CULTIVOS CELULARES

1. Cultivos celulares microbianos.

Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de las clulas in vitro,
conservando al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y
genticas.
El cultivo de clulas y rganos aislados del organismo constituye
una va para resolver problemas biolgicos.
Las clulas fuera del organismo no estn reguladas por el sistema
nervioso ni endocrino, comportndose totalmente independientes.
En condiciones nutritivas y ambientales adecuadas se convierten
en unidades autnomas, ideales para el estudio de la estructura y
comportamiento de las clulas vivientes.
a) Clulas microbianas.- La clula microbiana es una entidad,
aislada de otras clulas por una membrana celular y que contiene
en su interior una variedad de sustancias qumicas y de estructuras
subcelulares.
b) Medios de cultivo.
Para bacterias.

Agar nutritivo:
El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina
para todo tipo de bacteria. Es muy util porque permanece solido incluso
a relativas altas temperaturas. Adems, el crecimiento bacteriano en este
agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias
pequeas.

En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el lquido, y aparece como

una sustancia espesa, con colonias difcilmente observables. El agar
nutritivo contiene normalmente (w/v).

0.5 % Peptona
0.3 % extracto de carne/extracto
de levadura
1.5 % agar
0.5% NaCl
Agua destilada
pH casi neutro (6.8) a 25 C.

Para hongos.
Agar Papa Dextrosa:
Es utilizado para el cultivo de hongos. Este producto est conforme a los
Requerimientos Armonizados de las Farmacopeas USP/EP/JP.
El Agar Papa Dextrosa est compuesto por Infusin de Papa
 deshidratada y Dextrosa que fomentan el crecimiento exuberante de los
hongos. El agar es adicionado como agente solidificante. Muchos
procedimientos estndares usan una cantidad especfica de cido
tartrico estril (10%) para reducir el pH de este medio a 3,5 0.1, y as
inhibir el crecimiento bacteriano. No recalentar el medio acidificado, el
calentamiento en estado cido hidrolizar el agar.
Infusin de Papa (Potato Infusion) a partir
de 200 g...........................................4 g*
Dextrosa (Dextrose).................... 20 g
Agar............................................ 15 g
*4,0 g de extracto de papa es equivalente
a 200 g de infusin de papas.
pH Final: 5,6 0,2 a 25C
La frmula puede ser ajustada y/o
suplementada de acuerdo a los
requerimientos para cumplir con las especificaciones de rendimiento o
desempeo.
2. Cultivos de clulas animales.
a) Clulas animales.- Las clulas animales no tienen una pared
celular (en el exterior de la clula), son hetertrofas porque son
incapaces de sintetizar su propio alimento, incorporando los
nutrientes de los alimentos que poseen otros seres vivos, ya que
no poseen cloroplastos con clorofila para la fotosntesis. Adems
presentan Lisosomas funcionales para la digestin intra (dentro) y
extracelular (fuera de le clula) (endocitosis y exocitosis).

b) Medios de crecimiento.- Las clulas animales pueden ser

cultivadas utilizando un medio completamente natural o
artificial/sinttico junto con algunos productos naturales.
 El suero fetal bovino es el suplemento mas comn en los medios
de cultivo de clulas animales. Se utiliza como un complemento de
bajo costo para proveer un medio de cultivo ptimo. El suero
provee portadores o quelantes de nutrientes lbiles o insolubles en
agua, hormonas y factores de crecimiento, inhibidores de
proteasas, y se une y neutraliza sustancias txicas.
c) Anticuerpos monoclonales.- Un anticuerpo monoclonal es un
anticuerpo homogneo producido por una clula hbrida producto
de la fusin de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y
nica clula madre y una clula plasmtica tumoral.
Son anticuerpos idnticos porque son producidos por un solo tipo
de clula del sistema inmune, es decir, todos los clones proceden
de una sola clula madre. Es posible producir anticuerpos
monoclonales que se unan especficamente con cualquier
molcula con carcter antignico. Este fenmeno es de gran
utilidad en bioqumica, biologa molecular y medicina.
3. Cultivos de clulas vegetales.
a) Clulas vegetales.- La clula vegetal tiene una pared celular de
celulosa, que hace que tenga rigidez. Adems estas clulas tienen
los cloroplastos, con clorofila, que son los que gracias a ellos
realizan la fotosntesis y por eso son auttrofas (son capaces de
realizar su propio alimento).

b) Tipos de cultivo de tejidos vegetales.

Cultivo de rganos: En este tipo de cultivo la organizacin
tridimensional del rgano in vivo se mantiene, aunque slo sea
parcialmente, y mantiene todas o algunas de las caractersticas
histolgicas del tejido original. El rgano o porcin del mismo se
mantiene en un medio lquido del que extrae los nutrientes y al que
elimina los desechos metablicos. Los diferentes tipos de clulas se
mantienen en su forma diferenciada y constituye una buena rplica del
rgano original. Pero, sin embargo, generalmente no permite la
propagacin, ya que el crecimiento de clulas se produce nicamente
en la periferia. Normalmente este tipo de cultivo es difcil de mantener
durante un tiempo prolongado debido a las diferencias potenciales de
crecimiento de los distintos tipos celulares que constituyen el rgano.
La falta de propagacin tiene como consecuencia que para repetir el
experimento se necesite nuevo material, por lo que se produce cierta
heterogeneidad de muestras.
Explantes primarios: Constituidos por fragmentos pequeos de
tejidos u rganos que se adhieren a una superficie en la que
generalmente crecen las clulas ms perifricas del explante. Un
cultivo se denomina cultivo primario cuando las clulas o tejidos
procedentes de un ser vivo crecen sin haber pasado previamente por
una fase de crecimiento in vitro. Un cultivo se denomina cultivo
secundario cuando procede de una fase previa de crecimiento in vitro.
Cultivo de clulas: Este tipo de cultivo est formado por clulas
dispersas disgregadas de un tejido vivo, de un cultivo primario, o de
una lnea celular, mediante distintos sistemas mecnicos, qumicos o
enzimticos. Las clulas crecen en suspensin o adheridas a una
superficie. Generalmente son cultivos que contienen un nico tipo de
clula y stas suelen ser homogneas genticamente. Es el tipo de
cultivo ms utilizado en la actualidad debido a su capacidad de
propagacin, es decir de crecimiento mantenido.
c) Medios de cultivo.- Antes de realizar la asepsia del material
vegetal que se va a introducir in vitro, es necesario disponer de
Medios de Cultivo esterilizados y dosificados en recipientes
adecuados. Una parte importante del cultivo in vitro son los Medios
de Cultivo ya que en ellos se encuentran las sustancias necesarias
para el crecimiento y desarrollo de los tejidos vegetales. Un medio
de cultivo es una solucin acuosa en donde se encuentran
disueltas sales minerales que aportan los elementos esenciales
Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn,
Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de
carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad
fotosinttica de los tejido in vitro. Adems, el medio puede ser
enriquecido con Aminocidos, Vitaminas y Reguladores del
Crecimiento.
Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones
concentradas 10 o 100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la
solucin madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre
que no se produzcan problemas de precipitacin. Algunos
elementos, como el Fe, se utilizan en forma de quelatos para
mantener su disponibilidad durante el cultivo.
Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma lquida o con un
agente gelificante como el agar.
Medio de cultivo de murashige y skoog.
El Medio de Cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) se realiza con
las siguientes sustancias:
 d) Produccin de metabolitos secundarios.- la produccin de
metabolitos secundarios de plantas mediante el uso del cultivo in
vitro. Son notables las tcnicas de cultivo empleadas as como las
estrategias relacionadas con el empleo de biorreactores, procesos
de elicitacin y la ingeniera metablica como las ms promisorias
para la produccin de metabolitos secundarios de alto valor en la
industria. En esta resea se ponen en evidencia estos aspectos as
como las perspectivas futuras de la produccin de metabolitos
secundarios in vitro.
Las ventajas que a priori presentaba la produccin de metabolitos
secundarios mediante cultivo de tejidos, como por ejemplo la
obtencin de productos de mayor pureza, la conversin de
sustancias precursoras baratas en compuestos de alto precio
(biotransformacin) actuando los cultivos celulares como
catalizadores de las reacciones implicadas en dicha transformacin
(Alfermann y Reinhard, 1980; Berlin, 1984), o la obtencin de
nuevos compuestos, tropezaron con problemas como la baja
concentracin del metabolito en los cultivos celulares,y problemas
de tipo tcnico en los sistemas de biorreactores utilizados en el
cultivo del material vegetal, como la necesidad de la planta
completa para una correcta sntesis de los compuestos, ya que
esta sntesis slo se realiza en estructuras especializadas de la
planta y a nivel celular la sntesis es incompleta o muy reducida.
Otras limitaciones de este sistema son puramente tcnicas:
dificultades en los procesos de manejo y cultivo del material
vegetal, en la extraccin y purificacin de los productos finales
obtenidos, la falta de conocimientos sobre los inductores y los
mecanismos genticos y bioqumicos implicados en la regulacin y
control de este metabolismo secundario.
En la actualidad slo unos pocos metabolitos secundarios
(shikoninas, cido rosmarnico, ...) se utilizan de forma industrial,
aunque el caudal de conocimientos adquiridos sobre estas
metodologas ha alcanzado un elevado nivel, y muchos de los
problemas planteados en las primeras pocas de aplicacin
industrial han sido resueltos con xito, lo que sin duda permitir
nuevos avances.
4. Medicin del crecimiento celular.
a) Medicin del nmero de clulas.- El nmero de clulas de una
suspensin puede determinarse microscpicamente contando las
clulas que hay en un pequeo volumen medido con exactitud.
Tal operacin se lleva acabo habitualmente en unos portaobjetos
especiales denominados cmaras de recuento, estas cmaras van
marcados con cuadros de reas conocidas y admiten una fina capa
de lquido de profundidad conocida entre el portaobjetos y el
cubreobjetos, ello permite conocer exactamente el volumen de
lquido correspondiente a cada cuadrado de la cmara, el computo
directo se denomina recuento total.
 b) Medicin de la masa de clulas.- La nica manera directa de
medir la masa celular es determinando el peso seco del material
celular en un volumen fijo del cultivo. Para ello hay que separar las
clulas del medio, secarlas y pesarlas. Tal determinacin requiere
mucho tiempo y es relativamente poco sensible, con equipamiento
ordinario es difcil pesar con exactitud menos de 1mg, y sin
embargo este peso seco puede suponer el equivalente a unos
5000 millones de bacterias.
Un mtodo optimo que consiste en medir la cantidad de luz
difractada por una suspensin d clulas, cuando un as luminoso
pasa a travs de una suspensin celular la reduccin de la cantidad
de luz transmitida a consecuencia de la difraccin es pues una
medida de la masa celular presente.
c) Mtodos indirectos.
Recuento de colonias en placa
Recuento sobre filtro de membrana
Consumo de oxgeno
Liberacin de dixido de carbono
Concentracin de un enzima constitutivo
Decoloracin de un colorante
Incorporacin de precursores radiactivos
Medida de la turbidez
5. Inmovilizacin celular.
El empleo de clulas enteras inmovilizadas presenta una serie de ventajas
frente a las enzimas aisladas:
Se evita los procesos de aislamiento y purificacin enzimtica.
Las enzimas de inters se hallan en su ambiente celular natural con lo que
aumenta su estabilidad y consecuentemente la vida til del sistema
permitiendo la reutilizacin del material cataltico.
El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores, coenzimas y
dems compuestos necesarios para asegurar una ptima actividad, adems
de brindar buenas condiciones de temperatura y pH.
Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones
multienzimticas.
Condiciones bsicas que debe reunir un mtodo
Sencillez de preparacin
Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de preparacin
Bajo costo
Alta resistencia mecnica
Baja o nula interferencia en los procesos de purificacin de productos
Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos de produccin y/o
biotransformacin.