ciertas fermentaciones [26,
27]. Los tamaos del inculo del 15% (v / v) y el 20%.

Al final de la fermentacin de 7 das, el mximo las concentraciones de biomasa fueron de 2,6 g / L

para la fermentacin con el inculo ms grande y 3,8 g / l para el fermentacin con el inculo ms
pequeo (Fig. 2a). En ambos fermentaciones, el acetato se consumi en un da y el los perfiles de
consumo de acetato fueron idnticos (Fig. 2b).
El consumo de glicerol siempre fue ms lento que el consumo de acetato, sugiriendo acetato para
ser una fuente de carbono ms fcilmente metabolizada. Un ms pequeo inculo tambin redujo
la formacin de espuma en las primeras fermentacin.

Los perfiles de pH fueron poco afectados por el tamao del inculo (Figura 2c). En ambos casos, el
pH aument rpidamente durante la primer da (figura 2c). Durante este perodo, el acetato
derivado de acetato de amonio estaba siendo consumido (Figura 2b) y la concentracin de amonaco
en el medio de cultivo subi para causar un aumento del pH [28].

Como se ha indicado anteriormente, los experimentos anteriores se llevaron a cabo sin controlar el
pH. Slo el pH inicial se ajust a 6,8. Esto se debi a que se haba encontrado pH no afectar a la
produccin de carotenoides, tal como se confirm Fig. 3.

Cultivos de lote alimentado en el biorreactor

Como se discuti en la seccin anterior, en fermentaciones discontinuas el acetato se consumi en

las primeras 24 h (figura 2b). Por lo tanto, se evaluaron tres operaciones separadas alimentadas por
lotes para reponer peridicamente los nutrientes y prevenir un aumento de las concentraciones a
niveles inhibitorios.

As, el da 5, la fermentacin alimentada con una combinacin de cido actico y acetato de amonio
(AA \ alpha MA, Fig. 4a) tenan una concentracin de biomasa mayor que la mejor fermentacin por
lotes (15% de inculo, Figura 2a) del bioreactor.

En la fermentacin alimentada con el cido actico, el crecimiento de la biomasa disminuy 1 da

despus inicial y la concentracin final de la biomasa fue en comparacin con las fermentaciones
alimentadas con acetato de amonio y la fermentacin alimentada con el (una alimentacin de
acetato de amonio al da 1 seguido de una alimentacin de cido actico en cada uno de los das 2
y da 3) (figura 4a).

Se haba acumulado tanto cido actico al da 3 en la fermentacin alimentada con cido actico
que el pH del cultivo disminuy a alrededor de 4,9 (figura 4c). Consumo de cido actico cesaron
precozmente en la fermentacin alimentada con cido actico porque el alimento no contena
nitrgeno y ningn otro fuente de nitrgeno en el medio de cultivo. Algunos de el carbono necesario
para el crecimiento se deriv de glicerol que se consumi hasta el da 2 en el cido actico
alimentado cultivo (figura 4b). Una vez que el crecimiento de la biomasa ces, no hubo consumo
adicional de glicerol (figura 4b).

Las fermentaciones alimentadas con acetato de amonio o una combinacin de los dos sustratos
(una alimentacin de acetato de amonio seguido de dos tomas de cido actico cido) contena
nitrgeno en la alimentacin, y ambos alcanzaron una concentracin de biomasa final igual de alta
de casi 4 g / L (Figura 4a).
En la fermentacin alimentada con las dos fuentes (una de acetato de amonio seguido de dos tomas
de cido actico cido), no hubo acumulacin de acetato (Fig. 4b). Como parte del carbono
necesario para el crecimiento se deriv de acetato, el consumo de glicerol fue menor que en la
fermentacin alimentado con acetato de amonio solo (figura 4b). Como con la fermentacin
alimentada con acetato de amonio puro, el El pH inicialmente aument a casi 8,5, pero disminuy
con alimentndose a valores ligeramente cidos (Fig. 4c).

Los carotenoides no contienen nitrgeno y, por lo tanto, se puede producir en principio bajo
nitrgeno condiciones limitantes siempre y cuando haya suficientes biomasa y una oferta de
carbono. De hecho, los microorganismos tales como las microalgas son conocidas por producir ms
carotenoides en condiciones de hambre de nitrgeno [31]. Para la fermentacin alimentada con una
mezcla de cido actico y acetato de amonio, la concentracin de carotenoides fue el ms alto a
casi 0,09 mg / L (Fig. 4a). En esta fermentacin, no hubo acumulacin de acetato (figura 4b),

La alta concentracin final de la biomasa combinada con una limitacin de nitrgeno la alta
concentracin observada de carotenoides (Figura 4a).

Esta se utiliz para: prevenir la limitacin del nitrgeno demasiado pronto en la fermentacin;
mejorar el consumo de glicerol y, por lo tanto, la produccin de la biomasa; y prevenir excesiva
acidificacin del caldo de cultivo.

Discusin

El intenso color rojo anaranjado de la biomasa producida con una concentracin inicial baja de
acetato de amonio (figura 6a) se debi a un alto contenido de carotenoides. La biomasa con una
alta concentracin de acetato de amonio un color menos intenso (Fig. 6b). Por lo tanto, condiciones,
R. opacus puede ser inducido a sobreproducir carotenoides.

Los presente estudio confirm esto, pero una concentracin inicial demasiado alta (por ejemplo,
7,7 g / l) de acetato de amonio en realidad claramente la produccin de biomasa y carotenoides
(Figuras 1, 6). Una alta concentracin de acetato de amonio es tambin conocido por inhibir el
crecimiento de algunas otras bacterias [38], pero el mecanismo detrs de este efecto sigue siendo
desconocido.

Por lo tanto, el acetato de amonio tuvo que ser suplementado con una fuente adicional de carbono.
El glicerol fue utilizado como ms barato que la glucosa.

Anteriormente, para R. opacus MITGM-173, una cepa genticamente modificada, una glicerol
concentracin de 80 g / L se inform [17] para lograr una alta concentracin de la biomasa en un
perodo de 6 das cultivo por lotes.

Las diferencias en las concentraciones finales de biomasa (Fig. 2a) en la fermentaciones realizadas
con diferentes tamaos de inculo se explicaron en parte por las diferencias en el concentraciones
iniciales totales de los nutrientes en estos cultivos:
Como el inculo en s es mayormente agotamiento de los nutrientes, al comienzo de la biorreactor
con un inculo ms pequeo tena un tamao algo mayor (* 6% ms grande) de todos los nutrientes
comparados al biorreactor que comenz con un inculo ms grande [26, 42]. Adems, un inculo
ms pequeo tambin tiene el potencial para reducir el costo total de producir una fermentacin
producto.

En todos los cultivos discontinuos de biorreactores (Figuras 2, 3), el consumo de glicerol era baja y
la mayor parte del glicerol inicial se mantuvo en el medio al final de la fermentacin. Esta fue el
resultado de una insuficiencia de nitrgeno.

Una diferencia clave entre el matraz de agitacin y el biorreactor los cultivos por lotes eran la forma
en que se agitan. Aunque un velocidad de agitacin de 200 rpm en ambos casos, la biorreactor utiliz
agitacin mecnica con tres impulsores mientras que los frascos de agitacin utilizaban mezclas sin
impulsor agitador orbital. Estas diferencias significaban que una ambiente de estrs por
cizallamiento prevaleci en el biorreactor los frascos de agitacin.

Sin embargo, en el presente trabajo, siempre y cuando el pH inicial se ajustara a 6,8, el control del
pH era totalmente innecesario tanto para la produccin de la biomasa y los carotenoides por R.
opacus.

Acido Actico se utiliz para proporcionar acetato debido a que el acetato (de acetato de amonio)
se haba demostrado anteriormente que se consuma rpidamente (por ejemplo, la figura 1),
mientras que el glicerol slo lentamente metabolizado (por ejemplo, Fig. 3b). Esta combinacin de
una fuente de carbono metabolizada rpidamente (es decir, acetato) y una fuente de carbono
metabolizada lentamente (es decir, glicerol) prevenida una limitacin de carbono mientras se
permite que la tasa de controlado a menos que el valor mximo posible. Limitando se ha encontrado
que es necesario inducir acumulacin de compuestos ricos en carbono de alta energa, como los
carotenoides y los lpidos de almacenamiento en muchos microorganismos [41].

A diferencia de B. trispora y muchos otros productores de carotenoides, R. opacus puede

proporcionar simultneamente aceites triglicridos para su uso en la produccin de los
biocombustibles.

Observaciones finales

En matraces de agitacin, el acetato de amonio a una concentracin inicial de 1,44 g / l result ser
satisfactoria para soportar crecimiento de la biomasa y la produccin de carotenoides MSM que
contiene glicerol a una concentracin de 100 g / l. Una concentracin inicial de amonio acetato era
inhibitorio. En cultivos discontinuos de biorreactores sin control de pH, un tamao de inculo del
15% (v / v) del volumen de trabajo en el biorreactor proporcion buena biomasa produccin de
carotenoides en comparacin con un inculo ms grande. El uso del mtodo de alimentacin de la
Tabla 1 en una operacin alimentada por lotes mejor la produccin de la biomasa y los
carotenoides por casi dos veces en comparacin mejor en el biorreactor. Un control del pH era
innecesaria para maximizar la produccin de carotenoides. La biomasa contena casi 41% p / p de
lpidos totales.