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CENTRO DE CIENCIAS BSICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA

Periodo Agosto-Diciembre 2017

MANUAL DE PRCTICAS DE
INMUNOLOGIA

NOMBRE DEL ALUMNO:


_____________________________________________________

CARRERA: BIOTECNOLOGIA
SEMESTRE: QUINTO

NOMBRE DEL PROFESOR QUE IMPARTIR EL CURSO:


Dra. en C. Haydee Martnez Ruvalcaba

Apoyo Tcnico: M en C Jos Luis Carrasco Rosales

ELABORADO POR: M. en C. Rebeca Ceballos Salazar y


Dra. Mariela Jimnez Vargas

FECHA DE ACTUALIZACION: JUNIO 2017


LABORATORIO DE INMUNOLOGIA
BIOTECNOLOGIA

PROFESORES:
OBJETIVOS GENERALES:

Que el alumno sea capaz de:

1. Adquirir el conocimiento prctico que permita entender las bases tericas de la respuesta
inmune.
2. Aplicar los conocimientos y la metodologa analtica actualmente utilizada para realizar
distintos tipos de reacciones inmunolgicas.
3. Adquirir conocimientos bsicos para el diseo y desarrollo de diferentes tcnicas
inmunolgicas aplicadas en Biotecnologa.

DESCRIPCION DEL CURSO:

El curso consta de una sesin de laboratorio de dos horas por semana, el da martes.
Las sesiones constarn de una presentacin oral por parte del profesor, la cual busca preparar
a los alumnos con conceptos generales para la realizacin de la prctica.

REGLAMENTO:

1. Los alumnos deben presentarse al laboratorio adecuadamente preparados, habiendo


consultado previamente en su manual la prctica correspondiente. EL ALUMNO DEBE LEER
CON DETENIMIENTO LA TCNICA A SEGUIR, ya que el profesor podr hacerla preguntas
de la prctica.

2. Los alumnos deben usar bata BLANCA para entrar al laboratorio.

3. Los alumnos NO deben entrar y salir del laboratorio a voluntad. Deben esperar fuera del
laboratorio hasta que el maestro o instructor llegue y les indique que pueden entrar.

4. Est prohibido fumar o comer dentro de los laboratorios.

5. Los alumnos deben mantener el orden dentro de los laboratorios.

6. Deben dejar su rea de trabajo limpia y ordenada.

7. La basura debe colocarse en los recipientes correspondientes. Las substancias corrosivas o


contaminadas se dejarn en depsitos adecuados sobre las mesas.

8. Los alumnos deben lavarse las manos con agua y jabn al finalizar cada prctica.

9. El alumno tiene la obligacin de permanecer en el laboratorio hasta que la prctica se d por


terminada.
EVALUACIN DE LOS APRENDIZAJES DE LA MATERIA

La evaluacin de los estudiantes comprender:


Primer parcial de teora: 15%
Segundo parcial de teora: 15%
Tercer parcial de teora: 15%
Final acumulativo de teora: 22.5%
Actividades de integracin terica: 7.5%
Primer parcial de laboratorio: 10%
Final acumulativo de laboratorio: 12.5%
Reportes y actividades en laboratorio: 2.5%

LINEAMIENTOS DE TRABAJO DURANTE EL CURSO


Al inicio de la clase el profesor realizar a algunos alumnos elegidos al azar preguntas
relacionadas con el conocimiento aprendido en las clases anteriores.

No est permitido que los alumnos usen celulares. El uso de tabletas o computadoras est
autorizado nicamente para tomar notas durante las clases.

El total de inasistencias en la materia incluir tanto las de las sesiones tericas como
prcticas. En caso de inasistencia a una sesin prctica o terica, se asignarn tantas
faltas como horas dure la sesin.

Las inasistencias debern de justificarse en la primera sesin que el alumno se incorpore al


curso tras su falta.
CALENDARIZACION DE LAS PRCTICAS DE INMUNOLOGIA PARA
BIOTECNOLOGA

FECHA No. DE PRACTICA NOMBRE DE LA PRACTICA

LINEAMIENTOS GENERALES: USO Y MANEJO


22 de Agosto DE ANIMALES DE LABORATORIO.
OBTENCION, TINCIN Y VIZUALIZACION DE
CELULAS HEMATOPOYETICAS EN SANGRE
29 de Agosto Prctica No. 1
PERIFERICA HUMANA MEDIANTE FROTIS
SANGUINEOS
5 de Septiembre Prctica No. 2 ENSAYO DE FAGOCITOSIS IN VITRO
OBTENCION DE CELULAS MONONUCLEARES,
RECUENTO CELULAR MEDIANTE
Prctica No. 3
HEMATOCITOMETRO Y DETERMINACION DE
19 de Septiembre Practica No.4
VIABILIDAD CELULAR.
PURIFICACIN DE LINFOCITOS T Y B DE
SANGRE PERIFERICA POR EL MTODO DE
COLUMNA DE NYLON
DETERMINACIN DEL NDICE DE
ESTIMULACIN DE PROLIFERECION DE
Prctica No. 5
26 de septiembre DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
CONCAVALINA A, SOBRE LINFOCITOS T POR
EL MTODO DE MTT
3 de Octubre PRIMER EXAMEN PARCIAL
VIAS DE INMUNIZACION, METODOS DE
SANGRADO Y OBTENCIN DE ANTISUEROS EN
10 de Octubre Prctica No. 6
ANIMALES DEL LABORATORIO CONTRA
ANTIGENOS SOLUBLES Y PARTICULADOS
PREPARACION DE UNA VACUNA BACTERIANA
17 de Octubre Prctica No. 7
INACTIVADA CONTRA Salmonella sp Y
REACCIONES DE PRECIPITACION:
REACCIONES DE PRECIPITACION EN TUBO
CAPILAR
24 de Octubre Prctica No. 8 INMUNODIFUSION DOBLE (METODO DE
OUCHTERLONY)
INMUNODIFUSION RADIAL O TCNICA DE
MANCINI
REACCION DE HEMOAGLUTINACION PARA LA
TITULACIN DE ANTICUERPOS PRODUCIDOS
DURANTE EL PROTOCOLO DE
31 de Octubre
Prctica No. 9 SENSIBILIZACIN CON ERITROCITOS DE
CARNERO.
DETERMINACIN DE LA ESPECIFICIDAD Y
SENSIBILIDAD
TIPIFICACION DE GRUPOS SANGUINEOS Y
7 de Noviembre Prctica No. 10 DETERMINACIN DE COMPATIBILIDAD
SANGUINEA
CARACTERIZACIN DE LA ESTRUCTURA DE
14 de Noviembre Prctica No. 11
LOS ANTICUERPOS MEDIANTE INMUNOBLOT
21 de Noviembre Prctica No. 12 INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
28 de Noviembre Prctica No. 13 ELISA INDIRECTA
5 de Diciembre EXAMEN FINAL ACUMLULATIVO
PRACTICA No. 1
OBTENCION, TINCIN Y VIZUALIZACION DE CELULAS HEMATOPOYETICAS EN
SANGRE PERIFERICA HUMANA MEDIANTE FROTIS SANGUINEOS

I. OBJETIVO:

Al finalizar la prctica, el alumno deber ser capaz de:

1. Diferenciar las clulas inmunitarias por su morfologa y tincin.


2. Elaborar un buen frotis sanguneo y realizar adecuadamente la tincin de Wright.
3. Realizar el recuento diferencial de los leucocitos

II. FUNDAMENTO

Tincin con colorante de Wright

El colorante de Wright va a permitir proporcionar un medio para observar e identificar a


los leucocitos sanguneos permitiendo al estudiante de inmunologa familiarizarse con la
morfologa de las clulas que participan en los mecanismos de defensa (clulas del sistema
inmune) y que pertenecen a las series linfoide (linfocitos), mieloide (monocitos/macrfagos),
granuloctica (polimorfonucleares: neutrfilos, eosinfilos y basfilos) y megacarioctica
(plaquetas). Adems permite determinar las caractersticas morfolgicas de los eritrocitos as
como las anormalidades de estructura, forma y tamao, su contenido de hemoglobina y sus
propiedades de coloracin. La informacin obtenida de un frotis de sangre perifrica depende
en gran parte de la calidad del extendido y la coloracin.

Los leucocitos o glbulos blancos son clulas que estn principalmente en la sangre y
circulan por ella con la funcin de combatir las infecciones o sustancias extraas; pero en
ocasiones pueden atacar los tejidos normales del propio cuerpo. Es una parte de las defensas
inmunitarias del cuerpo humano.

Hay diferentes grupos de glbulos blancos: los llamados polimorfonucleares


(neutrfilos, eosinfilos y los basfilos) y los mononucleares (los linfocitos y los monocitos).

Generalidades:

El mtodo que mejor permite observar los distintos tipos celulares de la sangre perifrica
es el frotis sanguneo (extensiones de sangre). El recuento leucocitario o frmula leucocitaria
est representado por el estudio de los neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfocitos y
monocitos y es una de las determinaciones ms importantes en hematologa e inmunologa, en
donde se aprecian multitud de cambios, compatibles con diferentes estados, con cuadros muy
especficos para determinadas afecciones. Para llevar a cabo esta observacin es necesario
utilizar una tincin que nos permita visualizar los componentes celulares ms importantes
encontrados en las clulas sanguneas.
La informacin que se obtiene al examinar las extensiones de sangre es sumamente
importante. Puede sugerir el diagnstico lo mismo que un corte histolgico y servir de
orientador para el tratamiento. La fidelidad de la informacin obtenida depende en gran parte,
de la calidad de las extensiones. Para que un mtodo d buenos resultados, hay que cumplir
con ciertos requisitos:

1. Los portaobjetos y cubreobjetos deben estar perfectamente limpios y sin grasa; lavarlos con
agua y jabn, enjuagarlos perfectamente con agua normal y por ltimo con agua destilada.
Enseguida se secan y se pulen con un trapo libre de pelusa. A partir de entonces se
manejan con cuidado tocando slo los bordes. Los cubreobjetos y portaobjetos lavados
pueden guardarse en alcohol de 95C;

2. La gota de sangre no debe ser demasiado grande.

3. El trabajo debe ser rpido, antes de que empiece la coagulacin.

Para el recuento diferencial, la sangre se toma de la yema de un dedo o del lbulo de la


oreja. Slo se requiere de una gota muy pequea, generalmente ms o menos al doble de la
cabeza de un alfiler; su tamao depende en gran parte del espesor de la extensin. El espesor
adecuado depende de la finalidad de la extensin. Para el estudio de la estructura de las
clulas sanguneas y para el examen del parsito del paludismo, deber ser tan fina que, en la
mayor parte de ella los eritrocitos estn en una sola capa, prximos entre s, pero no
sobrepuestos. Para el recuento diferencial de rutina de los leucocitos es mejor una extensin
en la que los eritrocitos estn algo apilados, porque as se distribuyen los leucocitos con ms
uniformidad, su nmero es mayor en una superficie dada y hace el recuento menos pesado.
Por otra parte la tincin no debe ser tan gruesa que resulte difcil identificar los leucocitos por
separado.

III. REACTIVOS
1. Colorante de Wright
2. Buffer para colorante de Wright
3. Aceite de inmersin

IV. MATERIAL Y EQUIPO:

1. Lancetas estriles y desechables


2. Torundas de algodn con alcohol al 70 % o con merthiolate
3. Portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados
4. Cajas de Coplin
5. Microscopio ptico de Campo Claro

IV. PROCEDIMIENTO:

1. Lave perfectamente sus portaobjetos y asegrese estn exentos de grasa.


2. Lave sus manos con agua y jabn.
3. Haga asepsia a la yema de un dedo con la torunda con alcohol.
4. Descubra la lanceta.
5. Mantenga en dedo hacia abajo y presinelo suavemente, pinchen la yema del dedo con la
lanceta con un movimiento rpido. Elimine la primera gota de sangre.
6. Coloque una pequea gota de sangre en uno de los extremos del portaobjeto limpio y
coloque el portaobjetos sobre una superficie plana.
7. Con el segundo portaobjetos limpio tocar la gota de sangre con uno de los bordes y dejar
que la sangre corra a travs de l. (ver figura 1).
8. A continuacin coloque este segundo portaobjetos en un ngulo de aproximadamente 30
y moverlo hacia el extremo opuesto del primer portaobjetos (cuanto menor sea el ngulo,
ms delgada tendremos la preparacin).
9. Deje secar el frotis a temperatura ambiente.
10. Coloque el frotis dentro del colorante de Wright contenido en una caja Coplin durante dos
minutos.
11. Retire la laminilla del colorante y retire el exceso.
12. Inmediatamente introdzcalo en la caja de Coplin con buffer durante 3-4 minutos.
13. Elimine el exceso de buffer.
14. Lave durante 15-30 segundos con agua destilada, retire el exceso y seque a temperatura
ambiente.
15. Tan Pronto como la laminilla se ha secado completamente, ponga una gota de aceite de
inmersin en el extremo ms delgado del frotis.
16. Observe la preparacin bajo el microscopio de campo claro con el objetivo 100X,
colocando previamente una pequea gota de aceite de inmersin.
17. Desplace la laminilla en forma de greca griega e identifique cada una de las clulas
sanguneas haciendo un dibujo de cada una de ellas.

18. Realice el conteo de los leucocitos y reporte sus resultados

Fig. 1 Pasos para realizar una extensin de sangre.

NOTA: Se facilita su identificacin tomando en cuenta que los ncleos son prpura o azules, el
citoplasma azul plido, granulaciones rojas en los eosinfilos, granulaciones azul prpura en
los basfilos y las plaquetas tambin azul prpura, eritrocitos rosa o lila.
IV. RESULTADOS:
En este punto incluya el recuento diferencial relativo y un dibujo a color de los diferentes
leucocitos, con los diferentes organelos que se distinguen con la tincin de Wright, junto
con sus respectivos nombres.

V. CUESTIONARIO

1. Cul es la composicin del colorante de Wright


2. Describe el fundamento de la tincin de los leucocitos empleando el colorante de Wright
3. Por qu es importante la frmula leucocitaria
4. Qu significa recuento diferencial absoluto y relativo
5. Cules son los valores normales de un recuento leucocitario relativo en nios y en
adultos?
6. Cul es la funcin de cada uno de los leucocitos?

VI. DISCUSION

Discutir sobre la importancia de una extensin de sangre bien teida en cuanto a la


diferenciacin de estructuras celulares y coloracin de las clulas y sus estructuras. Puede
incluir un punto aparte de observaciones en el cual se refiere a observaciones durante el
desarrollo de la prctica, tales como fuentes de error, precauciones, comentarios, aclaraciones
a la tcnica

VII. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

VIII. BIBLIOGRAFA:

Incluir las fuentes de informacin consultadas, proporcionando sus datos completos

1. I. Davidsohn; J.B. Henry: Diagnstico Clnico por el Laboratorio. Todd Sanford. 2000.
RCTICA No. 2
ENSAYO DE FAGOCITOSIS IN VITRO

I. OBJETIVO:

Al finalizar las siguientes prcticas el alumno ser capaz de:

1. Determinar la fagocitosis de las bacterias por los leucocitos sanguneos


2. Realizar la tincin de Wrigth-Giemsa en un frotis sanguneo para demostrar la
fagocitosis de bacterias por los leucocitos sanguneos.

II. FUNDAMENTO DE LA FAGOCITOSIS:

El fundamento para evaluar la fagocitosis es simple. Una gota de sangre completa


conteniendo leucocitos se mezcla con una gota de cultivo bacteriano de Stahylococcus
epidermidis e incubado a temperatura ambiente nos permite observar la fagocitosis de las
bacterias por los leucocitos. Primero las bacterias van a ser opsonizadas por molculas como
el componente C3b del complemento o por anticuerpos opzonizantes. Posteriormente los
microorganismos opsonizados van a ser fagocitado por los PMN o el monocito (macrfago) y
las clulas son teidas con el colorante de Wright.

Generalidades:

Los fagocitos son de dos clases diferentes, los monocitos/macrfagos y los


granulocitos polimorfonucleares (PMN).

El trmino de fagocitosis generalmente se limita a la evaluacin del paso inicial de la


destruccin bacteriana.

La fagocitosis mediada por PMN neutrfilos, constituye una de las principales defensas
del organismo husped en su lucha contra las infecciones producidas por bacterias y hongos.
El proceso de fagocitosis comprende varios pasos secuenciales: quimiotaxis, adherencia de las
partculas antignicas a la superficie de los fagocitos, captacin/ingestin (fagocitosis) y muerte
intracelular mediada por mecanismos dependientes e independientes del oxgeno. Los
fagocitos poseen receptores para el componente C3b del sistema de complemento, as como
para la regin constante de la molcula de inmunoglobulina. Esto permite que los
microorganismos opsonizados puedan adherirse a la superficie de estas clulas, facilitando la
fagocitosis.1

III. REACTIVOS

Colorante de Wright-Giemsa
Cultivo de Candida albicans.o Staphylococcus epidermidis
MATERIAL Y EQUIPO

1. Torundas con alcohol


2. Torniquete
3. Tubos Vacutainer con heparina y/o ACD y portaobjetos
4. Pipeta Pasteur con bulbo
5. Aguja para vacutainer y camisa
6. 3 Tubos de ensayo 12 X 75 mm
7. Tubos de microhematocrito con heparina y Portaobjetos
8. Mechero
9. Aceite de inmersin
10. Incubadora o bao mara a 37C
11. Centrifuga clnica

IV. PROCEDIMIENTO

1. Tomar una muestra de sangre en el tubo con heparina.


2. Centrifugar a 2500 rpm durante 15 minutos en centrfuga clnica.
3. Tomar los tres tubos de ensayo 12 X 75 mm y marcar uno con 0, 5, 10, 15, y 30 minutos
respectivamente.
4. Sacar el tubo de la centrifuga y obtener el Buffy Coat (capa leucocitaria).
5. Con la pipeta Pasteur coloque la gota de la capa leucocitaria dentro de cada uno de los
tubos marcados.
6. Aada una gota de cultivo de Candida albicans o Stahylococcus epidermidis en cada uno
de los tubos empleando con una pipeta Pasteur.
7. Tome los tubos y mezcle y haga un frotis delgado del tubo marcado con 0 min,
inmediatamente deje los otros tubos incubar a T.A. durante 5, 10, 15 y 30 minutos antes
de hacer el frotis.
8. Permita que el frotis se seque perfectamente.
9. Coloque el frotis dentro del colorante de Wright contenido en una Caja Coplin durante dos
minutos.
10. Retire la laminilla del colorante.
11. Inmediatamente introdzcalo en la caja de Coplin con buffer durante 3-4 minutos.
12. +Elimine el exceso de buffer.
13. Lave durante 15-30 segundos con agua destilada, retire el exceso y seque a temperatura
ambiente.
14. Tan pronto como la laminilla se ha secado completamente, ponga una gota de aceite de
inmersin en el extremo ms delgado del frotis.
15. Observe la preparacin bajo el microscopio de campo claro con el objetivo 100X,
colocando previamente una pequea gota de aceite de inmersin.

Comentarios:
Este frotis de sangre ser ms acuoso que el usual debido a la adicin de la gota de
cultivo de bacterias, lo que puede dificultar la extensin del frotis de sangre hasta el final del
portaobjetos, pero esto no es necesario que llegue hasta el final. Deber haber una notable
diferencia entre el frotis de 0 minutos con el de 5 minutos. El de 0 minutos probablemente no
presente fagocitosis, pero si bacterias pueden observarse en contacto con los leucocitos. El
frotis de 5 minutos deber mostrar bacterias dentro de las clulas como pequeos puntos
morados. Los neutrfilos sern las clulas fagocticas ms predominantes, pero en ocasiones
los monocitos pueden observarse. Las bacterias tambin pueden ser destruidas durante la
fagocitosis.

IV. RESULTADOS

En este punto incluyan las observaciones de los resultados obtenidos mediante la


esquematizacin de las imgenes observadas al microscopio de los tiempos considerados.

VI. CUESTIONARIO

1. Defina el fenmeno de la fagocitosis y describe el proceso


2. Cules son las principales clulas que realizan fagocitosis?
3. Cules son los principales mecanismos que emplea el fagocito para causar la muerte a
los microorganismos?
4. Qu papel juega el complemento C3b y C4b en la fagocitosis?

VII. DISCUSIN

Discutir sobre la importancia del fenmeno de fagocitosis como uno de los principales
mecanismos celulares de defensa de la inmunidad innata y su relacin con la inmunidad
especfica. Puede incluir un punto de observaciones en el cual se refiere a las
observaciones durante el desarrollo de la prctica, tales como fuentes de error, precauciones,
comentarios, aclaraciones a la tcnica, pero no la tcnica en s

VIII. CONCLUSIONES: Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los
resultados obtenidos.

IX. BIBLIOGRAFA: Incluir las fuentes de informacin consultadas, proporcionando sus


datos completos

1. Christine Dorresteyn Stevens, Ed.D, MT; Clinical Immunology and Serology. A


Laboratory perspective, F.A. Davis Company. 1996
1. Arce Mendoza A.Y., Rosas Taraco A.G., Rodrguez Tovar L. E; Prcticas de Inmunologa.
General Aplicada y Veterinaria.
PRACTICA No. 3
OBTENCION DE CELULAS MONONUCLEARES, RECUENTO CELULAR MEDIANTE
HEMATOCITOMETRO Y DETERMINACION DE VIABILIDAD CELULAR

I. OBJETIVO:

Al finalizar la prctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Purificar linfocitos a partir de sangre perifrica, observar, contar y determinar la viabilidad


celular de los linfocitos presentes en una suspensin, con el correcto uso de la cmara de
Neubauer.

III. FUNDAMENTO PURIFICACION DE LINFOCITOS.

Existen varios mtodos para separar a los linfocitos del resto de las clulas
sanguneas. Uno de los ms empleados es por flotacin en una solucin que tenga una
densidad igual a la de ellos. En esta prctica utilizaremos para la obtencin de linfocitos, la
tcnica de separacin de clulas mononucleares con solucin de Ficoll-Hypaque (polmero de
sacarosa de alto peso molecular (Ficoll) y un compuesto orgnico iodinatado (diatriazoato de
sodio, 3-5 bis acetilamino 2,4,6 cido triyodobenzico), el cual tiene una densidad de 1.077
g/ml que es idntica a la de los linfocitos y monocitos. Los granulocitos y eritrocitos que tienen
una mayor densidad, cuando se centrifuga la sangre en el gradiente de Ficoll-Hypaque, pasan
a travs de ste formando un paquete en el fondo del tubo. Cuando el inters es estudiar a los
linfocitos purificados, se pueden eliminar los monocitos mediante centrifugacin a una alta
velocidad. Adems, debido a que las plaquetas tienen una densidad menor permanecen en la
fraccin plasmtica, por lo que puede contaminar la fraccin de mononucleares. Para
eliminacin de estas ltimas se puede centrifugar la muestra a una baja velocidad.

Existen otras soluciones para la separacin de mononucleares utilizando gradientes de


densidad como Lympphoprep, Lymphopure o Hystopaque. Otra solucin altamente efectiva es
el del Percoll (solucin de partculas coloidales que contienen polivinilpirrolidona), an cuando
este se usa ms frecuentemente para la separacin de monocitos, granulocitos, eliminacin de
blastos y clulas muertas.

IV. REACTIVOS

1. 20 ml de solucin salina fisiolgica(SSF)


2. RPMI
3. Solucin estril de Ficoll-HypaqueTM o LymphoprepTM
4. Azul de Tripn al 0.4%

V. MATERIAL Y EQUIPO

1. 1 aguja para vacutainer


2. 1 frasco de alcohol con torundas
3. 1 liga torniquete
4. Tubo con heparina o con ACD
5. Microscopio ptico
6. Cmara de Neubauer
7. Micropipetas de 10 a 200 L
8. 2 tubos cnicos para centrfuga clnica de 1 ml
9. 1 pipeta Pasteur
10. Centrifuga clnica
11. Puntillas para micropipeta

V. METODOLOGIA:

Obtencin de sangre perifrica

1. Se obtienen 5 ml de sangre venosa del sujeto en estudio en un tubo con heparina o ACD
como anticoagulante.
2. Se centrifuga a 3500 rpm durante 5 min.
3. Una vez terminado el paso anterior, se extrae el buffy coat (leucocitos) y se coloca en un
microtubo.
4. Se resuspende con SSF (v/v)
5. En otro microtubo se colocan 500 microlitros de Ficoll-hypaque
6. Del resuspendido se toman 500 microlitros y se colocan en el tubo que ya contiene la
solucin de Ficoll-hypaque para estratificar (se coloca cuidadosamente por las paredes del
tubo)
7. Se centrifuga a 3500 rpm durante 5 min
8. En la interfase entre el Ficoll-hypaque y el plasma diluido quedan los linfocitos (anillo
blanco) los cuales se recuperan con una pipeta Pasteur.
9. Se transfieren las clulas a un tubo de ensaye y se lava por centrifugacin 3 veces con
SSF 1500 rpm durante 5 minutos (centrifuga clnica).
10. Se resuspenden las clulas en 1 mL de medio RPMI y se procede a ver viabilidad y su
conteo
11. Para realizar el conteo de las clulas se hace una dilucin de 1:10, tomando 20 L de la
suspensin de las clulas y 80 L de azul de trypano (colorante no vital).
12. Una vez contadas se ajustan a una concentracin de de 4x10 6 linfocitos/ml utilizando las
cmaras de Neubauer.
13. Cabe sealar que esta tcnica es un mtodo que tiene solo como propsito la separacin
de las clulas, sin el propsito de cuantificar.

Conteo en cmara de Neubauer.

1. Limpie la cmara y el cubreobjeto con alcohol al 70% y posteriormente con agua destilada.
2. Coloque el cubreobjeto sobre la cmara en forma horizontal sobre la mesa de trabajo,
este debe quedar centrado.
3. Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribucin
de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea ya que la cmara se
llena con 10 l. El llenado debe ser continuo en un solo intento.
4. La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de
llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara es
de lquido abundante en las terminaciones del recuadro.
5. Conteo: Lleve la cmara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de
10X y posteriormente 40X.
6. Buscar el primer cuadro donde se realizar el recuento. Considerando que para el
recuento de leucocitos, generalmente se consideran los 4 cuadrados de las esquinas y el
del centro.
7. Comenzar con el recuento de clulas en el primer cuadrado seleccionado. Considerar que
por regla, si las clulas tocan el lmite superior o el izquierdo deben contabilizarse, pero no
as aquellas que tocan al lmite inferior o el derecho. Y repetir el procedimiento para los
siguientes cuadrados.
8. Una vez obtenido el total de las clulas contadas se debe aplicar la siguiente frmula para
obtener la concentracin de clulas
Concentracin (clulas/ml) = nmero de clulas/ volumen (en ml)
Considerar que como el volumen de un cuadrado grande es de:
0.1 cm X 0.1 cm = 0.01cm 2 (rea)
0.01 cm2 X 0.1 mm (profundidad) = 0.01 cm2 X 0.01 cm= 0.0001 cm 3 = 0.0001 ml
por lo tanto,
Concentracin = (nmero de clulas X 10 000)/ nmero de cuadros contados
En aquellos casos donde se utilice dilucin, se debe multiplicar por el factor de dilucin.

Figura. Recuento celular en la cmara de Neubauer.

Viabilidad celular:

Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes mtodos. El ms comn es


el de tincin con azul trypn. El azul trypn es un coloide que se introduce en el interior de las
clulas que presentan roturas en la membrana. As pues las clulas que aparecen en la
imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar clulas blancas, por
exclusin, a clulas viables es un error pues por este mtodo se sobrevalora la viabilidad de las
clulas en la suspensin, determinando como inviables slo aquellas con la membrana rota.

VI. RESULTADOS
En este punto incluyan un diagrama de cmo se observ la separacin de las clulas
mononucleares despus de la centrifugacin. As como tambin los clculos necesarios para el
conteo de las clulas y la determinacin de la viabilidad celular.

VI. CUESTIONARIO

1. Cul es el fundamento de la separacin de los linfocitos a partir de sangre perifrica


por de Ficol-Hypaque?
2. Describe otro mtodo de separacin de clulas mononucleares.
3. Describe un ejemplo en el que puedas utilizar estas clulas.

VII. DISCUSION

Discutir los resultados y la importancia de la separacin de las clulas mononucleares


a partir de sangre perifrica

VIII. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

IX. BIBLIOGRAFIA:

1. Arce Mendoza A.Y., Rosas Taraco A.G., Rodrguez Tovar L. E. Prcticas de


Imunologia general aplicada y Veterinria.
2. Manual de prcticas de Histocompatibilidad. XXIX Curso terico prctico de
actualizacin en inmuno gentica. Dpto de Inmunogentica, INDRE, Mxico D.F.
3. Faustina Rubio C., Benjamin Garca E., Manuel Carrasco C.; Inmunologa. Aplicaciones
prcticas en Hematologa y Microbiologa. Editorial Paraninfo. 1995.
PRACTICA No. 4
PURIFICACIN DE LINFOCITOS T Y B DE SANGRE PERIFERICA POR EL MTODO DE
COLUMNA DE NYLON

I. OBJETIVO:
Al finalizar la prctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Purificar linfocitos T y B a partir de sangre perifrica por su capacidad de adherencia al


nylon (basndose en sus propiedades extrnsecas de los leucocitos).

II. INTRODUCCION:

Son muchas razones, por la cuales es necesario necesario trabajar con poblaciones
enriquecidas en linfocitos B o T. Como ya se sabe, es difcil diferenciar a un linfocito B de un
linfocito T morfolgicamente, ya comparten muchas caractersticas. Sin embargo, tambin son
muchos los puntos que los hacen nicos; y es de estas propiedades que se valen diferentes
tcnicas inmunolgicas para su separacin. Existen 5 tcnicas generales en uso:

Panning: es el secuestro de clulas ya sea T o B mediante el empleo de anticuerpos


especficos fijados a una superficie plstica, como anti-CD3 (para linfocitos T) o anti-CD19
(para linfocitos B), anticuerpos especficos para las clulas que se desean eliminar del medio..
As, las clulas de inters se quedarn en el sobrenadante.
Citotoxicidad mediada por anticuerpos y complemento: consiste en eliminar a linfocitos B o
T mediante el uso de anticuerpos especficos para cualquiera de estas poblaciones, bajo la
presencia de complemento, de tal forma que se activar la va clsica del complemento y se
lisarn las clulas blanco.
Separacin por perlas magnticas: Las perlas supermagnticas son partculas de menos de
1 micra de dimetro recubiertas con anticuerpos monoclonales. Las perlas se recolectan
mediante el uso de un campo magntico. Cuando este se deja de aplicar. Las perlas pierden
cualquier magnetismo residual, y pueden ser magnetizadas y dispersadas respectivamente. La
especificidad del anticuerpo monoclonal que se le acopla a las perlas, determina el tipo de
clulas que se va a obtener. Por ltimo, se separan los linfocitos de las perlas mediante el uso
de un anticuerpos anti-Fab, que se une por competencia a la regin Fab del anicuerpo anti-
linfocito y as se libera el linfocito.
Formacin de rosetas: los linfocitos T poseen una molcula CD2, que tiene la capacidad de
unirse a una substancia presente en la membrana de los eritrocitos o glbulos rojos de carnero,
de modo que si estos ltimos se agregan a una poblacin purificada de linfocitos solamente los
que sean T quedarn cubiertos por los glbulos rojos dando el aspecto de una roseta que en
este caso se conoce como roseta E o roseta directa. Siendo ste uno de los primeros mtodos
para diferenciar entre las clulas T y B humanas.
Citometra de flujo: se basa en la separacin de linfocitos T o B emplenado un citometro
sorter, que separa clulas activadas por fluorescencia despus de incubarlas con anticuerpos
anti-linfocitos B o T conjugados con molculas (fluorocromos) que emiten fluorescencia al ser
excitadas a determinada longitud de onda.

Aqu se describe la separacin por columna de Nylon.

III. FUNDAMENTO:

En 1977 el Dr. Warner dise un procedimiento para aislar linfocitos B y T a partir de


clulas mononucleares de sangre perifrica, con un enriquecimiento de linfocitos B de al menos
el 80%, basado en la adherencia diferencial de linfocitos B, T y monocitos a la lana de Nylon a
37C. Los linfocitos T no se adhiere al nylon, los monocitos lo hacen y no se pueden separar de
esta, mientras que los linfocitos b lo hacen pero se desprenden al ejercer presin mecnica
sobre la lana y el medio lquido en el que se realiza el proceso.
IV. REACTIVOS

1. Solucin de RPMI simple


2. Medio RPMI 1640 suplementado con SFB al 5% y 0.5%
3. Suero fetal bovino (SFB) descomplementado a 56C en bao mara
4. Solucin de azul tripano al 0.4%

V. MATERIAL Y EQUIPO

MUESTRAS 5. Cmara cuenta glbulos


1. Popotes de plstico translucidos 6. Microscopio ptico
2. Tubos Fisher de plstico desechable 7. Incubadora a 37 C
3. Centrifuga Fisher 59 8. Fibra de nylon Fenwal.
4. Pipetas Pasteur de tallo largo

VI. PROCEDIMIENTO

A. Preparacin de la fibra de nylon de tapicera:

1. Se lava la fibra de nylon con HCl 1N 3 veces cuidando que toda la lana quede sumergida
en el acido.
2. Se elimina el HCL y se lava 3 veces con NaOH 1N.
3. Se elimina el exceso de lcali con agua destilada; las veces necesarias hasta que el pH
del ltimo lavado sea igual al del agua.
4. Se deja secar colocndola en forma extendida totalmente en la estufa a 37C.

B. Preparacin de la columna:

1. Se pesan de 70-90 mg de nylon Fenwall sin tratar o de tapicera previamente tratado. Se


peina bien y se sumerge en 5mL o ms de solucin de Hanks simple.
2. Se corta un popote comn a una altura de 10 cm aproximadamente y se cierra uno de los
extremos a la flama en ngulo de 45 grados, usando una pinza.
3. La lana bien peinada se empaca en el popote uniformemente y en forma laxa, ocupando
una altura aproximada de 10cm. Cuidar que no llegue al extremo cerrado. Se hace una
horadacin en dicho extremo del popote para permitir la salida del lquido. Se lava una vez
con solucin de medio RPMI precalentado a 37 grados centgrados (con SFB al 5%) y se
incuba durante 30 minutos en forma horizontal a 37 grados centgrados.
4. Se saca la columna y se elimina todo el medio.

C. Separacin de linfocitos B y T en la columna:

1. Los linfocitos totales purificados por gradiente de ficoll, (ver tcnica de separacin de
linfocitos totales), se resuspenden en 1.0 ml de medio RPMI con 5% de SFB y se pasan a
la columna. Inmediatamente despus se coloca la columna en forma horizontal y se le
agrega suficiente medio para evitar la evaporacin (con la precaucin de que no quede
aire entre la lana y el medio).
2. Se incuba la columna en posicin horizontal durante 30 minutos a 37C.
3. Pasado este tiempo se coloca la columna sobre un tubo marcado como linfocitos T y se
deja escurrir el contenido.
4. Pasar a travs de la columna aproximadamente 15 ml de medio RPMI con SFB al 5%
previamente calentado a 37C. Las clulas T eludas en la columna, se cuentan y se
ajustan a 2.5 x 106/ mL.
18

5. Los linfocitos B que se han adherido al nylon se recupera en otro tubo marcado como
linfocitos B, presionado y exprimiendo la columna. Se lava con medio RPMI fro, que
contiene 0.5% de SFB o suero AB.
6. Se centrifugan las clulas T y B a 1,500 rpm durante 10 minutos. Recuperar el botn y
ajustar las clulas a 2.0-2.5 x106mL, con medio completo.

NOTA 1: en promedio, este procedimiento da un rendimiento del 80-90% de clulas.


NOTA 2: la proporcin de clulas T y B debe ser de 5:1 o de 5;2. Si la relacin es menor, es
decir, que haya ms clulas B, significa contaminacin de T en la suspensin de B lo cual
producir reacciones falso negativas al realizar la tipificacin de clase II.
NOTA 3: En caso de que exista contaminacin con plaquetas realizar lo siguiente:

1. Los linfocitos B se resuspenden en 1 ml de medio y se les agrega 1 gota de trombina


(100 /ml), se agita durante 1 minuto manualmente y se centrifuga a 1 000xg durante
30 segundos (1500 rpm 1 2 minutos).
2. Se recupera el sobrenadante. Se la va una vez con un medio y se ajusta la
concentracin celular a 2.0-2.5x106/ml, con medio RPMI completo.

VII. RESULTADOS

En este punto incluyan un diagrama de cmo se observ la separacin de las


subpoblaciones celulares. As como tambin los clculos necesarios para el conteo de las
clulas y la determinacin de la viabilidad celular.

VIII. CUESTIONARIO

1. En qu se basa la separacin de las subpoblaciones celulares por columna de nylon?


2. Cmo confirmara que las poblaciones celulares que obtuvo son linfocitos B o T?.En qu
casos se recomienda usar la separacin de las subpoblaciones celulares por columna de
Nylon?

VIII. DISCUSION
Discutir sus resultados y la importancia de la separacin de las clulas
mononucleares por el mtodo de columnas de Nylon.

IX. CONCLUSIONES:
Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFIA:

Manual de prcticas de Histocompatibilidad. XXIX Curso terico prctico de


actualizacin en inmunogentica. Dpto de Inmunogentica, INDRE, Mxico D.F.

Arnaiz-Villena A, Regueiro JR, Lpez-Larrea C (1995). Inmunologa. Editorial Complutense;


255-260.
19

PRACTICA No. 5
DETERMINACIN DEL NDICE DE ESTIMULACIN DE PROLIFERECION DE DIFERENTES
CONCENTRACIONES DE CONCAVALINA A, SOBRE LINFOCITOS T POR EL MTODO DE
MTT

I. OBJETIVO:
Al finalizar la prctica, el alumno ser capaz de:
1. Montar un ensayo de proliferacin de linfocitos.
2. Determinar el ndice de estimulacin del mitgeno Concanavalina A.

II. INTRODUCCION:

El ensayo de proliferacin de linfocitos o linfoproliferacin in vitro en respuesta a un


mitgeno o a un antgeno especfico es uno de los mtodos ms utilizados en la investigacin.
Existen diferentes mtodos para esta determinacin, como lo es la incorporacin de isotopos
radioactivos, que aunque son tcnicas muy sensibles tienen diferentes desventajas como el
requerimiento de equipos costosos e instalaciones particulares as como la seria contaminacin
ambiental. De ah que se sugieren tcnicas alternativas como ensayos colorimtricos con sales
de tetrazolio.

Las sales de tetrazolio son extensivamente utilizadas en ensayos de proliferacin y


citotoxicidad, entre estas se encuentra 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro difeniltetrazolio,
mejor conocido como MTT. El ensayo de MTT se basa en la reduccin de este compuesto por
deshidrogenasa mitocondriales de clulas viables a formazn purpura, producto de color azul,
el cual es proporcional al nmero de clulas vivas presentes en el medio.

III. REACTIVOS:

1. Medio RPMI sin rojo fenol suplementado (FCS 5% y Penicilina-Estreptomicina 1%) fro
2. Solucin madre de ConA 1mg/ml
3. Solucin madre de MTT 5mg/ ml
4. Isopropanol cido 0.1N
5. Azul Trypan al 0.4%
6. Solucin salina fisiolgica 0.9% fra

IV. MATERIAL:

1. 1 Jeringas de 10 ml con aguja de insulina


2. 1 Caja de Petri estril
3. Tubos de ensayo estriles, con tapn
4. Micropipetas de diferentes graduaciones y puntas
5. Tubos eppendorf de 600 l
6. Placas de ELISA de 96 pocillos
7. Incubadora con CO2
8. Campana de esterilidad
9. Lector de ELISA
20

V. PROCEDIMIENTO:

1. Extraer un bazo de rata en las mayores condiciones de esterilidad posible y mantenerlo


en solucin salina fisiolgica (SSF) al 0.9% fra dentro de una caja Petri.
2. Dividir el bazo en 2, y hacer pasar por cada mitad 10ml de SSF fra con una jeringa, con
aguja de insulina dentro de la caja Petri.
3. Recolectar la suspensin y centrifugarla a 1000 rpm durante 10 minutos dentro de tubos
estriles con tapa.
4. Resuspender la pastilla con 5 ml de solucin de cloruro de amonio fro 0.15M pH 7.2,
durante 5 minutos, pasado este tiempo llevar la solucin a 10ml con SSF fra y centrifugar
a 1000 rpm durante 10 minutos.
5. Repetir este lavado tres veces ms.
6. Resuspender la pastilla en 1 ml de RPMI suplementado. Y determinar el rendimiento,
viabilidad y pureza.
7. Posteriormente se debe realizar el diseo del experimento, para lo cual se deben
considerar trabajar con dos diferentes concentraciones de clulas, 2*105 y 5*105 clulas
por cada 100 l de medio RPMI suplementado. Las clulas se sometern a dos
concentraciones de estmulos con el mitgeno concanavalina A (ConA), 1 y 5 g/ ml, y se
debe considerar una condicin basal, en donde no se retar con nada a las clulas. As
como un control interno de la tcnica en donde solo se coloca el medio para comprobar
que el medio por s solo no genera interferencia. Para ello se consideran dos lneas
horizontales por ensayo, ya que cada punto se debe realizar por triplicado.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A
B
C
D
E
F
G
H

8. Una vez definido esto, en condiciones de esterilidad se comienza a cargar la ConA, para
asegurarnos de depositarla en el fondo del pocillo, para ello en ambas lneas se dejan los
primeros dos pocillos vacos (basales), a los siguientes tres pozos se carga 1 l de una
solucin del mitgeno a una concentracin de 1g/l, mientras que a los siguientes tres se
cargan con 5 l de la misma solucin.
21

9. En seguida se deposita el medio a cada pocillo considerando el volumen de las clulas y


el mitgeno, de manera que al final quede un volumen total de 100 l.
10. Por ltimo, se cargan las clulas en cada pocillo, considerando que en la primer lnea
quedar una concentracin celular de 2*105 y en la segunda 5*105 clulas. El volumen a
cargar de la suspensin celular se determina de la siguiente manera:
ml de clulas = (1ml de suspensin celular) x (Concentracin celular)
Rendimiento de linfocitos vivos

NOTA: Dejar al final de cada lnea un pocillo con 100 l de medio RPMI.

11. Una vez cargadas completamente las placas se incuban a 37C, en cmara hmeda al 5%
de CO2 por 72 o 96 horas.
12. Pasado este tiempo, a cada pocillo se le adiciona 10 l de una solucin madre de MTT (3-
(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) de 5mg/ml.
13. Nuevamente se incuban las clulas a 37C, en cmara hmeda al 5% de CO2 por 4 horas.
14. Pasado este tiempo, se adiciona 100 l de isopropanol cido 0.1N por pozo (por cada 100
l de medio), se mezcla muy bien con ayuda de la micropipeta, para asegurarse de que
los cristales queden totalmente disueltos.
15. Enseguida se lee la densidad ptica (DO) en el lector de ELISA a 595nm. No debe pasar
ms de una hora para hacer la lectura.
16. El ndice de estimulacin de proliferacin se calcula dividiendo la DO del grupo problema
(con mitgeno) entre el grupo basal (sin mitgeno).

NOTA: se debe trabajar en condiciones de esterilidad, ya que las clulas se incubaran


durante un tiempo prolongado, y la contaminacin con bacterias puede alterar los
resultados.
VI. RESULTADOS:

En este punto incluya una grfica donde se represente el ndice de estimulacin de las
diferentes concentraciones del mitgeno sobre diferente densidad celular, as como los
clculos para llegar a este.

VII. CUESTIONARIO:

2. Por qu se utiliza como mitgeno a la ConA?


3. Qu otros mitgenos existen y en qu casos se utilizan?
4. Qu otras tcnicas se utilizan para determinar proliferacin celular y cul es el
fundamento? Menciona por lo menos dos:
5. Menciona y describe brevemente un ejemplo en donde se requiera realizar un ensayo de
proliferacin celular:
6. Defina la diferencia entre ensayo in vivo e in vitro y proporciona un ejemplo de cada uno.
22

VIII. DISCUSIONES:

Discutir los resultados y la importancia de la determinacin de la proliferacin celular.

IX. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFIA:

Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to
proliferation and cytotoxicity assay. J. Inmunol. Methods. 1983; 65: 5563.

Jimnez M, Chvez NA and Salinas E. Pretreatment with glycomacropeptide reduces allergen-


sensitization, alleviates immediate cutaneous hypersensitivity and protects from anaphylaxis.
Clinical and Experimental Immunology 2012.
23

PRACTICA No. 6
VIAS DE INMUNIZACION, METODOS DE SANGRADO Y OBTENCIN DE ANTISUEROS EN
ANIMALES DEL LABORATORIO CONTRA ANTIGENOS SOLUBLES Y PARTICULADOS

I. OBJETIVO:
Al finalizar la prctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Describir el proceso de inmunizacin.


2. Conocer las diferentes vas de inmunizacin.
3. Describir los diferentes mtodos de sangrado en los animales de laboratorio.
4. Aplicar un esquema de Inmunizacin a diferentes conejos con sueros heterlogos
(humano, cerdo, bovino, pollo, caballo, etc.) segn el protocolo indicado.
5. Obtener antisueros especficos contra protenas solubles y contra antgenos particulados.

II. FUNDAMENTO DE INMUNIZACION:

El proceso de inmunizacin es aquel en el que se inyecta al animal el antgeno en


condiciones adecuadas de cantidad, sustancias acompaantes, y nmero de veces, que sean
necesarias para conseguir una buena respuesta inmune. En general se divide en dos fases:
inmunizacin primaria, en la cual se administra una determinada cantidad de antgeno en
presencia de adyuvante, e inmunizacin de recuerdo ('booster'), en la que el antgeno es
administrado en forma soluble o bien con adyuvante. Existen numerosos protocolos de
inmunizacin, con una duracin variable, aunque una fase de inmunizacin primaria suele
durar de 1 a 3 meses con inyecciones cada 15 das, y el proceso puede durar de 3 a 6 meses.

La cantidad de antgeno depender del animal a sensibilizar. Los ms comnmente


empleados son ratn, rata, conejo, cabra y gallina. Las cantidades oscilan entre los 50 a 1000
microgramos de antgeno para una dosis en ratn a los 0,25 a 5 mg por dosis en el caso de la
cabra o los 15 mg en el caso de caballo. La distancia filogentica entre especies es otro factor
a tener en cuenta en la eleccin de la especie. La utilizacin de la gallina como especie para
obtencin de anticuerpos tiene dos ventajas: la distancia filogentica existente con los
mamferos, y el hecho de que los anticuerpos pueden purificarse de la clara del huevo,
facilitando en gran manera su obtencin.

Generalidades:

Para poder desarrollar una respuesta inmunolgica frente a cualquier microorganismo o


sustancias de inters, esta debe ser inmunognica. Es necesario recalcar que la
inmunogenicidad de una molcula, definida como su capacidad de inducir una respuesta
inmune especfica, no es una propiedad intrnseca, ya que depende del sistema inmune al que
se enfrente. La respuesta inmune hacia un inmungeno, se encuentra bajo un complejo control
gentico y fisiolgico, que implica variaciones no solo entre las especies, sino an entre los
individuos de una misma especie. Cuando se comparan distintos esquemas de inmunizacin
en individuos alognicos, esto es, genticamente heterogneos (por ejemplo conejos, carneros,
caballos, etc.), es imposible determinar si las diferencias observadas en la respuesta son
24

atribuibles al esquema utilizado, o a las diferencias genticas entre los individuos, a menos de
que se utilice un nmero considerablemente grande de ellos.

Las protenas altamente inmunognicas se dicen que son mayores a 100 kDa. Entre
ellos se encuentran las protenas, cidos nucleicos, carbohidratos. La capacidad de
inmunogenicidad de un antgeno depende del tamao, complejidad, tipo de compuestos (los
mejores inmungenos son las protenas, ya que se requiere el procesamiento y presentacin
del antgeno a los linfocitos T), solubilidad y dosis.

En muchos casos es necesario emplear compuestos que permitan incrementar la


inmunogenicidad, a estos se les llama adyuvantes. Los adyuvantes son substancias que
cuando se inyectan junto con el antgeno permiten aumentar el nivel de anticuerpos
circulantes aunque tambin pueden inducir o elevar el grado de respuesta celular. Su funcin
es retardar la liberacin del antgeno y favorecer su captacin por los macrfagos, ayudando de
esta forma a presentar el antgeno a los linfocitos T. Son ejemplos de adyuvantes las
emulsiones de aceites (adyuvante incompleto y completo de Freud, que es una emulsin de
aceite y agua, y con micobacterias muertas en el caso del completo), hidrxido de aluminio,
bacterias inactivadas: Bordetella pertussis.

La respuesta al inmungeno va a depender de la dosis, forma y va de administracin:

1. Dosis: dosis pequeas o excesivas son tolerantes.


2. Forma: en partculas o en forma desnaturalizado es ms inmunognico
3. Vas: subcutnea produce una fuerte respuesta; directamente a la sangre da poca
respuesta o tolerancia; gastrointestinal da gran respuesta local pero tolerancia sistmica
(importante para prevenir alergias a los antgenos de las comidas y previene a los antgenos
de penetrar en el organismo.

VI. VIAS DE INMUNIZACION:

Para la inmunizacin de animales de laboratorio se pueden emplear las siguientes vas:


oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intracardiaca, subcutnea, intradrmica, intraperitoneal
entre otras.

La eleccin de la va depender, de la especie que se trate, de las caractersticas del


antgeno y del propsito de la inmunizacin. Sin constituirse en regla los antgenos
particulados resultan buenos inmungenos cuando se administran por va intravenosa en
conejos por ejemplo, mientras que para antgenos solubles la va usual es la intradrmica o
subcutnea siempre y cuando el antgeno se acompae de los llamados adyuvantes.

VII. METODOS DE SANGRADO EN ANIMALES DE LABORATORIO

SANGRADO: Para todos los antgenos, el sangrado se har antes y despus del
protocolo de inmunizacin, generalmente de 4 a 7 das despus de la inmunizacin, tratando
de extraer la mayor cantidad de sangre posible. El sangrado PREVIO es indispensable para
contar con el suero testigo.
25

La separacin del suero se hace despus de incubar la sangre coagulada a 37C


durante 30 a 60 min. Es conveniente remover el cogulo con un aplicador al principio de la
incubacin con objeto de facilitar la retraccin del mismo y la separacin del suero.

El suero se separa del cogulo mediante centrifugacin a 3000 rpm durante 20 minutos y
se transfiere con pipetas Pasteur a recipientes apropiados. Se puede conservar
indefinidamente si se mantiene estril o adicionado con merthiolate (concentracin final 0.01%)
o azida de sodio (0.1%).

La preparacin de un antisuero convencional, para la obtencin de anticuerpos


policlonales contra el (los) antgeno(s) de inters, comprende varias etapas o pasos generales.
La purificacin final de los anticuerpos obtenidos puede ser necesaria o no, dependiendo del
uso que va a tener el antisuero.

Cuadro 1: Pasos para la obtencin de un antisuero mediante inmunizacin.

1 2 3 4 5 6
Preparacin Inmunizacin Seguimiento Sangra final Evaluacin Purificacin
del y del de
inmungeno evaluacin antisuero los
de la anticuerpos
respuesta de inters
(sangras
de prueba)

II. FUNDAMENTO DE PREPARACION DE ANTISUEROS

Los trminos "antisuero" o "suero inmune" son utilizados comnmente para referirse
a un suero que contiene altas concentraciones de anticuerpos contra un antgeno dado,
obtenido generalmente mediante un proceso de inmunizacin. Los anticuerpos (Acs) pueden
ser considerados como herramientas biolgicas de gran utilidad para la deteccin y
caracterizacin de diversas molculas de inters diagnstico o de investigacin, gracias a su
especificidad, la cual es explotada de muchas maneras en las tcnicas inmunoqumicas. Por lo
anterior los antisueros se pueden utilizar para los siguientes fines:

1. Teraputicos (inmunizacin pasiva) en diversos estados infecciosos o txicos


(sarampin, ttanos, etc.).
2. En la identificacin de microorganismos aislados de infecciones y en la clasificacin
taxonmica de diversas especies.
3. Como herramientas de trabajo para explicar mecanismos inmunolgicos bsicos:
(especificidad inmunolgica, citotoxicidad, etc.) y
4. La determinacin rpida y especfica de la naturaleza de diversas substancias
qumicas (protenas, carbohidratos, etc.).
26

Generalidades:
Los anticuerpos reciben su nombre porque son producidas por el sistema inmune
contra (anti) partculas o sustancias extraas (bodies), colectivamente llamados antgenos y
son tambin llamados inmunoglobulinas porque son globulinas producidas especficamente en
una respuesta inmune contra los antgenos. Los antgenos pueden ser solubles o particulados,
dependiendo de su tamao. La introduccin de antgenos al cuerpo genera la produccin de
anticuerpos por las clulas plasmticas diferenciadas de un linfocito B que ha sido estimulado
por dicho antgeno.

Los anticuerpos pueden ser producidos en una variedad de animales, pero la


habilidad para producir anticuerpos contra antgenos especficos vara con las diferentes
especies, clases dentro de las especies, y an en los individuos dentro de una misma especie.
Por consiguiente para trabajo experimental, es necesario emplear un gran nmero de animales
para la prctica. La seleccin de los animales, con frecuencia depende de los requerimientos
individuales de los experimentos y de las facilidades del laboratorio. Animales pequeos,
principalmente conejos, se usan comnmente para estudios sobre la formacin de anticuerpos.
Para la produccin de anticuerpos a gran escala o escala comercial, se hace con frecuencia
usando animales ms grandes como caballos, cabras, borregos, bovinos.

Los materiales antignicos difieren en gran manera en su habilidad para estimular la


produccin de anticuerpos. En general, las clulas y protenas de alto peso molecular como
glbulos rojos de carnero y las globulinas del suero son muy inmunognicas, mientras que
protenas de bajo peso molecular son menos inmunognicas y requieren de ya sea esquemas
prolongados de inyecciones o modificacin con adyuvantes.

Las propiedades inmunolgicas de los antisueros reflejan la heterogeneidad de los


anticuerpos que ellos contienen. La heterogeneidad depende en parte de la naturaleza del
antgeno usado, la ruta de inyeccin y del nmero de inyecciones.

ANTIGENOS SOLUBLES:

Suero Humano Normal.


Muchas protenas nativas solubles derivadas de fuente animal o vegetal, son
inmunognicas, aunque ellas varan en su capacidad para estimular la produccin de
anticuerpos. En conejos por ejemplo, la ovoalbmina, hemocianina y gamma globulina son ms
inmunognicas que la albmina srica bovina (BSA).

Los antisueros contra protenas nativas solubles pueden prepararse mediante


inyecciones intravenosas repetidas de la protena disuelta en solucin salina o por inyeccin
subcutnea de una emulsin del antgeno proteico y el adyuvante.

Para la induccin de anticuerpos en conejo contra suero normal, se utilizar como


antgeno, una muestra de suero humano calentado a 63C durante 20 minutos con objeto de
lograr un cierto grado de agregacin de los componentes del mismo. Los animales se
inocularn con este componente antignico de acuerdo al siguiente protocolo de inmunizacin:
27

ANTIGENOS PARTICULADOS:

a. Glbulos Rojos de Carnero

Los determinantes antignicos de los eritrocitos de carnero que dan lugar a anticuerpos
hemolticos estn presentes en el estroma de la clula. Estos determinantes se dividen en dos
tipos en base a su estabilidad al calor a 103 C. Los termoestables al calor llamados antgenos
heterfilos (antgeno de Forssman) y los termolbiles al calor llamados antgenos isfilos. Los
ltimos pueden ser eliminados preparando los estromas de los eritrocitos y calentndolos a 103
C. El mtodo que emplearemos involucra el uso de clulas rojas no tratadas. En este caso
despus de las inyecciones en los conejos, los anticuerpos contra antgenos isfilos aparecen
algunas semanas ms tarde que aquellos dirigidos contra determinantes heterfilos.

III. REACTIVOS

1. Antgeno inmunizante:
a. un pool de suero humano calentado a 63 C/20 min (6 ml).
b.Suspensin de eritrocitos de carnero al 10 % en solucin salina fisiolgica.
3. Alcohol al 70%
4. Xilol

IV. MATERIAL Y EQUIPO

1. Conejos adultos sanos de 2.5 Kg o ms pesados


2. Jeringas con agujas estriles 21x27 in, in
3. Torundas de algodn
4. Tubos de centrfuga estriles 13x100 con tapn
5. Cajn especial para sujetar conejos
6. Centrfuga clnica
7. Viales de vidrio con tapn
8. Pipetas Pasteur y bulbo

IV. METODOLOGIA:
a. PROCEDIMIENTO PARA INMUNIZAR CON SUERO HUMANO:

1. Inyecte por va endovenosa a un conejo, la cantidad de suero humano de acuerdo al


protocolo de inmunizaciones por un total de cuatro inyecciones.

PROTOCOLO DE INMUNIZACION PARA SUERO HUMANO TOTAL

Inyeccin Tiempo (da) Fecha Dosis (ml) Va Observaciones


1 0 0.5 i.v
2 3 1.0 i.v
3 6 1.5 i.v
4 9 2.0 i.v
Sangrado 14
28

2. Deje descansar al animal durante una semana (mnimo 5 das)


3. Se sangra al conejo de la oreja o por puncin cardiaca (15-20 ml) y separe el suero.
4. Titule el suero mediante una reaccin de PRECIPITACION CUALITATIVA. (ver la prctica
de precipitacin en tubo capilar y de Inmunodifusin doble)

b. PROCEDIMIENTO PARA INMUNIZAR AL CONEJO CON ERITROCITOS DE CARNERO

Inyecte por va intraperitoneal a un conejo, la cantidad de 1 ml por kilogramo de peso de una


suspensin de eritrocitos de carnero al 10% de acuerdo al protocolo de inmunizaciones que es
una sola dosis.

1. Deje descansar al animal durante una semana (mnimo 5 das).


2. Sangre al conejo de la oreja o por puncin cardiaca (15-20 ml) y separe el suero.
3. Titule el suero mediante una reaccin de hemaglutinacin en microplacas y por hemlisis
inmune.

V. RESULTADOS:

Reporte el volumen obtenido de suero y en qu condiciones. .

VI. CUESTIONARIO

1. Explica que se entiende por inmunizacin.


2. Los antisueros que se producen en los animales de experimentacin para que se
utilizan?
3. Cules son las principales vas de inmunizacin que se emplean en el laboratorio?
4. Qu se entiende por adyuvante?
5. Menciona 3 adyuvantes y describe su mecanismo de accin
6. Qu se entiende por respuesta inmune
7. Cuntos tipos de respuesta inmune hay y cuales son
8. Mediante un esquema de flujo indica todos los pasos que se siguieron para la obtencin
de antisueros especficos, fundamentando cada uno de ellos.
9. Define los siguientes trminos: antgeno, inmungeno, anticuerpo, antisuero, respuesta
inmune primaria, respuesta inmune secundaria.
10. Define las reacciones de precipitacin, aglutinacin y de hemlisis.

VII. DISCUSION

Discutir sobre la importancia de la obtencin de antisueros y puede incluir un punto


aparte de observaciones en el cual se refiere a observaciones durante el desarrollo de la
prctica, tales como fuentes de error, precauciones, comentarios, aclaraciones a la tcnica.

VIII. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.
29

IX. BIBLIOGRAFIA:

1. Arce Mendoza A.Y., Rosas Taraco A.G., Rodrguez Tovar L. E.; Prticas de Inmunologa
general aplicada y Veterinria.
2. Campbell Dan H., Garvey Justine S., Cremer Natalie E., Sussdorf Dieter H. Methods in
Immunolofy. A Laboratory Tex for Instruction and Research. Second Edition. 1980.
3. Lomonte, B. (2007) Manual de Mtodos Inmunolgicos, 138 pp. Universidad de Costa
Rica. 4 Edicin Acceso libre en: http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/
30

PRACTICA No. 7
PREPARACIN DE PRODUCTOS BIOLGICOS

I. OBJETIVO:

Al finalizar la prctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Elaborar una vacuna antibacteriana que cumpla con las caractersticas de seguridad e
inmunogenicidad requeridas para su empleo en la obtencin de un antisuero especfico.
1. Realizar la tcnica de aglutinacin en tubo empleando el antisuero producido por ellos
mismos.
2. Diferenciar entre la aglutinacin de los antgenos flagelares y de los antgenos somticos.
3. Obtener el ttulo de los anticuerpos contra antgenos flagelares (anti-H) y contra antgenos
somticos (anti-O).

II. FUNDAMENTO

La vacuna es un preparado de antgenos procedentes de microorganismos patgenos


(microbios muertos de cepas virulentas o vivos de cepas atenuadas), cuya finalidad es la
creacin de anticuerpos que reconozcan y ataquen a la infeccin y, por lo tanto, produzcan la
inmunidad del organismo inoculado.

La vacuna suele consistir de dosis muy pequeas del propio agente (forma inactiva o
atenuada) que origina la enfermedad, por lo que provoca la creacin de anticuerpos que
permanecen en el organismo y lo protegen en el caso de futuros contagios. La tcnica de
administracin depende del tipo de vacuna; la ms comn es la inoculacin, pero en algunos
casos es la ingestin o el spray nasal.

Tipos de vacunas
Segn su composicin y forma de obtencin se clasifican en vricas y bacterianas, que
a su vez pueden ser vivas atenuadas o muertas inactivadas.

1. Vacunas vivas atenuadas:


Se componen de microorganismos mutados que han perdido su virulencia,
generalmente mediante pases sucesivos en diferentes medios de cultivo y/o huspedes
animales, sin sufrir un deterioro importante en sus inmunogenicidades.

2. Muertas o inactivadas
Se obtienen mediante:
a. Inactivacin por medios fsicos (calor) o qumicos (formol, b-propiolactona) de bacterias o
virus, enteros o totales.
b. Inactivacin por calor y formaldehdo de antgenos secretados (toxoides o anatoxinas):
ttanos, difteria.
c. Obtencin de fracciones inmunizantes virales o bacterianas.

3. Vacunas toxoides
Los toxoides se obtienen a partir de las toxinas bacterianas producidas por Clostridium
tetani y del bacilo diftrico, Corynebacterium diphtheriae, causantes del ttanos y de la difteria,
respectivamente.
31

GENERALIDADES

Las dos grandes propiedades que deben reunir las vacunas son la eficacia y la
inocuidad. La eficacia depende de que la vacuna contenga los antgenos responsables del
poder inmungeno, que son aquellos que inducen una buena respuesta inmune. Las bacterias
y los virus estn compuestos por numerosos antgenos, que pueden ser constitutivos o
estructurales, contenidos en determinadas estructuras de la bacteria (flagelos, fimbrias,
capsula, pared celular, membrana citoplsmica, ribosomas) o secretados, de los cuales solo
algunos pueden considerarse antgenos protectores o inmunizantes. La inocuidad supone que
la vacuna esta desprovista de poder patgeno, y debe lograrse este objetivo sin que se
modifiquen los antgenos responsables del poder inmungeno.
ANTISUEROS
El Antisuero es un producto biolgico utilizado en el tratamiento de picaduras o
mordeduras venenosas. El antisuero se crea mediante la inyeccin de una pequea cantidad
de veneno blanco en un animal, como un caballo, oveja, cabra, conejo, etc.; el animal sufrir
una respuesta inmune para el veneno, produciendo anticuerpos contra el veneno de la
molcula activa. Pueden ser cosechadas a partir de la sangre del animal y se usa para tratar
envenenamientos en otros.
El Antisuero puede clasificarse en monovalente (cuando son eficaces en contra de una
determinada especie de veneno) o polivalente (cuando son efectivos contra una amplia gama
de especies, o varias especies diferentes al mismo tiempo). La mayora de antisueros
(incluyendo todos los antisueros serpiente) es administrada intravenosamente. El antisuero ata
y neutraliza el veneno, deteniendo un mayor dao, pero no invierte el dao ya hecho. Por lo
tanto, debe administrarse tan pronto como sea posible despus de que el veneno ha sido
inyectado, pero que son de algn beneficio, siempre y cuando el veneno est presente en el
cuerpo. (Ver tambin prctica de produccin de antisueros)
Disponibilidad de antisueros
Los antisueros se han desarrollado para venenos asociados a los siguientes animales:
araas, caros, insectos, escorpiones, animales marinos y serpientes.

III. REACTIVOS

1. Cepa de Salmonella sp.


2. 100 ml de solucin salina isotnica formolada al 1% estril.
3. 100 ml de solucin salina isotnica formolada al 0.5% estril.
4. Solucin salina fisiolgica
5. 1 tubo con caldo soya tripticasa
6. 3 tubos con agar Muller-Hinton inclinados
7. 3 tubos con caldo tioglicolato
8. 3 tubos con caldo soya tripticasa
9. 3 tubos con agar Saboraund inclinados
10. 1 matraz Erlenmayer de 500 ml conteniendo 150 ml de caldo soya tripticasa.
11. Juego de colorantes para Gram.
12. Patrn de Mc. Farland

IV. MATERIAL Y EQUIPO:

OBTENCION DE ANTIGENO FLAGELAR (H) DE Salmonella sp.


32

1. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm


2. 1 matraz erlenmeyer de 1000 ml.
3. 5tubos para centrifuga de 250 ml estriles.
4. 2 pipetas de 1 ml divididas 1/10, estriles.
5. 2 pipetas de 10 ml divididas 1/10, estriles.
6. 1 bulbo de hule.
7. 2 tapones de hule del no. 6 estriles.
8. Asa con porta asas.
9. Porta objetos.
10. Incubadora a 37 C.
11. Incubadora a 32 - 35 C.
12. Bao de agua hirviente.
13. Mechero.
14. Centrfuga clnica para tubos con rosca
15. Charola de peltre para desechar material contaminados.
16. Microscopio.
17. Frasco de boca ancha de vidrio corriente.
18. Bao mara a 100C

IV. METODOLOGA:

NOTA: PARA LA REALIZACIN DE LOS PRODUCTOS BIOLGICOS, ES NECESARIO


TRABAJAR CON LAS MAYORES CONDICIONES DE ESTERILIDAD EN TODO MOMENTO.

OBTENCION DE ANTIGENO FLAGELAR (H) DE Salmonella sp.

1. Sembrar el tubo de caldo soya tripticasa tomando con el asa de platino un inoculo
abundante de la cepa de Salmonella sp. E incubar 18 horas a 37 C.

2. Tomar de 4 a 5 ml del cultivo y pasarlos al matraz con 150 ml de Infusion Soya tripticasa,
colocar la pipeta contaminada en la charola de peltre para su posterior esterilizacin.

3. Incubar el matraz de 18 a 24 horas a 37 C.

4. Con el asa de platino colocar una gota de solucin salina isotnica estril sobre un
portaobjetos, flamear el asa y tomar una muestra del desarrollo de la bacteria, mezclar con
la solucin salina, secar, fijar a la flama y teir el frotis con GRAM.

NOTA: DEBERN OBSERVAR NICAMENTE BACILOS GRAM NEGATIVOS SI EXISTE


ALGN TIPO DE CONTAMINANTE DESECHAR EL CULTIVO Y COMENZAR NUEVAMENTE.

5. Si la prueba de pureza es satisfactoria proceder a la cosecha del desarrollo bacteriano. Con


una pipeta de 10 ml adicionar al cultivo 10 ml se solucin salina isotnica formolada 1.0%
estril y dejar a temperatura ambiente durante varios das.

6. Para el cuarto o quinto da probar si ya se destruy la viabilidad de los microorganismos,


tomar una muestra de la suspensin perfectamente agitada y sembrarlos en los tubos de
agar Muller-Hilton, agar Saboraund, caldo tioglicolato y caldo soya tripticasa, por estriado y
picadura en el agar y por agitacin en los caldos e incubarlo a 37 C durante 24 a 48 horas.

7. Si se obtiene desarrollo bacteriano, adicionar 10 ml ms de salina isotnica formolada 1.0%


estril y dejar transcurrir 3 a 4 das ms y repetir la prueba de viabilidad, dicha prueba es
satisfactoria cuando ya no se obtiene desarrollo bacteriano.

8. Para obtener el desarrollo bacteriano se deja reposar la mezcla de un da para otro,


evitando todo movimiento y en condiciones de esterilidad; posteriormente, se decanta la
mayor cantidad posible del sobrenadante.
33

9. Este sobrenadante se desecha y el sedimento se lleva a tubos con rosca para centrifuga .
Procurar utilizar los menos tubos posibles.

10. Centrifugar la suspensin durante 30 min a 3000 rpm, desechar el sobrenadante y


resuspender el desarrollo bacteriano en 1 a 2 ml de solucin salina isotnica formolada al
0.5% estril.

11. En por lo menos 3 tubos con tapn de hule estriles, colocar 9 ml de solucin salina
formolada al 0.5% esteril y adicionarles gota a gota de la suspensin bacteriana hasta
alcanzar una concentracin de 1.5X109 UFC/ml (tubo nmero 5 de la escala de McFarland).

12. Para probar la esterilidad de la suspensin sembrar una muestra de la suspensin en cada
uno de los tubos de control de viabilidad como se explica en el paso nmero 6.

13. Si al cabo de este lapso no se observa ningn desarrollo en los tubos la suspensin ya
puede utilizarse para la inmunizacin de los conejos. Esta suspensin deber conservarse
en refrigeracin entre 4 y 6 C hasta el momento de emplearse.

NOTA: TODO EL MATERIAL UTILIZADO EN ESTA PRCTICA HASTA EL PASO


NUMERO 10 DEBER ESTERILIZARSE ANTES DE LAVARLO YA QUE CONTIENE
GERMENES ALTAMENTE PATOGENOS.

OBTENCION DE ANTIGENO SOMTICO (O) DE Salmonella sp.

1. Sembrar Salmonella en una caja con agar Muller Hinton a 37C por 18 hrs, con estra
cerrada y cruzada, para obtener la mayor cantidad de crecimiento posible.

2. Pasado este tiempo, realizar una tincin de Gram para confirmar que solo se tengan
bacilos gram negativos. Si se encontraran gram positivos, se descarta el inculo y se
repite.

3. Ante la presencia, solo de gram negativos, se recolecta la mayor cantidad posible de


cultivo y se lava dos veces con solucin salina fisiolgica a 2500 rpm por 5 min.

4. El sedimento se resuspende nuevamente en solucin salina fisiolgica, y se lleva a bao


mara a 100C por 2 hrs y media en tubos con tapn de hule esteriles.

5. Posteriormente, se centrifuga a 3000 rpm durante 30 minutos.

6. El sedimento se resuspende en 9 ml de solucin salina fisiolgica y se interpola en la


escala de McFarland,

7. En un tubo con 9 ml de solucin salina fisiolgica estril se adicionan gota a gota de la


solucin anterior (solucin bacteriana) hasta llegar al tubo no. 5 de la escala de McFarland
(1.5X109 UFC/ml) en condiciones de esterilidad.

8. Realizar las pruebas de pureza en medios de cultivo, tal y como se explica en el paso no.
6 de la obtencin de antgeno flagelar.
34

a. Antgenos "O" y "H" de Salmonella typhi

La inyeccin de suspensiones bacterianas "O" tratadas con calor inducirn la formacin


de anticuerpos solamente contra los antgenos somticos termoestables, mientras que la
inyeccin de suspensiones bacterianas "H" tratadas con formalina producirn anticuerpos
dirigidos hacia ambos antgenos: los somticos "O" y los flagelares "H".

PROCEDIMIENTO PARA INMUNIZAR CON ANTIGENO O Y H:

1. Inyecte por va endovenosa el volumen indicado de una suspensin de antgeno "O" y "H"
de Salmonella typhi de acuerdo al protocolo de inmunizacin que se indica a continuacin,
con un total de cuatro inyecciones:

PROTOCOLO DE INMUNIZACION PARA ANTIGENO


"O" Y "H" DE Salmonella typhi
Inyeccin Tiempo (da) Fecha Dosis (ml) Va Observaciones
1 0 0.5 i.v
2 3 1.0 i.v
3 5 2.0 i.v
4 11 3.0 i.v
Sangrado 17

2. Deje descansar el animal seis das despus de la ltima inyeccin.

3. Sangre al conejo por puncin endovenosa o cardiaca y separar el suero.

VI. RESULTADOS:

Incluir resultado obtenido, en cada una de las etapas de la produccin de la vacuna,

DISCUSIONES:

Observaciones durante el desarrollo de la prctica, tales como fuentes de error,


precauciones, comentarios, aclaraciones a la tcnica, etc. No repetir la descripcin de los
pasos de la tcnica. Discutir que indica el ttulo de anticuerpos obtenidos por esta tcnica
y cuales son los factores que influyen en la reaccin de aglutinacin.

VII. CUESTIONARIO:

1. Explique la diferencia entre una vacuna y un antisuero


2. Porque es importante la vacunacin
3. Cuntos tipos de vacunas existen?
4. Cules son las principales enfermedades animales erradicadas gracias a la vacunacin
5. Menciona 2 ejemplos de vacunas virales y 2 bacterianas de vacunas vivas atenuadas.
6. Menciona 2 ejemplos de vacunas virales y 2 bacterianas de vacunas muertas o
inactivadas.
35

VIII. CONCLUSIONES: Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los
resultados obtenidos.

IX. BIBLIOGRAFA
1. Abbas, Abul K..: Inmunologa celular y molecular /Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman y
Jordan S. Pober. Madrid, Espaa: McGraw-Hill Interamericana, 1999.
2. Arce Mendoza A.Y., Rosas Taraco A.G., Rodrguez Tovar L. E.; Prcticas de
Inmunologa general aplicada y Veterinaria.
3. Lomonte, B. (2009) Tcnicas de Laboratorio en Inmunologa Clnica, 122 pp.
Universidad de Costa Rica. Acceso libre en: http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/
4. Campbell Dan H., Garvey Justine S., Cremer Natalie E., Sussdorf Dieter H. Methods in
Immunolofy. A Laboratory Tex for Instruction and Research. Second Edition. 1980.
36

PRCTICA NO. 8
REACCIONES DE PRECIPITACION
I. OBJETIVO:

Al finalizar las siguientes prcticas el alumno ser capaz de:

1. Llevar a cabo de manera correcta los procedimientos que implican las reacciones de
precipitacin, identificar sus caractersticas, diferenciar el fundamento de cada una de las
determinaciones realizadas e interpretar su resultado.

II. FUNDAMENTO:

Al mezclar cantidades suficientes de antgeno (Ag) soluble con anticuerpos (Acs)


especficos, la interaccin Ag-Ac puede dar lugar a una reaccin visible llamada precipitacin.
Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados
por la interaccin Ag-Ac. Para que este tipo de reaccin se produzca, tanto el Ag como el Ac
han de ser al menos bivalentes, es decir, que mientras que el Ag debe poseer varios
determinantes antignicos (4, 6, 5), basta con, que el Ac tenga, al menos, 2 sitios de
combinacin con el Ag.

La reaccin de precipitacin depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac


da idea del nmero de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera, un Ac bivalente
posee dos sitios capaces de reconocer al Ag. Del mismo modo, la valencia de un Ag nos habla
del mximo nmero de eptopes que posee.

La asociacin entre Ac bivalentes y Ag monovalentes (un nico eptope no repetido) no


permite la formacin de CI precipitantes. La asociacin entre Ac bivalentes y Ag multivalentes
permite la formacin de CI precipitantes. El Ag multivalente puede presentar un slo eptope
repetido o varios eptopes distintos.

Para la realizacin de estas tcnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren


en un medio fluido en el que sea posible la precipitacin del complejo Ag-Ac. Existen diferentes
modalidades siendo las principales:

1. Tcnica de precipitacin propiamente dicha.


2. Tcnica de difusin radial simple de Mancini
3. Tcnica de difusin doble o de Ouchterlony.
4. Tcnica de inmunoelectroforesis
37

PRACTICA No. 8a
REACCIONES DE PRECIPITACION EN TUBO CAPILAR

I. OBJETIVO:

1. Al finalizar la prctica, el alumno a de ser capaz de:

II. FUNDAMENTO:

Cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad fija de suero


conteniendo Acs especficos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la cantidad
de precipitado se incrementa hasta alcanzar un mximo, luego del cual declina. En un extremo
de la curva de precipitacin, cuando se agregan pequeas cantidades de Ag, los CI se forman
en exceso de Ac (prozona). En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI
se forman en exceso de Ag (postzona) siendo pequeos y probablemente constituidos por
una molcula de Ac y dos de Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona
de equivalencia, en donde la relacin Ag-Ac permite la formacin de grandes redes de CI que
precipitan (figura 1).

Tomada de: B. Manzanares, R. Gonzlez, R. Tarazona y J. Pea Mtodos en Inmunologa

III. REACTIVOS
1. 5 ml de solucin salina isotnica
2. 1 ml de suero humano (o de otra especie)
3. 1 ml de antisuero antihumano

IV. MATERIAL POR EQUIPO:

1. 1 gradilla con plastilina


2. 11 Tubos capilares
3. 8 tubos de ensaye de 13x100
4. 3 pipetas de 1 ml divididas en dcimas.
5. Pedazo de gasa

V. METODOLOGIA
38

1. Se toman los 11 capilares y con un marcador, se dividen en dos partes iguales.

2. En 8 tubos de ensaye de 13x100 debidamente rotulados, se hacen diluciones al doble del


suero humano (antgeno)

a) Se colocan 0.5 ml de solucin salina en cada uno de los tubos de ensaye


b) Al tubo 1 se agregan 0.5 ml del suero humano. Se mezclan bien con la misma
pipeta. (Dilucin. 1:2).
c) Con una pipeta diferente se toman 0.5 ml. del tubo 1 y se pasan al tubo 2. Se
mezclan bien con la misma pipeta. (Dilucin 1:4).
d) El procedimiento se repite para los tubos siguientes (diluciones 1:8 a 1:256).

3. Se toma un tubo capilar y se absorbe por capilaridad un volumen tal de antisuero que
llegue hasta la primera de las marcas del tubo. La parte externa del tubo se limpia con la
gasa.

4. Se absorbe en forma similar a la descrita en el inciso 3 un volumen tal de antgeno sin


diluir (dilucin 1:1), que llegue hasta la segunda marca del tubo. Se limpia la parte
externa con la gasa.

5. Se mezcla inclinando levemente de un lado al otro.

6. Con el dedo ndice se tapa uno de los extremos del capilar y se deja que el contenido
quede entre las marcas intermedias.

7. El capilar se introduce en una gradilla de plastilina.

8. Se repite el procedimiento sealado en los incisos 3 al 7 para cada una de las diluciones
del antgeno (de 1:2 a 1:256).

9. Un capilar se llena hasta la segunda marca con antgeno sin diluir y otro, en la misma
forma, nicamente con suero. El primero es el testigo del antgeno y el segundo es el de
antisuero.

10. Se deja unos minutos a temperatura ambiente y se guarda en refrigeracin 24 a 48 horas.

11. Se mide la cantidad de precipitado en milmetros.

VI. RESULTADOS

Observe cuidadosamente los tubos capilares y reporte los resultados.

VII. CUESTIONARIO

1. Cul es la proporcin de molculas Ag y Ac en los fenmenos de prozona, zona


equivalente y postzona
2. Qu es lo que ocurre en cada una de las zonas descritas anteriormente
3. Cul es la sensibilidad de esta tcnica
4. Cmo puede realizarse las reacciones de precipitacin
5. Menciona las aplicaciones de esta tcnica en la biotecnologa.

VIII. DISCUSION

Discutir sobre la importancia la reaccin de precipitacin en tubo capilar y de cmo esta


reaccin depende de la proporcin relativa de antgeno y anticuerpo presente.
39

IX. CONCLUSIONES:
Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFIA:

1. Arce Mendoza A.Y., Rosas Taraco A.G., Rodrguez Tovar L. E.; Prcticas de inmunologa
general aplicada y Veterinria.
2. Lomonte, B. (2009) Tcnicas de Laboratorio en Inmunologa Clnica, 122 pp. Universidad
de Costa Rica. Acceso libre en: http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/
3. Christine Dorresteyn Stevens, EdD, MT; Clinical Immunology and Serology. A Laboratory
perspective, F.A. Davis Company. 1996.
40

PRACTICA No. 8b
INMUNODIFUSION DOBLE (METODO DE OUCHTERLONY)
I. OBJETIVO
Al finalizar la prctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Realizar la tcnica de precipitacin en medios slidos (inmunodifusin).


2. Identificar dnde y cmo se visualizan las lneas de precipitacin.
3. Identificar las reacciones de Identidad total, Identidad parcial y No Identidad.

II. FUNDAMENTO:

La inmunodifusin doble de Ouchterlony es un mtodo inmunolgico sencillo y


rutinariamente usado en el laboratorio clnico para la deteccin de antgenos o anticuerpos en
una muestra biolgica. Es considerado el proceso estndar para la deteccin de Antgenos
Nucleares Extrables (ENA).

Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se realizan pocillos a distancia


conveniente y en dichas perforaciones se colocan pequeas cantidades de Ag y Ac (Figura 2).
En este caso los reactivos difunden en forma radial a partir de cada pocillo y cuando ambos
sistemas se encuentren, se formar en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspon-
diente que se hace visible en forma de una lnea de precipitacin. En una preparacin que
contenga varios antgenos, se obtendrn mltiples lneas de precipitado. La tcnica de
Ouchterlony permite identificar sustancias de acuerdo a la forma de unin de las lneas de
precipitacin de dos o varios sistemas, generando bandas de precipitacin cuyas
caractersticas dependern de varios factores.

Si la concentracin es la que corresponde a la zona de equivalencia la banda de


precipitacin estar situada aproximadamente en la distancia media que separa los reservorios
o pocillos. Cuando hay exceso de antgeno o anticuerpo, la banda estar ms prxima al
pocillo del anticuerpo o del antgeno, respectivamente.

Este sistema permite identificar las bandas de precipitacin mediante el empleo


simultneo de antgenos y anticuerpos conocidos.

Se pueden observar tres tipos de reacciones (Fig. 2):

a. Reaccin de identidad: los dos sistemas difunden en una nica banda de precipitacin.

b. Reaccin de no identidad: cada sistema reacciona independientemente, originando


bandas de precipitacin que se cruzan.

c. Reaccin de identidad parcial: se produce cuando uno de los antgenos tiene menos de
un componente y es capaz de dar una reaccin cruzada con un anticuerpo elaborado
contra un antgeno ms simple. En este caso las bandas de ambos sistemas se unen y
funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongacin o espoln. Esto indica
que en este antgeno hay componentes antignicos no compartidos.
41

FIGURA No. 2

Por medio de la Inmunodifusin Doble de Ouchterlony se pueden realizar anlisis


cualitativos y cuantitativos de antgenos y anticuerpos en una solucin, mediante una
precipitacin en gel de agarosa.

III. REACTIVOS

1. Soluciones de antgenos: Sueros de especies diferentes: humano, cerdo, codorniz, bovino,


etc.
2. ANTISUEROS obtenidos por la inmunizacin con su Ag homlogo, producidos por ellos
mismos
IV. MATERIAL POR EQUIPO:

1. Portaobjetos con agarosa al 1.5% en


SSF con azida de sodio al 1%
2. Plantilla para hacer los orificios en el
gel
3. Cortador de gel
4. Cmara hmeda
5. 6 pipetas Pasteur con bulbo o
capilares
42

V. METODOLOGIA:

1. Con ayuda de un molde apropiado, se practican perforaciones al gel y el agar residual se


remueve con un aplicador. La distribucin de las perforaciones es la siguiente:

2. Los pozos as formados se llenan con el antisuero en el centro y los antgenos alrededor
o viceversa, segn sea el caso.

3. Se improvisa una cmara hmeda, usando una caja de petri cuya tapa se recubre con un
disco de papel filtro hmedo.

4. Se colocan los porta-objetos en el interior de la cmara sobre aplicadores de madera.

5. Se incuban a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas y se buscan bandas de


precipitacin.

V. RESULTADOS

Se dibuja el esquema de perforaciones utilizado, indicando que solucin fue colocada


en cada perforacin, as como las bandas de precipitacin que hayan aparecido.

VI. CUESTIONARIO:

1. Cmo influyen las concentraciones de Ag y Ab en la formacin del enrejado entre los


complejos inmunes y, por lo tanto su precipitacin
2. Qu otros factores influyen en la reaccin de precipitacin
3. Qu se sita en el pocillo central
4. A qu concentracin se prepara la agarosa

5. Qu nos indican el nmero de lneas de precipitacin que se pueden observar en la


prueba
6. Cules son las principales aplicaciones de la tcnica

VII. DISCUSION

Discutir sobre la importancia de la tcnica de Inmunodifusin de Ouchterlony como una


tcnica inmunoqumica clsica ms antigua, pero no por ello menos importante. Y porqu
esta tcnica es la mas frecuentemente usada para comparar antgenos complejos usando un
slo antisuero.

VIII. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

IX. BIBLIOGRAFIA:

1. Arce Mendoza A.Y., Rosas Taraco A.G., Rodrguez Tovar L. E.; Prcticas de inmunologa
general aplicada y Veterinaria.
43

2. Lomonte, B. (2009) Tcnicas de Laboratorio en Inmunologa Clnica, 122 pp. Universidad de


Costa Rica. Acceso libre en: http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/
3. Christine Dorresteyn Stevens, EdD, MT; Clinical Immunology and Serology. A Laboratory
perspective, F.A. Davis Company. 1996
44

PRACTICA No.8c
INMUNODIFUSION RADIAL O TCNICA DE MANCINI

I. OBJETIVO:

Al finalizar la prctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Realizar la tcnica de inmunodifusin radial


2. Elaborar una curva estndar o de calibracin usando concentraciones conocidas del
antgeno
3. Determinar la concentracin de un problema mediante la interpolacin con la curva
estndar

II. FUNDAMENTO:

La inmunodifusin radial (RID) es una tcnica usada rutinariamente para medir la


concentracin de diferentes protenas solubles en fluidos biolgicos. La inmunodifusin se
utiliza para el anlisis cuantitativo y cualitativo de protenas en suero u otros lquidos
corporales.

El mtodo se basa en la difusin de protenas (antgenos) de forma radial desde un


pocillo atravesando un gel de agarosa que contiene anticuerpos especficos para la protena
que deseamos cuantificar. Los complejos antgeno-anticuerpo que se han formado, bajo las
condiciones correctas, precipitarn en forma de anillo. La lectura del ensayo se basa en estos
complejos antgeno-anticuerpo insolubles que acaban precipitando. Aunque la formacin de
estos complejos en medio semislido, como la agarosa, depende de electrlitos, pH y
temperatura, los factores ms determinantes en su formacin son las concentraciones relativas
de antgeno y anticuerpo.

Una vez finalizada la difusin se mide el radio (R) de los precipitados que es proporcional
a la concentracin de antgeno (C). La concentracin de protena en la muestra biolgica (Cx)
se calcula realizando una curva de calibracin utilizando muestras patrones de concentracin
conocida.

La determinacin de Igs sricas por inmunodifusin radial se puede efectuar de dos


maneras. La primera, llamada de difusin completa, permite la difusin mxima de la
muestra, en un tiempo de 48-72 hr, y da como resultado una lnea recta al graficar el cuadrado
del dimetro del anillo vs la concentracin de Ig. La segunda, denominada de difusin parcial,
utiliza un tiempo de difusin limitado (18 hr) y da como resultado una recta cuando se grafica el
dimetro del anillo vs el logaritmo de la concentracin de Ig. a pesar de que esta variante es
ms rpida, su precisin es menor, en comparacin con el mtodo de difusin completa.

Sensibilidad del mtodo: en los lmites de 1 a 3mg/mL de antgeno

Aplicacin clnica importante: Medicin de protenas sricas, como Igs, C3 y C4


45

III. REACTIVOS

1. Solucin salina amortiguada de fosfatos de pH 7.2


2. 1 ml de suero humano (o de otra especie)
3. 1 ml de antisuero antihumano
4. Tubos con Agarosa al 2 %

IV. MATERIAL Y REACTIVOS:

1. Bao mara a 56 C
2. Tubos de ensayo 13x100 y 7.5x100
3. pipetas de 5 ml
4. Micropipeta 1- 10 l
5. Sacabocados
6. Placas de plstico
7. Cmara hmeda

V. METODOLOGA:

1. Preparar diluciones del antisuero (1:10, 1:20, 1:40 y 1:80) en solucin salina amortiguada
de fosfatos en un volumen total de 4 ml. Dejar en el tubo correspondiente la pipeta usada
para cada dilucin. Colocar los tubos con las diluciones en el bao a 56 C.

2. Cuando los reactivos estn a 56 C, pipetear 3 ml de la agarosa fundida; en cada uno de


los cuatro tubos calentados previamente, utilizando la pipeta precalentada.

3. Aadir 2 ml de cada dilucin de antisuero a los 3 ml de la agarosa fundida; Mezclar


evitando la formacin de burbujas. Dejar la mezcla agar-antisuero en el bao de agua con
la pipeta usada para cada dilucin.

4. Colocar la placa de plstico en la mesa previamente nivelada con un nivel. Y aadir a cada
laminilla 6 ml de la mezcla antisuero-agarosa.

5. Dejar solidificar. Marcar la laminillas sobre un patrn, perforar los pozos y eliminar la
agarosa por medio de un sacabocados (dos hileras de 6 pozos).

6. Hacer las diluciones dobles del antgeno en solucin salina amortiguada.(1:2, 1:4, 1:8 y
1:16).

7. Para cada dilucin, colocar en los pozos 5 y 10 L

8. Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente.

9. Revisar diariamente durante 3 das. Medir el dimetro del anillo de precipitacin a las 24,
48 y a los 72 das de incubacin.

10. Graficar el cuadrado del dimetro contra la concentracin del Ag aadida a los pozos.
46

V. RESULTADOS:

El resultado se observa como un anillo o halo blanco dispuesto circularmente alrededor


del pocillo. Medir el dimetro de los anillos o halos blancos. Este dimetro ser directamente
proporcional a la concentracin del antgeno (albmina y/o globulina). Con los datos de los
anillos en donde se colocaron las muestras patrones se elabora una recta de calibrado
(dimetro al cuadrado contra concentracin del antgeno) y por interpolacin en la recta de
calibrado se obtiene la concentracin de la muestra problema.

VI. CUESTIONARIO;

1. Qu lleva incorporado, generalmente el gel?


2. Cmo se observan los resultados?
3. Cmo se determina la concentracin del problema?
4. Cules son las principales aplicaciones de esta tcnica?
5. Cul es la sensibilidad de la tcnica?

VII. DISCUSION

Discutir sobre la importancia de la reaccin de inmunodifusin radial como un fenmeno


progresivo de la reaccin Ag-Ab y los factores que influyen en el dimetro final del anillo
formado, as como el tiempo necesario para la difusin total y su relacin con la
concentracin, caractersticas de las molculas y la temperatura.

VIII. CONCLUSIONES:
Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

IX. BIBLIOGRAFIA:

1. Arce Mendoza A.Y., Rosas Taraco A.G., Rodrguez Tovar L. E.; Prcticas de inmunologa
general aplicada y Veterinaria.
2. Lomonte, B. (2009) Tcnicas de Laboratorio en Inmunologa Clnica, 122 pp. Universidad
de Costa Rica. Acceso libre en: http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/
3. Kuby: Janis Immunology (2007). Editorial Freeman.
4. Christine Dorresteyn Stevens, EdD, MT; Clinical Immunology and Serology. A Laboratory
perspective, F.A. Davis Company. 1996.
5. Faustina Rubio C., Benjamin Garca E., Manuel Carrasco C.; Inmunologa. Aplicaciones
prcticas en Hematologa y Microbiologa. Editorial Paraninfo. 1995
47

PRCTICA NO. 9
REACCION DE HEMOAGLUTINACION PARA LA TITULACIN DE ANTICUERPOS
PRODUCIDOS DURANTE EL PROTOCOLO DE SENSIBILIZACIN CON ERITROCITOS DE
CARNERO.
I. OBJETIVO
Al finalizar la prctica, el alumno ha de ser capaz de:

1. Realizar la reaccin que ocurre cuando se mezcla un Ag particulado multivalente (glbulos


rojos) con su Ac especfico bivalente.
2. Determinar el ttulo de anticuerpos especficos contra glbulos rojos de carnero presentes
en el suero del conejo inmunizado.

II. FUNDAMENTO:

La unin de un antgeno y un anticuerpo desencadena una serie de reacciones del


dominio de la serologa. El tipo de reaccin va a depender sobre todo del estado fsico del
antgeno (particulado o soluble) y las condiciones fsicas en que se desarrolla la prueba. Una
vez que el anticuerpo ha sido formado puede ser detectado serolgicamente por diferentes
mtodos como son la reaccin de aglutinacin, de precipitacin y de hemlisis.

La reaccin de aglutinacin es una reaccin antgeno-anticuerpo que resulta de la


fijacin de los anticuerpos a los antgenos de varios eritrocitos formando una red o trama que
mantiene unidas a las clulas. Este proceso se divide en dos etapas o fases distintas y
definidas:

Primera etapa. Conocida como sensibilizacin, el anticuerpo identifica y se fijan a los


antgenos eritrocitarios presentes. Esta fijacin ocurre entre la regin variable de la molcula
de inmunoglobulina (Fab) y los determinantes antignicos correspondientes en la membrana
celular del eritrocito; esta fijacin est mantenida por medio de enlaces qumicos no
covalentes. En esta etapa la aglutinacin no es visible.

Segunda etapa. En esta etapa constituye la unin de eritrocitos sensibilizados con la


formacin de una estructura molecular en forma de red o malla y la subsiguiente visualizacin
de la reaccin de aglutinacin. Una vez que se llev a cabo la aglutinacin se solidifica y
estabiliza la reaccin.

En algunas reacciones las dos etapas ocurren simultneamente, mientras que en otras
solamente se desarrolla la primera.

Los factores que afectan la aglutinacin son:


Primera Etapa Segunda Etapa
Niveles de antgeno y anticuerpo Distancia entre los eritrocitos
El pH o grado de acidez de la solucin Cargas elctricas
La temperatura Tipo de inmunoglobulinas
Tiempo de incubacin
Fuerza inica
48

III. REACTIVOS
1. Suero del conejo inmunizado con G.R.C. (suero anti-glbulos rojos de carnero)
2. Suero del conejo inmunizado con G.R.C. inactivado a 56 C durante 30 minutos o a 63 C
durante 3 minutos.
3. Suspensin de glbulos rojos de carnero al 0.5 % en SSF

IV. MATERIAL POR EQUIPO:

1. Placas de microtitulacin de fondo redondo.


2. Micropipetas de 10 - 50l o de 10-100 l
3. Bao mara a 56 o 63 C

IV. METODOLOGIA:

1. Marcar las placas de microtitulacin de la siguiente manera:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A

2. En las hileras A y B a partir de la columna # 2 colocan 50 L de Solucin salina


fisiolgica o de PBS de pH 7.0 7.2
3. En el pozo A1 y A2 colocar 50 L de suero anti-GRC inactivado a 63C por 3 minutos.
Mezclar bien el contenido del pozo A2 y tomar 50 L y colocarlo al pozo A3, mezclar y
volver a tomar 50 L y pasarlo al pozo A4 y as sucesivamente hasta el pozo A12.
Descartar 50L del ltimo pozo. NOTA: todos los pozos debern tener el mismo volumen.
4. En la hilera B realizar lo mismo pero empleando el suero control del conejo (tomado antes
de la inmunizacin) tambin inactivado a 63C por tres minutos.
5. Aadir a todos los pozos sin excepcin 50 L de la suspensin de los glbulos rojos de
carnero al 0.5%.
6. En los pozos C1 y C2 colocar slo 50 L de solucin salina fisiolgica y 50 L de la
suspensin de los glbulos rojos de carnero al 0.5 %. CONTROL NEGATIVO.
7. En los pozos D1 y D2 colocar 50 L de suero anti-GRC sin inactivar, ms 50 L de SSF y
50 L de suspensin de glbulos rojos de carnero al 0.5%. CONTROL DE HEMLISIS.
8. Dejar en la mesa de trabajo durante 30-45 minutos y leer la presencia de aglutinacin o de
hemlisis.
49

V. RESULTADOS

La aglutinacin nos indica la presencia de anticuerpos especficos de glbulos rojos


que se visualiza con la formacin de un sedimento uniforme en el fondo del tubo. La ausencia
de aglutinacin y por lo tanto la falta de anticuerpos especficos se observa como un botn
compacto en el fondo del tubo.
La hemlisis o destruccin completa de los glbulos rojos nos indica la presencia de Ab y
se visualiza como coloracin rojo transparente del sobrenadante.
Obtener el ttulo de anticuerpos aglutinantes y el ttulo de anticuerpos hemolisantes. Se
reporta el ttulo del suero expresado ya sea como dilucin o la inversa de la misma.

VI. CUESTIONARIO:
1. Investigue como influyen cada uno de los factores descritos en el texto en la reaccin de
aglutinacin.
2. Cules son las aplicaciones de las reacciones de aglutinacin?
3. Cul es la sensibilidad del mtodo?
4. Por qu se observa hemlisis cuando empleamos en la reaccin el complemento?
5. Cmo se define el ttulo de anticuerpos?
6. De acuerdo al ttulo obtenido el conejo inmunizado con glbulos rojos demuestra una
adecuada respuesta inmunolgica.

VII. DISCUSION

Discutir que indica el ttulo de anticuerpos obtenidos por esta tcnica, cules son los
factores que influyen en la reaccin de aglutinacin y si hubo una diferencia entre aglutinacin
y hemlisis.

VIII. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

DETERMINACIN DE ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DEL RPODUCTO


BIOLOGICO (VACUNA)

METODOLOGA:

1. En una gradilla se colocan dos hileras de 10 tubos cada una.


2. Los tubos de la primera hilera se marcan con una "H" y numeracin progresiva del
1-10.
3. Los tubos de la segunda hilera se marcan con una "O" y numeracin progresiva del
1-10.
4. Se agregan a cada tubo 0.25 ml de solucin salina.
5. Al primer tubo de la fila "H" se agrega 0.25 ml de suero de conejo anti-antgeno "H". Se
mezcla bien con la misma pipeta
6. Se toman 0.25 ml del tubo 1 y se transfieren al tubo 2. Se mezcla bien.
7. Se contina en la misma forma hasta el tubo 9, del cual se desechan 0.25 ml.
8. El tubo nmero 10 ser el testigo de la prueba y solamente contendr 0.25 ml de solucin
salina.
9. Se adicionan a estos tubos de la hilera "O" 0.25 del antgeno "H". Se agitan los tubos.
50

10. En los tubos de la hilera "O" se repiten los pasos 5 a 8 pero utilizando el suero de conejo
anti-antgeno "O".
11. Se adicionan a estos tubos 0.25 ml de la suspensin de antgeno "O" y se agitan bien.
12. Se sumerge la gradilla en el bao mara y se incuba durante 18 horas.
13. En el fondo de cada tubo se busca la presencia de aglutinacin la cual deber estar
ausente en los dos tubos nmero 10, en caso de no suceder esto se desecha la prueba y
se preparan nuevos antgenos.
14. El ttulo del suero en cada caso corresponder a la dilucin mayor en la que todava se
observa aglutinacin.

X. RESULTADOS:

Reportar el ttulo del suero expresado ya sea como dilucin o la inversa de la misma.

XI. DISCUSIONES:

Observaciones durante el desarrollo de la prctica, tales como fuentes de error,


precauciones, comentarios, aclaraciones a la tcnica, etc. Discutir que indica el ttulo de
anticuerpos obtenidos por esta tcnica y cuales son los factores que influyen en la
reaccin de aglutinacin.

XII. CUESTIONARIO

1. Cules son los factores que influyen en las reacciones de aglutinacin y como lo
hacen?
2. Cuantos tipos de reaccin de aglutinacin hay?
3. Cul es la sensibilidad de las reacciones de aglutinacin?
4. Qu diferencia observaste en las aglutinacin de antgeno somtico y flagelar? y por
qu?
5. Menciona cinco aplicaciones de la reaccin de aglutinacin.

IX. BIBLIOGRAFIA:

i. Arce Mendoza A.Y., Rosas Taraco A.G., Rodrguez Tovar L. E.; Prcticas de inmunologa
general aplicada y Veterinaria.
ii. Lomonte, B. (2009) Tcnicas de Laboratorio en Inmunologa Clnica, 122 pp. Universidad
de Costa Rica. Acceso libre en: http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/
51

PRACTICA No.10
TIPIFICACION DE GRUPOS SANGUINEOS Y DETERMINACIN DE COMPATIBILIDAD
SANGUINEA

I. OBJETIVO.

Al finalizar la prctica, el alumno ha de ser capaz de:

1. Realizar la tipificacin de los grupos sanguneos del sistema ABO y Rh por medio de la
tipificacin celular (prueba directa) y deteccin srica (prueba inversa).
2. Analizar la importancia que tienen los grupos sanguneos de los sistemas ABO y Rh en
las transfusiones sanguneas.
3. Realizar la prueba cruzada de compatibilidad para la deteccin in vitro de dos sangres
(receptor y donador) que son del mismo grupo A, B, O y Rh (D) son en realidad
compatibles y por lo tanto tengan una aceptable sobrevida y no causen dao al receptor.

II. INTRODUCCION:

Los glbulos rojos poseen en su membrana diferentes macromolculas ms o menos


abundantes y ms o menos profundas con capacidad antignica. Algunas de estas
macromolculas estn relacionadas entre s, de forma que pueden ser agrupadas, atendiendo
a sus afinidades, de manera que han permitido dividir a stos en distintos sistemas.

Sistemas: corresponde a un grupo de antgenos eritrocitarios que comparten ciertas


caractersticas en comn, como la estructura qumica, los genes involucrados en su
codificacin, la herencia independiente, la topografa en la membrana, etc. (Ejemplo Sistema
Rh). A la fecha se han contabilizado 23 sistemas, de acuerdo con la Sociedad Internacional de
la Transfusin sangunea.

Un sistema eritrocitario consiste en dos o ms antgenos controlados por un solo locus


gentico, o por dos o ms loci homlogos estrechamente relacionados con escasa o con
ninguna recombinacin entre ellos. Algunos de estos sistemas son:

. Sistema ABO o ABH . Sistema Kidd


. Sistema MN/Ss . Sistema Lewis
. Sistema Rh . Sistema I
. Sistema Kell . Sistema P
. Sistema Lutheran
. Sistema Duffy

Estos a su vez han llevado a la clasificacin del hombre en diferentes grupos sanguneos,
las cuales pueden identificarse serolgicamente mediante anticuerpos especficos. Como todos
estos antgenos son hereditarios y cumplen las leyes mendelianas, su importancia en medicina
legal, antropologa, etc., es de valor significativo.
52

El primer grupo de estas substancias fue llamado sistema ABO, descubierto en 1901, por
Landesteiner, que ha sido el mejor estudiado en lo relativo a su composicin qumica. Los
antgenos de este sistema tienen una naturaleza qumica de carbohidratos, de tal forma que los
genes de este sistema no codificaran para el antgeno directamente sino para la produccin de
glucosiltransferasas, enzimas que permiten la transferencia de azcar inmunodominante
especfico a la protena precursora; este proceso se lleva a cabo en el paso que va del retculo
endoplsmico rugoso al sistema de Golgi, como parte integral del mecanismo postraduccional;
cuando la trasferencia es completa se genera un determinante antignico.

Los genes reguladores estn situados en dos loci: el Hh y el ABO. El locus Hh puede
contener los alelos H o h y est localizado en el cromosoma 19, mientras que el locus ABO
est ubicado en el cromosoma 9 y en el pueden localizarse los tres genes allicos (alelos) A, B
o O.

El gen H codifica para la sntesis de una enzima, del tipo de las transferasas, que aade
un residuo de L-fucosa a una sustancia precursora, formndose la sustancia H. Esta
sustancia representa el precursor que bajo la influencia del gen A y B se convierte en el grupo
A o B respectivamente.

El gen A codifica la produccin de otra transferasa que adiciona un resto de N-acetil-


galactosamina a la mayor parte de la sustancia H, transformndola en Sustancia A. Por el
contrario el gen B codifica la sntesis de una nueva transferasa que aade un residuo de D-
galactosa a la mayora de la sustancia H, convirtindola en sustancia B. El gen O es un gen
amorfo que no altera la estructura de la sustancia H

Resumiendo tenemos que desde el punto de vista gentico, estos grupos sanguneos se
deben a la existencia de tres genes allicos, gen A, gen B y gen O, siendo A y B dominantes
respecto a O. Los genes A y B codifican la expresin o rigen la produccin de las sustancia A y
B, mientras que el gen O no dirige la sntesis de ningn isoantgeno.

SUSTANCIAS GRUPO TRANAFERASA


H O Fucosil transferasa
H y A A N-A-galactosamil
trasferasa
H y B B Galactosil-trasferasa
H, A y B AB N-A-galactosamil y
Galactosil-
transferasas

Los mtodos para la determinacin de los grupos sanguneos se realiza de dos maneras,
en la primera se determina la presencia de antgenos, y esto se conoce como deteccin celular
o prueba directa y en la segunda se desafa los anticuerpos circulantes contra eritrocitos de
fenotipo conocido y se conoce como deteccin srica.
53

La deteccin celular del grupo sanguneo ABO que recibe tambin el nombre de tipaje
globular ABO se puede realizar mediante la tcnica en placa o mediante la tcnica en tubo. En
ambos casos, los glbulos rojos problema, que contienen sustancias antignicas del sistema
ABO, se ponen en contacto con antisueros especficos dirigidos contra esos antgenos.

El resultado final de esta determinacin consiste en la aglutinacin directa de los


eritrocitos cuando reaccionan con el antisuero que les corresponda.

Este sistema es de trascendental importancia en las transfusiones sanguneas, por lo cual


es indispensable tipificar correctamente el tipo al cual pertenecen tanto el donador de sangre
como el receptor correspondiente.

La deteccin celular del grupo sanguneo Rh. La presencia del antgeno D en la


membrana de los glbulos rojos se detecta por enfrentamiento de los eritrocitos problema a un
suero anti-D. El resultado final de esta determinacin consiste en la aglutinacin directa de los
glbulos rojos Rh+, cuando reaccionan contra su antisuero especfico

SISTEMA Rh.

En 1940, Landsteiner y Kiener descubrieron otro antgeno como resultado de la


inmunizacin de cobayos y conejos con sangre de monos de la especie Macacus rhesus,
basndose en la suposicin de que en los eritrocitos de estos monos podran existir antgenos
similares a los de humanos pero que an no se hubieran descubierto en los glbulos rojos
humanos. Se pens que los aglutingenos entonces desconocidos pero existentes en la
sangre humana empleada para inmunizar los animales tendran que competir con antgenos
ms potentes, que eran los conocidos en esa poca (A, B, M, N y P) por lo que la formacin de
anticuerpos contra antgenos ms dbiles podra quedar suprimida o enmascarada por los ms
fuertes. Despus de absorber los anticuerpos conocidos (Anti-A, Anti-B, Anti-M, etc.), el suero
de los conejos que haban recibido eritrocitos de mono rhesus reaccion con los eritrocitos del
85% de las personas de raza blanca estudiadas. Los individuos que reaccionaron fueron
denominados Rh-positivos (Rh+) y los que no reaccionaron Rh-negativos (Rh-).

Actualmente se sabe que el sistema Rh est determinado por tres pares de genes alelomorfos
Cc Dd Ee los cuales codifican para 5 substancias qumicas definidas C, c D E y e. En realidad
la existencia del alelo d es puramente hipottica puesto que no se ha encontrado su producto,
o sea la sustancia d. Por su potencia antignica la substancia ms importante es la D, que es
la que se determina en el laboratorio con el suero anti-D (anti-Rh) y es como se proporciona el
criterio de Rh (+), Rh (-) segn sea el resultado de la prueba. Adems de los sistemas ABO Y
Rh (CDE) existen otros de menor importancia clnica, los cuales usualmente no se determinan.

De este sistema, solamente se determina en forma rutinaria la presencia del antgeno D


(Rh) debido a que puede inducir una respuesta inmune, indeseable, cuando los glbulos rojos
Rh (+) entran en contacto con el sistema inmune de sujetos Rh (-). Esto puede ocurrir de modo
natural en el caso de madres Rh (-) con productos (+) o de modo artificial en el caso de
transfusiones.
54

DETECCIN SRICA DEL GRUPO SANGUNEO ABO

Todos los individuos adultos tienen en su suero anticuerpos dirigidos contra los
antgenos del sistema ABO que no poseen sus glbulos rojos. Estos anticuerpos reciben el
nombre de aloanticuerpos y presentan las siguientes caractersticas:

1. Son de aparicin natural


2. Generalmente son de la clase IgM
3. Son capaces de activar el complemento y originar una rpida destruccin intravascular de
los GR
4. Aglutinan mejor a los GR a temperatura ambiente que a 37

Los aloanticuerpos dirigidos contra los antgenos del sistema ABO se detectan
enfrentando el suero que los contiene con glbulos rojos tipados, es decir, con glbulos rojos
cuyo grupo ABO es conocido.

Esta determinacin slo puede realizarse mediante la tcnica de tubo y aunque es una
reaccin de aglutinacin directa, se dice que es INVERSA, pues en el se buscan los
anticuerpos presentes en el suero y no los antgenos propios de los glbulos rojos.

Pueden presentarse discrepancias en la realizacin de la prueba. Estas son inherentes


a los eritrocitos, el suero, la tcnica o humanos. La presencia o ausencia de aglutinacin puede
confirmarse mediante examen microscpico de las mezclas. Pueden darse falsos positivos,
principalmente por aglutinacin no especfica y por el fenmeno de Rouleaux.

III. REACTIVOS

1. Antisueros (anti A, anti - B, anti AB y anti - D o Rh)


2. Solucin salina fisiolgica al 0.85% 0.9%.
3. Glbulos rojos tipados A
4. Glbulos rojos tipados B
5. Suero problema
6. Solucin de albmina al 25%
7. Solucin de ficina (1 mg/ml) o de papaina (10mg/ml), esta solucin se expende
comercialmente lista para usarse.
8. Suero de coombs.

IV. MATERIAL Y EQUIPO

Material
55

1. Placas excavadas de porcelana o de vidrio.


2. Aplicadores de madera.
3. Lancetas estriles.
4. Torundas alcoholadas.
5. Gradilla metlica.
6. Tubos de hemlisis de 13 x 100mm
7. Tubos de hemlisis de 13 x 75mm.
8. Pipetas Pasteur con bulbo
9. Centrfuga
10. Bao Mara a 37 C

V. PROCEDIMIENTO

DETECCIN CELULAR DEL GRUPO SANGUNEO DEL SISTEMA ABO Y Rh

1. Se rotula una placa de porcelana o portaobjetos de la siguiente manera anti-A, anti-B y


anti-D

2. Se hace asepsia en el dedo anular y con una lanceta se pincha el dedo. Se coloca una
gota de sangre en la placa que tiene las marcas anti-A, anti-B, anti-D.

3. Cerca de cada gota, se agrega una gota de suero comercial anti-A, anti-B, anti-D, segn
corresponda. Se mezcla primero suavemente con ayuda de un palillo y despus con
movimientos rotatorios.

4. Se busca la presencia de aglutinacin antes de 25 segundos.

Lectura de los resultados: Hay aglutinacin cuando aparecen unos grumos rojos que flotan
en un lquido claro. En el caso contrario, los glbulos rojos permanecen en forma de
suspensin homognea de color rojo homognea. Por ejemplo si se observa el siguiente
resultado:

anti-A, anti-B, anti-D


Aglutinacin - + +
Indicar a que los glbulos rojos corresponden al grupo sanguneo A y al Rh (+).

Si el grupo sanguneo del paciente es A presentar aglutinacin en A y en AB, y si el grupo


sanguneo es O no presentara aglutinacin en A ni en B, ya que A presenta anticuerpos
contra B y B presentar anticuerpos contra A por lo tanto el grupo O presentar
anticuerpos contra ambos.

El grupo sanguneo en el sistema A, B, O, se determina de acuerdo al siguiente cuadro:

REACCION DE LOS ERITROCITOS


56

ANTISUEROS COMERCIALES GRUPO


SANGUNEO
anti-A anti-B Anti-AB
+ + + AB

+ - + A
- + + B
- - - O

DETECCIN SRICA DEL SISTEMA ABO

1. Marcar un tubo de ensaye con la letra A (de G.R. A), otro con la letra B (de G.R. B) y un
tercero con la letra C (control).
2. Colocar dos gotas del suero problema en cada uno de los tres tubos

3. Aadir una gota de glbulos rojos A en tubo A, una gota de glbulos rojos B en el tubo B y
una gota de glbulos rojos problema en el tubo C.
4. Mezclar mediante aglutinacin suave.
5. Centrifugar a unas 3 500 r.p.m., durante 30 segundos aproximadamente-

Lectura de los resultados


Agite suavemente el botn de los glbulos rojos del fondo del tubo, golpeando el
extremo inferior de los tubos, suave y sucesivamente con los dedos. Hay aglutinacin cuando
aparecen unos grumos rojos que flotan en un lquido claro. En caso contrario los glbulos rojos
se resuspenden homogneamente dando lugar a un lquido de color rojizo.

Interpretacin clnica de los resultados obtenidos


De acuerdo a los resultados obtenidos se determinar el grupo sanguneo

Anticuerpos presentes Grupo


Tubo A Tubo B Tubo C en el suero sanguneo
- - - Ninguno AB
- + - anti-B A
+ - - anti-A B
+ + - anti-A y anti-B O
+ + + autoanticuerpos ?

V. RESULTADOS: En este punto incluyan el resultado obtenido, definiendo el grupo


sanguneo de las muestras de sangre analizadas, ya sea en suero o en eritrocitos.

VI. CUESTIONARIO

1. Cules son los factores que influyen en las reacciones de aglutinacin y como lo hacen?
57

2. En la prueba directa para determinar la presencia de antgenos en la superficie de los


eritrocitos, se emplean reactivos de diferentes orgenes cmo se pueden obtener estos
reactivos?
3. Cules son los errores tcnicos ms comunes en las discrepancias ABO?
4. Qu fluidos del cuerpo contienen sustancias solubles ABH?
5. Cmo se explica la presencia de anticuerpos naturales contra los grupos sanguneos A y
B?
6. A qu se debe la presencia de aglutinacin no especfica en estas pruebas?
7. Qu es y a que se debe el fenmeno de rouleaux?
8. Cul es la naturaleza qumica del antgeno Rh?
9. Cmo se obtienen los antisueros anti-D?

VII. DISCUSION:
Interprete y discuta los resultados

VIII. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.
58

PRACTICA No. 11
CARACTERIZACIN DE LA ESTRUCTURA DE LOS ANTICUERPOS MEDIANTE
INMUNOBLOT

I. OBJETIVOS:

Al trmino de la prctica, el alumno ser capaz de:

1. Describir la estructura de los anticuerpos.


2. Comprender el fundamento y la importancia de la tcnica de Westerm blot.
3. Demostrar la presencia de protenas mediante la reaccin antgeno-anticuerpo a travs de
una inmunotransferencia.

II. INTRODUCCION:

Desde finales del siglo XIX se sabe que los anticuerpos residen en el suero sanguneo
como un sistema de defensa que tienen como principales funciones la neutralizacin y
eliminacin de antgenos extraos. (A mediados del siglo XX se demostr que tambin hay
anticuerpos en otras secreciones corporales: leche, lgrimas, saliva, bilis, etc.) Al centrifugar la
sangre pueden separarse una fraccin lquida y otra celular. La primera es el plasma y la
segunda contiene glbulos rojos, leucocitos y plaquetas. El plasma comprende todas las
molculas pequeas y macromolculas solubles de la sangre, incluidas la fibrina y otras
protenas necesarias para la formacin de cogulos sanguneos. Si se deja coagular la sangre
o el plasma, la fase lquida que permanece se denomina suero. La primera prueba de que los
anticuerpos estn contenidos en fracciones protenicas sricas particulares se obtuvo de un
clsico experimento que llevaron a cabo Arne Tiselius y Elvin A. Kabat en 1939. Estos
cientficos inmunizaron conejos con la protena ovalbmina (la albmina de la clara de huevo) y
a continuacin dividieron el suero de los conejos inmunizados en dos alcuotas. La
electroforesis de una alcuota identific cuatro picos, correspondientes a la albmina y las
globulinas , y . Antes de la electroforesis, la otra alcuota srica se mezcl con el antgeno
inmunizante (ovalbmina), para permitir la formacin de un inmunoprecipitado (complejo de
antgeno y anticuerpo) el cual se extrajo para dejar slo las protenas sricas restantes, que no
reaccionaron con el antgeno. Una comparacin de los perfiles electroforticos de estas dos
alcuotas sricas revel un decremento considerable del pico de la globulina
(gammaglobulina) en la alcuota que reaccion con antgeno. De esta manera, se identific que
la fraccin globulnica contena los anticuerpos sricos, a los que se denomin
inmunoglobulinas. Hoy en da se sabe que si bien la inmunoglobulina G (IgG), la principal
clase de molculas de anticuerpo, en efecto se encuentra en su mayor parte en la fraccin
globulina , existen cantidades significativas de ella y otras clases importantes de molculas de
anticuerpo en las fracciones , del suero. Otra forma de poder aislar a los anticuerpos es a
travs de su precipitacin con sustancias como el sulfato de amonio.

Diferentes experimentos son los que ayudaron al entendimiento de la estructura del


anticuerpos. Uno de estos experimentos incluye el tratamiento de estas protenas con -
mercaptoetanol, tratamiento qumico que rompe de manera irreversible enlaces disulfuro pero
no enlaces peptdicos. De tal forma, que al separar esta muestra por su peso molecular,
despus del tratamiento qumico, resulta que la protena que en un inicio era de
aproximadamente 150 kDa, ahora consiste en dos cadenas pesadas de 50 kDa, a las que se
les conoce como cadenas pesadas y dos cadenas ligeras y dos cadenas ligeras de 22 kDa
aproximadamente.

En la actualidad una de las tcnicas que permite el estudio de los anticuerpos y que
adems los utiliza como herramienta es el inmunoblot. Como en la inmunoprecipitacin, el
inmunoblot es usado para detectar la presencia de algunas protenas en diferentes tipos de
muestras. Las muestras problemas se colocan en el detergente para solubilizar todas las
protenas y el lisado se hace pasar por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecil sulfato sdico para separar las protenas. Posteriormente las protenas separadas por
su tamao son transferidas a un soporte estable como una membrana de nitrocelulosa. Las
protenas especficas son detectadas por anticuerpos capaces de reaccionar con protenas
solubilizadas con SDS (principalmente estos reaccionan con secuencias desnaturalizadas).
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Posteriormente los anticuerpos unidos son revelados por anticuerpos anti-inmunoglobulinas


marcados con enzimas o radioistopos. El trmino Western blot como sinnimo de
inmunotransferencia surgi debido a la tcnica similar para la deteccin de secuencias
especficas de ADN que se conoce como transferencia Southern, despus de que Ed Southern
lo ideara as, lo que llev ms tarde a nombrar como Northern a las bandas de ARN separadas
por tamao, y Westhern a las de las protenas separadas de la misma manera. El Western blot
tiene muchas aplicaciones en la investigacin bsica y en el diagnstico clnico.

III. MATERIAL:

1. Cmara de electrotransferencia
2. Equipo para preparar geles
3. Fuente de poder
4. Papel Filtro
5. Membrana de PVDF(Difluoruro de polivilideno)
6. Matraces
7. Probetas
8. Pipetas
9. Micropipetas
10. Puntas
11. Tubos eppendorf

IV. REACTIVOS:

1. Suero problema
2. Antisuero de conejo anti-suero problema
3. Anticuerpo anti-conejo
4. Agua destilada
5. Tris pH 8.8 (1.5 M Trizma Base, 0.014M SDS)
6. Tris pH 6.8 (0.5 Trizma Base, 0.014M SDS)
7. APS 10%
8. TEMED
9. Acrilamida (30% Acrilamida/0.8% bisacrilamida)
10. Electrobuffer (Trizma Base 0.025M, Glicina 0.25M, SDS 3.5mM, pH 8.3)
11. Buffer de transferencia (Trizma Base 0.024M, glicina 0.186M, Metanol 4.1M)
12. Marcador de peso molecular de amplio espectro
13. Solucin de bloqueo (leche en polvo al 5% en TBS)
14. Metanol absoluto
15. TBS (NaCl 0.5M, Tris HCl 0.02M)
16. TTBS(Tween 20 al 0.2% en TBS)
17. Fosfatasa alcalina
18. Buffer de muestra:
Tris pH 6.8-------------------2.5 ml
SDS 10%------------------------4 ml
Glicerol------------------------- 2.0 ml
Bromofenol 0.4 %------------ 400 l
-Mercaptoetanol-------------- 1.0 ml

V. PROCEDIMIENTO:
A. Electroforesis

1. Preparar el persulfato de amnio (APS) al 10% (100mg. en 1 ml. de agua dest.) y


guardarlo a 4C hasta su uso.
2. Limpiar los cristales con etanol al 70%.
3. Colocar el juego de cristales delgado y grueso (separador) en la base para preparar el gel.
4. Preparar el gel separador de acuerdo a la concentracin deseada como se muestra en la
tabla 1. Considere que el TEMED y APS se deben agregar justo antes de vaciar la solucin
entre los cristales.
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5% 7.5% 10% 13.5% 16%


AGUA DEST. 8.52 ml 4.5 ml 4.02 ml 2.85 ml 2.05 ml
TRIS pH 8.8 3.75 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml
ACRILAMIDA 2.5 ml 2.5 ml 3.33 ml 4.5 ml 5.3 ml
APS 10% 75 l 50 l 50 l 50 l 50 l
TEMED 7.5 l 5 l 5 l 5 l 5 l
TOTAL 15 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

5. Vaciar el gel con la ayuda de una pipeta Pasteur y evitando burbujas entre los cristales.
Dejar un espacio vaco al final entre 2 y 3 cm.
6. Dejar polimerizar el gel por aproximadamente 20 minutos.
7. Prepara el gel concentrador como indica la tabla 2 y vaciar sobre el gel separador.

AGUA BIDESTILADA 5.5 Ml


UPPER BUFFER 5.0 ml
ACRILAMIDA 1.3 ml
APS 50 l
TEMED 10 l
TOTAL 10 ml

8. Inmediatamente colocar los peines evitando hacer burbujas. Nuevamente dejar polimerizar
por 20 minutos aproximadamente.
9. Preparar las muestras y el marcador de peso molecular como se indica a continuacin:
Purificacin de inmunoglobulinas: a 100 l de suero de conejo sensibilizado con suero de
una animal diferente, se le ponen 50 l de solucin saturada de sulfato de amonio
(NH4)2SO4 4.1 M. se deja reposar a 4C durante toda la noche. Centrifugar a 3000 x g
durante 30 minutos a 10C para recuperar las IgG precipitadas. Finalmente el precipitado
se resuspende en 50 l de PBS pH 7.4.
Cargar la muestra problema en una concentracin no mayor a 100 g de protena en 20 l
de muestra, tanto purificadas como sin purificar, para hacer las respectivas comparaciones.
Aforar la muestra a 30 l con el buffer de muestra y agitar.
Llevar a ebullicin en bao Mara durante 5 minutos.
10. Desmontar los cristales del soporte de cristales y pasarlo al soporte de electrodos. Y
montar en conjunto en la cmara de presin. Para finalmente montarlo en la cmara de
electroforesis.
11. Retirar los peines y en cada carril coloque las muestras segn su esquema. Si quedan
calles vacas cargarlas con el buffer de la muestra.
12. Llenar la cubeta con el electro buffer de manera que los geles entren en contacto con este,
tanto en la parte superior como en la inferior.
13. Tapar la cmara conectando adecuadamente los electrodos y comenzar a la electroforesis
a 80 volts (aproximadamente 2 horas).
14. Una vez que la lnea de corrida (lnea azul) llegue al final de los geles detener la
electroforesis.

B. Transferencia

1. Desmontar los geles y pasarlos al buffer de transferencia.


2. En otro recipiente mojar dos trozos de papel filtro y dos esponjas de transferencia, por cada
gel a transferir.
3. Montar el cassete de Western Blot del nodo (-) al ctodo (+) de la siguiente manera:
esponja, papel filtro, gel, membrana de PVDV (previamente sumergida en metanol), papel
filtro, esponja y cerrar cassete. Evite en todo momento la formacin de burbujas entre el gel
y la membrana.
4. Montar el cassete en la cmara de transferencia junto con su refrigerante para evitar
sobrecalentamiento de la solucin.
5. Iniciar la transferencia a 100 mAmp por 2 horas.
6. Desmontar la membrana transferida y comenzar con la inmunotincin.
61

C. Inmunotincin:

1. Baar la membrana transferida en metanol al 100%.


2. Sumergir la membrana en solucin de bloqueo, preparada al instante por 1h en agitacin a
temperatura ambiente (separar antes un poco de esta solucin para diluir los anticuerpos
primario y secundario).
3. Transferir la hoja al primer anticuerpo, en este caso en el suero de conejo sensibilizado,
preparado previamente en leche en polvo 5% en una dilucin de 1:500, durante 24 horas
en agitacin a 4 C.
4. Lavar con agua destilada 1 vez por 5 min.
5. Lavar 2 veces con TTBS por 10 minutos cada vez.
6. Lavar con TBS 1 vez por 5 min.
7. Incubar con el segundo anticuerpo (anticuerpo anti-conejo) preparado en TBS ms leche
en polvo al 5% en una dilucin de 1:10 000 durante 2h en agitacin a temperatura
ambiente.
8. Lavar con TTBS 2 veces por 15 min y 5 lavados de 5 min cada uno.
9. Lavar 1 vez con TBS por 5 min.
10. El revelado se realiza con fosfatasa alcalina:

o Se toma una pastilla de fosfatasa y se tritura antes de abrirla para lograr que se
disuelva con mayor facilidad.
o Se corta el empaque por una esquina y se mezcla en 10 mL de agua destilada
contenidos en un matraz cubierto con aluminio.
o Se puede mezclar agitando suavemente con la mano o puede colocarse en la placa
agitadora que contiene el recipiente con la membrana y el ltimo enjuague.

11. Se colocan la solucin preparada de fosfatasa y la membrana en un recipiente y se agita


de un lado a otro para impregnarla bien.
12. Detener la reaccin pasando la membrana a otro recipiente con agua destilada, al
observar claramente las bandas obtenidas.

VI. RESULTADOS:

En este punto incluyan solamente el resultado obtenido, sin comentarios ni


observaciones, las cuales se considerarn en otro punto.

VII. CUESTIONARIO:

1. Para qu se utiliza el cloruro de amonio?

VIII. DISCUSIN:

Interprete y discuta los resultados

IX. CONCLUSIONES:

Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFA:

1. Fundamentos de Bioqumica estructural, Jose Mara Teijn, Editorial Teba, 2006. Tema 11:
163-164 (Teijn, 2006).
2. Aspectos bsicos de bioqumica Clnica, Daz Portillo J, Fernndez del barrio MT., Paredes
Salido F. 1997, Madrid, Espaa.
3. Inmunobiolga de Janeway. Kenneth Murphy, Paul Travers, Mark Walport. 2010. Editorial
Mc-Graw Hill. 7 ed.
4. Tesis Doctoral: Deteccin de adulteracin de leche con suero de quesera por medio de un
sistema por ELISA. Chvez Vela NA, 2008. Universidad Autnoma de Aguascalientes.
62

PRACTICA No. 12
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
I. OBJETIVO:

Al finalizar la prctica, el alumno a de ser capaz de:

1. Realizar la tcnica serolgica de inmunofluorescencia directa en la deteccin de


subpoblaciones celulares en sangre perifrica.

II. INTRODUCCION:

INMUNOFLUORESCENCIA
Se conocen como mtodos de inmunofluorescencia a aquellos en los que se utilizan
anticuerpos que tienen unidos molculas fluorescentes (fluorocromos). Estas ltimas tienen
como caracterstica comn la de emitir luz visible despus de haber sido excitadas con energa
de una longitud de onda menor. En general, se utilizan dos tipos de fluorocromos: rodamina y
fluorescena, ambas se excitan con luz ultravioleta o azul y respectivamente emiten luz roja y
verde-amarillenta. Puesto que la conjugacin fluorocromo-anticuerpo no altera
importantemente la especificidad de estos, puede utilizarse para identificar las presencias de
antgeno en diversos materiales (frotis. improntas, clulas purificadas, cortes histolgicos. etc.).
Tambin se utiliza en cortes de tejidos y en cultivos celulares. Aqu podemos detectar y
localizar el antgeno, anticuerpo, complemento y reacciones Ag-Ab. Permite el diagnstico
rpido de infecciones microbianas al localizar al agente causal en un determinado tejido o
clula.
En estas tcnicas histoqumicas o citoqumicas se necesita un microscopio de
fluorescencia para realizar el anlisis de los resultados. Tienen como caracterstica
diferenciadora de los microscopios pticos convencionales, un sistema de iluminacin especial
y una fuente de luz con el espectro electromagntico correspondiente al mximo de absorcin
de los fluorocromos utilizados.
El microscopio de fluorescencia tiene un sistema de iluminacin incidente o de
epifluorescencia, donde la luz de excitacin entra en ngulo recto en el tubo del microscopio,
se refleja en un espejo dicroico (filtros de interferencia) e incide sobre la muestra. La luz emitida
se observa a travs de este espejo y del ocular del microscopio.
La muestra exige una preparacin especial ya que hay que evitar la inactivacin de los
antgenos. Para ello los tejidos de biopsia y los sustratos empleados deben congelarse
inmediatamente en nitrgeno lquido y conservarse a -70C. Posteriormente se cortan en el
cristato y se colocan en el portaobjetos para que se proceda a su tincin.

Existen dos, mtodos principales de inmunofluorescencia:

1. Directa donde los anticuerpos conjugados a fluorocromo estn dirigidos contra el antgeno
por investigar.
2. Indirecta donde se hace reaccionar primero un anticuerpo no conjugado con su antgeno y
la reaccin se visualiza posteriormente con un anticuerpo anti-inmunoglobulina marcada
con un fluorocromo. Este mtodo permite detectar tanto antgenos como anticuerpos, y
tiene la ventaja de que un mismo anticuerpo antiglobulina puede utilizarse en mltiples
63

tipos de reaccin Ag-Ab. Normalmente se usa una inmunoglobulina antihumana de conejo


o cabra, que abarata el costo de la tcnica en comparacin del mtodo directo, donde se
usan anticuerpos mono especficos marcados con fluorescencia.

III. MATERIAL Y EQUIPO


1. Microscopio con fuente de luz ultravioleta
2. Inmunoglobulina gama anti-CD3, -CD8 y/o -IgM.
3. Solucin salina
4. Amortiguador de fosfatos (PBS), pH 7.2.
5. Glicerol al 70% en PBS (v/v)
6. Azul de Evans
7. Portaobjetos y cubreobjetos
8. Pipeta pasteur

V. PROCEDIMIENTO

1. Separar clulas mononucleares por el mtodo de Fycoll Hypaque.


2. Se ajustan las clulas entre 2.5 y 5*106 clulas por ml de RPMI.
3. Se toman 100 l de la suspensin celular y se le adicionan 10 l de anti-CD8+/PE (1:5) y 10
l de anti-IgM/FITC (1:2).
4. Mezclar e incubar durante 20 minutos y hielo o a 4C en el refrigerador y protegido de la luz.
5. Lavar con 1 ml de PBS (2500 rpm/10 min).
6. La pastilla se resuspende en 100 l de medio de montaje PBS:Glicerol (70:30).
7. Finalmente se observa en el microscopio de fluorescencia.

NOTA: una vez q se carga el anticuerpo, los tubos se deben proteger de la luz.

VI. RESULTADOS: En este punto incluyan solamente el resultado obtenido, sin


comentarios ni observaciones, las cuales se considerarn en otro punto.

VII. CUESTIONARIO

1. Describe tres aplicaciones de esta tcnica en el rea de la Biotecnologa.


2. Cules deben ser las caractersticas de un buen fluorocromo?
3. Por qu se utilizan anticuerpos contra CD3, CD8 e IgM?

VIII. DISCUSION Discute tus resultados, sobre la tcnica de Inmunofluorescencia y su


importancia en la Biotecnologa. Puede incluir un punto aparte de observaciones en el
cual se refiere a observaciones durante el desarrollo de la prctica, tales como fuentes
de error, precauciones, comentarios, aclaraciones a la tcnica.

IX. * CONCLUSIONES: Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los
resultados obtenidos.

X. BIBLIOGRAFA
Incluir las fuentes de informacin consultadas, proporcionando sus datos completos.
64

PRACTICA No. 13
ELISA INDIRECTO

I. OBJETIVO:

Al finalizar la prctica, el alumno debe ser capaz de:

1. Comprender y describir el fundamento de la tcnica de ELISA.


2. Determinar la presencia de anticuerpos contra Toxoplasma gondii en una muestra de suero
por medio de un ensayo de ELISA tipo Indirecto.

II. FUNDAMENTO.

El ensayo de inmunosorbente ligado a enzima, que suele conocerse como ELISA (o EIA),
es similar en principio al radioinmunoanlisis pero depende de una enzima en lugar de un
marcador radiactivo. Una enzima conjugada con un anticuerpo reacciona con un sustrato
incoloro para generar un producto con reaccin de color. Ese sustrato se denomina sustrato
cromgeno. Para ELISA se utilizan varias enzimas, como fosfatasa alcalina, peroxidasa de
rbano picante y -galactosidasa. Estas pruebas tienen sensibilidad comparable a los RIA y la
ventaja de ser ms seguras y menos costosas.

La superficie de los pocillos de titulacin estn recubiertos con el antgeno de Toxoplasma


gondii, La muestra de suero diluido se adiciona a cada pocillo y si est presente el anticuerpo
IgG anti-Toxoplasma gondii se unir al antgeno. Todos los componentes que no se unan se
eliminarn durante el lavado. Despus se adiciona un conjugado-HRP, el cual se une al
complejo antgeno anticuerpo y aquel conjugado que no se una se elimina mediante el lavado.
Enseguida se adiciona el sustrato (TMB) y despus de un tiempo especfico la reaccin
enzimtica se detiene para finalmente ser leda en el espectrofotmetro de ELISA. La
intensidad de color generada es proporcional a la cantidad de anticuerpo IgG especfico en la
muestra.

III. REACTIVOS

1. Suero problema
2. Reactivo conjugado a enzima
3. Diluyente de la muestra
4. Calibrador 1 (0 IU/ml)
5. Calibrador 2 (32 IU/ml)
6. Calibrador 3 (100 IU/ml)
7. Calibrador 4 (300 IU/ml)
8. Control de baja concentracin
9. Control de alta concentracin
10. Buffer de lavado 20X
11. Sustrato TMB (3,3'5,5' TETRAMETIL-BENCIDINA)
12. Solucin de paro (HCl 1N)

IV. MATERIAL Y EQUIPO:

13. Pocillo de microtitulacin recubiertos con Toxoplasma gondii


14. Micropipetas
15. Puntas para micropipeta
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III. PROCEDIMIENTO
1. Tomar el nmero deseado de pocillo en el soporte de placa de ELISA.
2. Preparar una dilucin 1:40 de las muestras problemas, controles de baja y alta
concentracin y calibradores, adicionando 5 l de muestra a 200 l de buffer de muestra.
3. Dispensar 100 l de las diluciones preparadas anteriormente a cada pocillo
respectivamente dejando al pocillo uno vaco para colocarle solo 100 l de buffer de
muestra. Procurar eliminar las burbujas de aire que se hayan formado y mezclar bien.
4. Incubar a 37C por 30 minutos.
5. Pasado el tiempo, remover el lquido de los pocillos y lavar 5 veces con 100 ml de buffer
de lavado 1X.
6. Dispensar 100 l de la enzima conjugada a cada pocillo y mezclar gentilmente durante 10
segundos.
7. Incubar a 37C por 30 minutos.
8. Remover la enzima conjugada de los pocillos y lavar 5 veces con 100 l del buffer de
lavado 1X.
9. Adicionar 100 l del reactivo TMB a cada pocillo y mezclar gentilmente durante 10
segundos.
10. Incubar a 37C por 15 minutos.
11. Pasado el tiempo adicionar 100 l de la solucin de paro y mezclar gentilmente durante 30
segundos.
12. Finalmente leer a 450 nm en el lector de ELISA antes de 15 minutos.
13. Para calcular el ttulo de IgG especfica para Toxoplasma gondii, calcular la media de la
muestra y dividirla entre la media del calibrador 2.

IV. RESULTADOS: En este punto incluyan solamente el resultado obtenido, sin comentarios
ni observaciones, las cuales se considerarn en otro punto.

V. CUESTIONARIO
1. Describe otras 3 aplicaciones de la tcnica de ELISA.
2. Cul es la diferencia entre un ELISA directo, indirecto y tipo Sandwich?

VI. DISCUSION

Discutir sobre la tcnica de ELISA y la importancia de la determinacin de anticuerpos


anti.Toxoplasma gondii. Puede incluir un punto aparte de observaciones en el cual se refiere
a observaciones durante el desarrollo de la prctica, tales como fuentes de error, precauciones,
comentarios, aclaraciones a la tcnica,

IX. * CONCLUSIONES: Describir las conclusiones sobre el trabajo realizado y sobre los
resultados obtenidos.

* BIBLIOGRAFA: Incluir las fuentes de informacin consultadas, proporcionando sus datos


completos. - Abbas, Abul K. Inmunologa celular y molecular. 2007.
- Kindt, Thomas J. Inmunologa de Kuby. 2007.