Biodegradacin de

Petrleo Diesel

Autor: Rmulo Aycachi Inga

Docente: MSc. Carmen Rosa Carreo Farfn
Facultad de Ciencias Biolgicas
Departamento de Microbiologa y Parasitologa
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo
Lambayeque, 04 de abril del 2008.

I. Introduccin:
La industria petroqumica es importante en una sociedad moderna, no obstante la falta de
un programa de proteccin ambiental, hace que el medio ambiente se contamine al
producirse derrames de petrleo, principalmente de crudo, por un deterioro de los
oleoductos, descargas de efluentes contaminados, afloramientos naturales a travs de
fisuras de la corteza terrestre y debido a la produccin, transporte y almacenamiento de este
recurso natural.
A nivel mundial, el volumen de derrame de petrleo es de 1.7 a 8.8 millones de toneladas
mtricas por ao y en nuestra regin (Pacfico Sudeste) es de 6000 toneladas mtricas al
ao. En el Per se registran derrames de petrleo desde 1978, uno de ellos fue el producido
en el oleoducto marino de Talara, estando entre los ltimos el ocurrido el ao 2000 en el ro
Maran que afect la Reserva Pacaya-Samiria y el producido el 30 de enero del 2008 en el
que, debido a una explosin producida en un barco carguero, se derramaron frente al mar
de Tumbes 1300 barriles de crudo de petrleo. Pero no slo derrames mayores causan
contaminacin sino tambin los constantes derrames accidentales en suelos de nuestra
selva, los que se producen por el rompimiento del Oleoducto Nor-Peruano, debido a
accidentes naturales y por la actividad extractiva. Los mares del planeta sufren cada ao
millones de pequeos derrames contaminantes procedentes de barcos, refineras costeras y
plataformas petrolferas. Un estudio de la Universidad Politcnica de Catalua advierte de
que el impacto ambiental de los pequeos vertidos diarios es mucho mayor que el
ocasionado por un gran accidente y han lanzado una seria advertencia sobre el enorme
impacto ambiental que provocan los pequeos vertidos de petrleo -desde un litro a unas 80
toneladas- por su excesiva frecuencia.
Los dispersantes qumicos utilizados para favorecer la remediacin de los ambientes
contaminados pueden causar un mayor impacto ecolgico que el mismo derrame, por su
toxicidad y recalcitrancia a la biodegradacin. Por tanto, una mejor alternativa de solucin es
el proceso de biorremediacin, que es el tratamiento biolgico del suelo, aire y agua,
mediante la biodegradacin de compuestos txicos para transformarlos en compuestos de
menor o ningn impacto ambiental. As en la biodegradacin de hidrocarburos, se utilizan
bacterias con alta capacidad degradativa, entre estas:
Brevibacterium, Spirillum, Xanthomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Nocardia,
Flavobacterium, Vibrio, Achromobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Pseudomonas
aeruginosa, Serratia rubidae, Bacillus sp., Pseudomonas mendocina, Pseudomonas
aureofasciens, etc., las cuales disminuyen la concentracin de hidrocarburos presentes
en el ambiente y al mismo tiempo son inocuas para la salud y el medio ambiente. Estas
bacterias producen bioemulsificantes y biosurfactantes que disminuyen la tensin superficial
entre el petrleo y el medio acuoso facilitando el acceso microbiano a la fuente de carbono
insoluble para su degradacin.

II. Generalidades:
a. El crudo de petrleo:
El crudo de petrleo se caracteriza por ser un lquido negro, viscoso y con una composicin
qumica sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, bsicamente de la
familia de los hidrocarburos. Los hidrocarburos componen la familia predominante de
compuestos (un 50-98% de la composicin), por lo que constituyen uno de los grupos de
contaminantes ambientales ms importantes, tanto por su abundancia, como por su
persistencia en distintos compartimentos ambientales. Mayoritariamente son alcanos de
cadena lineal (n-alcanos o nparafinas), alcanos ramificados (en menor cantidad),
cicloalcanos (o naftenos) y cantidades variables de hidrocarburos aromticos. La
composicin elemental de un crudo est condicionada por la predominancia de los
compuestos tipo hidrocarburo: 84-87% de C, 11-14% de H, de 0-8% de S, y de 0-4% de O y
N y metales como el nquel y el vanadio. Los principales componentes se subdividen y
purifican en distintas fracciones:i) fraccin saturada (n- alcanos, alcanos ramificados con
cadenas alqulicas y las cicloparafinas), ii) fraccin aromtica (monoaromticos, diaromticos
y hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs), iii) fraccin de resinas yiv) fraccin de
asfaltenos que son menos abundantes y consisten en compuestos ms polares, pudindose
encontrar hidrocarburos heterocclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso
molecular .
b. Refinado del crudo de petrleo:
Para comprender la naturaleza qumica de los diferentes derivados del petrleo que
potencialmente pueden ser contaminantes en el medio ambiente, hay que entender el
proceso de refinado del crudo utilizado para la obtencin de estos productos petrolferos.
El refinado pasa por un proceso de destilacin, con la finalidad de eliminar el color y
olor, as como tambin, los compuestos del azufre. Se destila a temperaturas crecientes
obteniendo 4 fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios (querosenos,
gasoil, aceites lubricantes) y un residuo. Este residuo se destila al vaco obtenindose otros
aceites lubricantes (ms pesados), ceras y parafinas y bitmenes asflticos (alquitranes).
Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fraccin asfaltnica
(altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios (gasoil, fueles,
querosenos y tambin las gasolinas) sean productos relativamente ms biodegradables que
los coques o alquitranes residuales. As pues, la composicin qumica de la gasolina es
diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido como productos de destilacin del
petrleo a partir de diferentes intervalos de temperatura (tabla 1.4). La obtencin de gasolina
es menos directa que la de los fueles y gasleos, ya que en una primera fase se obtiene por
destilacin del crudo entre 20-180 C. Esto implica una composicin den-alcanos ms ligera
(C6-C11) que los fueles y gasleos (C10-C25). En la gasolina encontramos como
componentes ms abundantes: n-butano, isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos,
hexano, BTEX, mono y dimetil hexanos, trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor
cantidad los naftalenos, sus mono y dimetilados y heptano (de menor ndice de octanaje).

Los fueles ligeros y el gasoil forman parte de la fraccin intermedia de destilacin en el

proceso de refinado, lo que implica un rango de puntos de ebullicin entre 185-345C,
encontrando compuestos de 10 a 25 tomos de carbono, siendo los ms abundantes los
C15-C17 (fig. 1.2). Su composicin es de un 30% en parafinas (n- alcanos e isoprenoides),
45% de naftenos (cicloalcanos) y un 25% de aromticos. En concreto a nivel de compuestos
aromticos encontramos alquilbencenos, y ms abundantemente, el naftaleno y sus
alquilados. Tambin se ha encontrado, en cantidades menores, el fenantreno y el fluoreno.
No contienen pireno ni fluoranteno (compuestos de 4 anillos aromticos), cuyos puntos de
ebullicin son ms elevados que el intervalo utilizado en la destilacin de fracciones
intermedias.
La elevada complejidad de la composicin del crudo de petrleo y derivados, implica
la existencia de una amplia capacidad enzimtica si se quiere conseguir una degradacin
significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con
cepas bacterianas individuales o con la combinacin de diferentes cepas aisladas.
En la mayora de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los alcanos
son los componentes ms abundantes del crudo de petrleo. No obstante en algunos casos,
estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alqulicas de ciertos
HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo. Recientemente, se han descrito
algunas cepas con la capacidad de degradar tanto HAPs de elevado peso molecular como
alcanos pero sta, no parece que sea una norma general. De hecho los degradadores de
alcanos citados habitualmente en la bibliografa generalmente no son capaces de romper el
anillo aromtico de los HAPs, mientras que los degradadores de HAPs generalmente no
crecen con alcanos.
 La alternativa a la utilizacin de cepas individuales es la obtencin y utilizacin de
cultivos mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos. Los
consorcios definidos se caracterizan por ser una combinacin de cepas aisladas con
capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre s. Los consorcios no
definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos directos de enriquecimiento a
partir de muestras ambientales con historia previa de contaminacin y por lo tanto no son el
resultado de una combinacin de cepas previamente aisladas.
d. Biosurfactantes
Se dice que un soluto es un agente tensioactivo o surfactante cuando da lugar a un
descenso significativo de la tensin superficial. El descenso de la tensin facilita la
eliminacin de las partculas de la suciedad de las superficies slidas. Son molculas que
contienen un segmento liposoluble (soluble en aceite) y otro hidrosoluble (soluble en agua o
disolventes polares). La solubilidad parcial tanto en agua como en aceite permite al
surfactante ocupar la interfase. As pues, reducen la tensin superficial y las tensiones
interfaciales entre molculas individuales en la superficie y la interfase, respectivamente.
Tienen propiedades emulsionantes.
Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sera una molcula biolgica (orgnica)
con propiedades surfactantes o tensioactivas producidas sobre superficies vivas,
mayormente superficies de clulas microbianas, o excretados al medio extracelular.
Con excepcin del poder bactericida de ciertos surfactantes,
fenmeno del cual no hay una explicacin absolutamente segura, se puede
decir que todas las propiedades y usos de los surfactantes provienen de
dos propiedades fundamentales de estas sustancias: su capacidad de
adsorberse a las interfases y de otra parte su tendencia a asociarse para
formar estructuras organizadas

Clasificacin de los biosurfactantes.

Los surfactantes microbianos son molculas complejas que cubren un amplio rango
de estructuras qumicas incluyendo pptidos, cidos grasos, fosfolpidos, glicolpidos,
antibiticos, lipopptidos, etc. Los microorganismos tambin producen en algunos casos,
surfactantes que son combinaciones de muchas estructuras qumicas como los surfactantes
microbianos polimricos. Muchos surfactantes microbianos han sido purificados y sus
estructuras qumicas son conocidas. Mientras que los de alto peso molecular son
generalmente heteropolisacridos polianinicos que contienen tanto polisacridos como
protenas, los de bajo peso molecular suelen ser glicolpidos.
Podemos clasificar los biosurfactantes atendiendo a tres criterios: naturaleza qumica,
peso molecular y carga inica de la parte superficialmente activa de la molcula.
1. Naturaleza qumica
a) Lpidos
b) Hidratos de carbono
c) Aminocidos
d) Glucolpidos
e) Lipopptidos
2. Peso molecular
a) Bajo peso molecular: Suelen ser glicolpidos. El ms estudiado es el rhamnolpido,
producido por diversas especies como Pseudomonas. La funcin principal de estos
biosurfactantes es reducir la tensin superficial entre fases (agua-roca por ejemplo).
b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacridos, protenas, lipoprotenas,
lipopolisacridos o mezclas de estos polmeros. Estos biosurfactantes no son tan eficaces
en cuanto a la reduccin de la tensin superficial entre fases, pero si son buenos
emulsionantes. Adems se ha demostrado que son muy eficaces a bajas concentraciones y
poseen una considerable afinidad por el sustrato. Un ejemplo sera Alasan producido por
Acinetobacter radioresistens.
3. Carga inica
a) Agentes aninicos: Contiene generalmente uno de cuatro grupos polares solubles-
carboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con una cadena hidrocarbonada
hidrfoba. Si esa cadena es corta son muy hidrosolubles y en el caso contrario tendrn baja
hidrosolubilidad y actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Se usan
principalmente en la industria de jabones y detergentes.
b) Agentes catinicos: Estn compuestos por una molcula lipoflica y otra hidroflica,
consistente de uno o varios grupos amonio terciarios o cuaternarios. Son utilizados
comnmente en detergentes, agentes limpiadores, lquido de lavaplatos, tratamiento de
textiles, como sustancias activas antimicrobianas y en cosmtica.
c) Agentes no inicos: No se disocian en iones hidratados en medio acuoso. Las
propiedades hidroflicas son provistas por hidratacin de grupos amido, amino, ter o
hidroxilo.
d) Otros tipos de surfactantes: La combinacin en la misma molcula de un grupo con
tendencia aninica y de un grupo con tendencia catinica produce un surfactante anfotrico,
como por ejemplo los aminocidos, las betainas o los fosfolpidos. Segn el pH del medio
una de las dos disociaciones prevalece. Este tipo de surfactante se usa slo en casos
particulares debido a su alto costo.
Utilizacin de los Biosurfactantes
Los contaminantes hidrofbicos presentes en los hidrocarburos del petrleo, suelos y
aguas del medio ambiente requieren su solubilizacin antes de ser degradados por la clula
microbiana.
La mineralizacin est gobernada por la desorcin de los hidrocarburos del suelo. Los
surfactantes pueden aumentar el rea de los materiales hidrofbicos, como pesticidas en
suelos y agua del medio, aumentndose as su solubilidad en agua. Por tanto, la presencia
de biosurfactantes puede aumentar la degradacin microbiana de los contaminantes.
Se le ha dado una atencin considerable a la produccin de molculas tensioactivas
de origen biolgico por sus aplicaciones en el procesado de alimentos, aromatizacin de
bebidas alcohlicas, reciclaje de papel, fabricacin de pulpa de papel,

en farmacologa, y la industria del aceite. En relacin a esa ltima aplicacin, los accidentes
que llevan a vertidos de aceite han llegado a ser numerosos y han causado catstrofes tanto
sociales como ecolgicas. La habilidad de los biosurfactantes para emulsionar hidrocarburos
mezclados con agua ha sido ampliamente divulgada. Estas propiedades emulsionantes
tambin se ha demostrado que favorecen la degradacin de los hidrocarburos en el medio
ambiente, por tanto los hacen muy tiles para el control de la contaminacin por vertidos de
aceites.
En la biorremediacin en vertidos de petrleo, estudios recientes han mostrado que se
puede utilizar el poder solubilizante de las micelas para extraer ciertas sustancias
contaminantes an cuando su concentracin sea extremadamente baja.
Las funciones que haran estos biosurfactantes a la hora de aumentar la biodisponibilidad
seran:
- Dispersar el petrleo aumentando la superficie de contacto.
- Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofbicos. Seran en este caso sobre todo
los de bajo peso molecular.
- Poseen tambin funciones evolutivas para los propios microorganismos. Pueden ayudar a
los microorganismos productores a desprenderse de las gotas de petrleo una vez se ha
agotado la fuente de hidrocarburo que utilizaba. Hay que tener en cuenta que un
microorganismos suele utilizar un solo tipo de hidrocarburo entre la mezcla que existe. Por
eso les sera til poderse desprender de estas interacciones hidrofbicas que mantiene la
membrana con la gota de petrleo, para as ir en busca de nuevas fuentes de carbono.
Adems deja una microcpsula alrededor de la gota para marcarla como usada,
favoreciendo as a toda la poblacin.
Una propiedad de los biosurfactantes curiosa es su actividad bactericida. Dicha actividad se
debe a su capacidad detergente.
Surfactantes Microbianos
El inters por los surfactantes microbianos ha estado en aumento en
los ltimos aos debido a sus diversas caractersticas deseables tales
como una efectiva selectividad, respetuosos para la naturaleza, su
estabilidad a elevadas temperaturas, a pH y concentracin de sales. Hay
que aadir que los biosurfactantes han aumentado la versatilidad en
comparacin a muchos surfactantes sintticos y tienen la ventaja de
poder producirse por fermentacin.
Hay clulas microbianas intactas con una superficie celular
altamente hidrofbica que son ellas mismas surfactantes. En algunos
casos, los propios surfactantes juegan un papel natural en el crecimiento
de las clulas microbianas sobre sustratos insolubles en agua. Los
surfactantes extracelulares estn implicados en la adhesin celular, emulsin, dispersin,
floculacin, agregacin celular y fenmenos de desorcin. Aunque el tipo y cantidad de
surfactante microbiana producido depende primeramente del organismo productor, factores
como el carbono y el nitrgeno, elementos traza, temperatura, y aireacin, tambin afectan a
su produccin por el organismo.
Existen varios biosurfactantes producidos por bacterias, entre ellos tenemos:
Algunos ejemplos de bacterias y la produccin de biosurfactantes:
1. Bacillus pumilus (estirpe 28-11) produce biosurfactantes con una gran capacidad de
emulsionar y eliminar compuestos hidrocarbonatos. Esto hace que se considere esta estirpe
como prometedora en el campo de la tecnologa medio ambiental.
2. Candida ishiwade (Tailandia) es una levadura termotolerante que produce
monoacilglicerolesy glicolpidos.
3. Pseudomonas sp. Pueden reducir la tensin superficial, estabilizar emulsiones, y
promover la formacin de espumas y generalmente son no txicos, no peligrosos y
biodegradables. Debido a su diversidad, inocuidad para el medio ambiente, posibilidad de
produccin a gran escala, selectividad, efectividad bajo condiciones extremas en pequeas
cantidades, produccin sobre recursos renovables, y sus aplicaciones potenciales para la
proteccin del medio ambiente, los biosurfactantes han ganado importancia frente a los
surfactantes qumicos. Hay que aadir el valor del carbohidrato presente, la ramnosa de los
ramnolpidos biosurfactantes, es usada para el transporte de drogas insolubles en humanos
y acta como precursor de componentes de saborizantes de alta calidad. Los
biosurfactantes potencian la emulsin de hidrocarburos y por eso tienen el poder de
solubilizar contaminantes hidrocarbonados y aumentar su disponibilidad para la degradacin
microbiolgica.
As los microorganismos productores de biosurfactantes pueden jugar un importante
papel en la biorremediacin acelerada de lugares contaminados con hidrocarburos. Debido
al alto costo de los procesos de remediacin y otras aplicaciones potenciales, la necesidad
de aumentar la produccin de biosurfactantes es determinada por la gentica del
microorganismo, otros factores tales como las condiciones ambientales y la naturaleza del
sustrato tambin influyen en el nivel de expresin. As, la optimizacin de esas condiciones
puede llevar a una produccin elevada y segura de biosurfactantes. Existen estudios para el
desarrollo de mtodos econmicos para aumentar la produccin usando materias primas de
bajo costo.
4. Pseudomonas aeruginosa LBI es un ejemplo claro de estructura qumica, propiedades
superficiales y actividad biolgica en la produccin de biosurfactantes. La naturaleza
qumica de los biosurfactantes producidos sera en este caso ramnolpidica, cuya estructura
de ramnosa contiene propiedades biosurfactantes.
5. Pseudomona putida PCL1445 produce biosurfactantes interesantes a nivel industrial. En
este caso se caracterizo doslipopptidos con actividad biosurfactante: putisolvin I y putisolvin
II; los cuales inhiben la formacin de biopelculas o provoca la destruccin de las mismas.
Esta estirpe PCL1445 fue aislada de la raz de una planta, crecida en una zona contaminada
con PAHs (hidrocarburos aromticos policclicos). Se vi que la estirpe PCL1445 produce
actividad biosurfactante hasta el final de la fase de crecimiento.
Teniendo en cuenta el uso potencial de los tensioactivos en las tecnologas de
biorremediacin, la utilizacin de los biotensioactivos parece tener ms potencial que los
tensioactivos de sntesis (qumicos), debido a la mayor diversidad estructural,
biodegradabilidad y biocompatibilidad de los biotensioactivos. Los biotensioactivos ms
estudiados han sido los emulsionados de Acinetobacter sp. y el grupo de ramnolpidos
producidos por Pseudomonas aeruginosa.
e. Ventajas y limitaciones de los procesos de biorremediacin de suelos contaminados.
Entre las distintas tecnologas disponibles para la descontaminacin de un suelo, es
importante diferenciar aqullas que suponen una solucin temporal o el posible traslado del
contaminante a otros compartimentos ambientales de aqullas que potencialmente pueden
transformar los contaminantes en productos inocuos. La tecnologa de la biorremediacin,
basada en la utilizacin de los microorganismos y su potencial metablico biodegradador
para eliminar o transformar los contaminantes del medio en productos inocuos, tiene ciertas
ventajas respecto a los mtodos fisicoqumicos (excavacin, extraccin qumica y
incineracin) tanto por su menor coste econmico, como por la no afectacin de otros
compartimentos ambientales y la optimizacin de los recursos.
Los costes de las tcnicas biolgicas (bioventing, biopila, landfarming y plantas de
tratamiento biolgico) son mucho ms rentables econmicamente que las tcnicas
fisicoqumicas. Una consecuencia de ello es que en Alemania, por ejemplo, en 1998,
aproximadamente de las 2,2 MTm de suelo que fueron tratadas en las 109 plantas de
tratamiento que dispone, un 60% fueron tratadas de forma biolgica. Si tenemos en
consideracin que cada planta de tratamiento de suelos, tiene una capacidad de 4 x 105 Tm
x ao-1, se podra llegar a tratar una cantidad de suelo 10 veces superior que la procesada
en 1998.
Una de las limitaciones que presentan las tcnicas biolgicas respecto a las tcnicas
fisicoqumicas es el tiempo necesario para alcanzar una biodegradacin aceptable segn las
normativas. Durante un proceso de biorremediacin se produce una ralentizacin del
proceso de biodegradacin ya sea por un enriquecimiento de componentes ms
recalcitrantes o por una disminucin de la biodisponibilidad de los contaminantes. Sin
embargo, las tcnicas fisicoqumicas, an pudiendo ser ms rpidas y efectivas en la
disminucin de la concentracin de contaminantes, alteran o eliminan por completo la
microbiota autctona del suelo, modifican las caractersticas fisicoqumicas del suelo, y
adems, no eliminan los contaminantes, si no que los trasladan a otro compartimiento
ambiental. Por lo tanto no cumplen con los criterios de sostenibilidad en los que se debera
basar la ley de proteccin de suelos.
Factores que condicionan la biorremediacin de un suelo.
La biodegradabilidad de una mezcla de hidrocarburos presente en un suelo
contaminado depende de diversos factores como son: la presencia de una poblacin
microbiana degradadora potencialmente activa, la estructura molecular del contaminante, su
concentracin y biodisponibilidad, y factores ambientales como el pH, temperatura,
humedad del suelo, presencia de aceptores de electrones disponibles, y la existencia de
nutrientes inorgnicos (fuente de N y P) disponibles.
El pH, temperatura y la humedad
Cada cepa microbiana tiene un determinado rango de tolerancia a factores
ambientales como son: la temperatura, el pH y la salinidad, los cuales pueden afectar al
crecimiento y actividad de las poblaciones microbianas. En consecuencia, cuanto mayor sea
la diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor ser el rango de
tolerancia. No existen unas condiciones preestablecidas que sean ptimas en todos los
casos, pero en trminos generales a pH y temperaturas extremas y en suelos salinos la
biodegradacin se ralentiza, siendo los rangos ptimos para la biodegradacin: pH entre 6-
8 y temperaturas entre 20-30C.
La variacin del pH del suelo afecta a la actividad microbiana y tambin a la
solubilizacin y adsorcin/absorcin de los contaminantes y de los iones. Las formas
catinicas (NH4+, Mg2+, Ca2+) son ms solubles a pH cido mientras que las formas
aninicas (NO3-, NO2-, PO43- Cl-) son ms solubles a pH alcalino. En general, el pH ptimo
para las bacterias hetertrofas es neutro (pH 6-8), mientras que es ms cido para los
hongos (pH 4-5). El pH ptimo establecido para procesos de biodegradacin es neutro (pH
7,4-7,8).
La temperatura es uno de los factores ambientales ms importantes que afecta la
actividad metablica de los microorganismos y la tasa de biodegradacin. La mayor parte de
estudios realizados indican que las condiciones mesoflicas (20-30 C) son las ptimas para
la biorremediacin de suelos contaminados. No obstante, tambin se ha descrito
biodegradacin de hidrocarburos a temperaturas extremas: a 10 C en suelos subrticos y
subalpinos, 5C en suelos rticos y hasta 60C por una cepa termfila de Bacillus
stearothermophilus aislada de un suelo contaminado con crudo de petrleo del desierto
kuwait.
La humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradacin,
fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en el
contenido de agua. No obstante el nivel ptimo de humedad depende de las propiedades de
cada suelo, el tipo de contaminacin y si la biodegradacin es aerbica o anaerbica. Un
dficit de agua puede disminuir el transporte de nutrientes y de contaminantes, as como
tambin la migracin bacteriana a travs del suelo. El exceso de agua en un suelo desplaza
el aire residente en los poros del suelo, generndose con mayor facilidad condiciones
anaerbicas, al agotarse el oxgeno disuelto en agua.
Estructura qumica
De las distintas familias de hidrocarburos del petrleo, los n-alcanos y los alcanos
ramificados (isoprenoides) de cadena intermedia (C10-C20) son los sustratos ms
fcilmente degradables por los microorganismos del suelo, y que por lo tanto tienden a ser
eficazmente biodegradados. Sin embargo, los alcanos de cadena larga (>C20) son ms
difciles de degradar debido a su (elevado peso molecular) y su baja solubilidad en agua.
Los cicloalcanos, por norma general, se degradan ms lentamente que los n- alcanos y
alcanos ramificados. Asimismo, los HAPs que contienen de 2 a 3 anillos aromticos pueden
ser biodegradados eficazmente en el suelo en condiciones ambientales ptimas, mientras
que los HAP de 4 anillos, y especialmente, los de 5 o ms anillos bencnicos presentan una
mayor recalcitrancia inherente y una baja solubilidad. Las fracciones de resinas y asfaltenos
son las que presentan una menor degradabilidad debido a las complejas estructuras
qumicas y al elevado peso molecular de sus molculas.
Biodisponibilidad
La tasa de degradacin depende tanto de la capacidad de transporte y del
metabolismo microbiano, como de la transferencia de masas del compuesto. La relacin
entre estos factores se conoce como biodisponibilidad. En los suelos uno de los factores
limitantes para la biodegradacin es la transferencia de masas, ya que los microorganismos
de los suelos contaminados, suelen tener amplias capacidades biodegradativas al estar
expuestos a una gran variedad de compuestos orgnicos diferentes. Por lo tanto la
adsorcin, la absorcin, desadsorcin, disolucin y la difusin son fenmenos, propios de la
transferencia de masas, que condicionan la biodisponibilidad de los contaminantes. Un
fenmeno que afecta de forma negativa a la biodisponibilidad de los contaminantes es el
envejecimiento o ageing que se define como la prdida de la biodegradabilidad de los
compuestos a lo largo del tiempo en el suelo (aunque la poblacin microbiana mantenga
intacto su potencial catablico), el cual es ms importante en suelos con elevado contenido
en materia orgnica. Este efecto se produce por una serie de fenmenos como son: la
adsorcin con la materia particulada del suelo, absorcin a la materia orgnica del suelo, a
la baja difusividad de los compuestos, principalmente desde los microporos; a la disolucin
en fases lquidas no acuosas (FLNAs), o a la formacin de uniones covalentes con la
materia orgnica e inorgnica del suelo. Con la finalidad de aumentar la biodisponibilidad de
los contaminantes existen numerosos ejemplos en la bibliografa de la utilizacin de
tensioactivos sintticos y biotensioactivos en la biorremediacin de suelos contaminados por
hidrocarburos.
Presencia de aceptores de electrones
 La mayor parte de hidrocarburos presentes en los productos petrolferos son
degradados con mayor extensin y rapidez de forma aerbica (O2 como aceptor final de
electrones), ya que en ausencia de O2, y en presencia de aceptores de electrones
alternativos (NO3-, SO42-, CO2, Mn4+ y Fe3+) los hidrocarburos pueden ser degradados,
pero con unas tasas de biodegradacin muy inferiores a las aerbicas.
Nutrientes inorgnicos.
Las concentraciones de nitrgeno y fsforo asimilables presentes en el suelo, suelen
ser limitantes para un incremento y activacin de la poblacin microbiana, mientras que
otros nutrientes esenciales como el Ca2+, Na+, Fe2+ y SO42- ya estn presentes en
cantidades suficientes en el suelo.
La adicin de fuentes de N y P inorgnicas, generalmente tiene un efecto positivo
incrementando las poblaciones microbianas y las tasas de biodegradacin de hidrocarburos
en suelos contaminados. Las proporciones molares de C:N:P, descritas en la bibliografa,
respecto al contenido de carbono a degradar son muy distintas. La Agencia de Proteccin
Ambiental de USA recomienda utilizar proporciones C:N de 100:10 a 1000:10 para la
biodegradacin de suelos contaminados por hidrocarburos, y dentro de este intervalo se han
descrito proporciones C:N de 600:10, 500:10 y de 100:10:1 a 300:10:1 respecto al Carbono
Orgnico Total a degradar. Aunque en general la adicin de fuentes inorgnicas de N y P al
suelo es beneficiosa para los procesos de biodegradacin, existen estudios que han descrito
efectos inhibitorios en la adicin de nutrientes inorgnicos.
Adems es importante destacar que la accin de los nutrientes inorgnicos puede
estar limitada debido a la interaccin qumica con los minerales del suelo (el amonio se
puede unir a las arcillas por intercambio catinico y el fosfato puede unirse y precipitar con
iones calcio, hierro y aluminio).
f. Microorganismos reportados como degradadores de Petrleo:
- Todos los ecosistemas acuticos y marinos contienen algn tipo de
microorganismos degradadores de petrleo, entre los gneros reportados estn:
- Bacterias:
o Achrornobacter o Acinetobacter o Actinomyces o Alcaligenes
o Arthrobacter o Bacillus o Beneckea o Brevebacterium
o Coryneformes o Erwinia o Flavobacteriumo Klebsiella
o Lactobacillus o Leumthrix o Moraxella o Nocardia
o Peptococcuso Pseudomonas o Sarcina o Spherotilus
o Spirillumo Streptomyces o Vibrio o Xanthomyces
- Hongos:
o Allescheriao Aspergillus o Aureobasidiumo Botrytis
o Candida o Cephalosporiumo Cladosporiumo Cunninghamella
o Debaromyceso Fusarium o Gonytrichum o Hansenula
o Helmintrosporium o Mucor o Oidiodendrum o Paecylomyses
o Phialophora o Penicillium o Rhodosporidium o Rhodotorula
oSaccharomyces oSaccharomycopisis oScopulariopsis oSporobolomyces
oTorulopsis oTrichoderma oTrichosporon
- Tambin se ha reportado la utilizacin de dos especies de camarones en la biodegradacin
del petrleo, siendo estos Peanus duorarum y Peanus aztecuz cuya capacidad de degradar
los hidrocarburos casi en su totalidad van desde los compuestos de 12 carbonos hasta los
compuestos de 22 carbonos.
- La cantidad y diversidad de los microorganismos degradadores de petrleo depende de la
exposicin de las aguas a estos hidrocarburos.
- La velocidad de degradacin de los compuestos presentes en el petrleo es como sigue:
HC saturados > aromticos ligeros > aromticos de alto PM > asfaltenos, resinas
III.
Objetivos:
- Aislar bacterias degradadoras de de Petrleo Diesel.
- Cuantificar la actividad degradativa del Petrleo Diesel de cada una de las bacterias
aisladas.
IV.
Materiales y mtodos:
Materiales:
o Muestra: 100 g de suelo de servicentro contaminado con Petrleo Diesel.
o Medios: Agar Bushnell Hass, Agar Tripticasa Soya, Petrleo Diesel.
o Frascos estriles.
Tubos de dilucin
o Tubos medianos
o Placas de Petri
o Gradillas
o Mechero Bunsen
o Asas bacteriolgicas
o Viales
o Pipetas
o Jeringas
o Biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift
Mtodo:
- Enriquecimiento de las muestras de suelo y adaptacin de los microorganismos a
concentraciones crecientes de petrleo.
- Disear y acondicionar dos biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift con flujo descendente
de 1 L de capacidad.
- Pesar 50 g de muestra de suelo previamente tamizada y llevarla hacia un biorreactor
conteniendo 100 ml de caldo Bushnell Hass (BH) con 1% de Petrleo Diesel.
- Incubar a 30 C durante 72 h.
- Tomar 10 ml de la muestra enriquecida y llevarla hacia el segundo biorreactor conteniendo
100 ml de caldo BH con 2% de Petrleo Diesel. Lavar y esterilizar el primer biorreactor.
- Incubar a 30 C durante 72 h.
- Tomar 10 ml de la muestra enriquecida y llevarla hacia el primer biorreactor
conteniendo 100 ml de caldo BH con 4% de Petrleo Diesel.
- Incubar a 30 C durante 72 h.
- Aislamiento de las bacterias degradadoras de Petrleo Diesel.
- A partir de la muestra enriquecida en caldo BH con 4% de Petrleo Diesel (PD) tomar una
alcuota y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre la surficie de placas
de Petri conteniendo Agar BH con 4% de PD.
- Incubar a 30 C durante 48 h.
- Seleccionar y repicar las cinco colonias que presenten la mayor biomasa y mayor rapidez
en el crecimiento hacia viales conteniendo Agar BH con 4% de PD y Agar Tripticasa Soya
(TSA).
- Incubar a 30 C durante 48 h.
- Conservar las cepas de bacterias biodegradadoras de PD en refrigeracin
- Cuantificacin de la actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas de
bacterias aisladas.
La actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas bacterianas aisladas ser
cuantificada a travs del tiempo requerido para la utilizacin del PD como fuente de carbono
y energa y del nmero de Unidades de Actividad Emulsificante (UAE) de cada una de ellas.
- Preparacin del inculo:
o Reactivar cada una de las cepas bacterianas degradadoras del PD en 5
mL de caldo nutritivo a 30 C durante 24 h.
o Centrifugar el caldo nutritivo a 3500 RPM durante 15 min; eliminar el sobrenadante y lavar
el sedimento con SSFE por dos veces.
o Con el paquete celular obtenido preparar una suspensin de clulas en SSFE y
estandarizarla con el tubo N 3 del Nefelmetro de McFarland (9x10 8 clulas/ml).
- Tiempo requerido para la utilizacin del PD como fuente de carbono y energa:
o De cada inculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 ml e inocular por triplicado
en tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo 10 ml de caldo BH con 0,2 ml de
resarzurina y 0,1 ml de PD (dejar un tubo con medio de cultivo no inoculado como testigo).
o Incubar a 30 C hasta por 5 das en agitacin constante (150 RPM).
o Observar diariamente en busca del cambio de coloracin del indicador resarzurina (azul a
rosado brillante) que ser interpretado como positivo para la utilizacin del PD como fuente
de carbono y energa.
- Cuantificacin de las Unidades de Actividad Emulsificante:
o De cada inculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 ml e inocular por triplicado
con tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo 10 ml de caldo extracto de levadura ms
0,2 ml de etanol. Dejar un tubo con medio de cultivo no inoculado como testigo.
o Incubar a 30 C durante 3 das en agitacin constante (150 RPM).
o Diariamente observar en busca de la informacin de burbujas y turbidez
del medio de cultivo.
o Centrifugar el contenido de cada uno de los tubos, a 2000 RPM durante
30 min.
o Tomar 1 ml de cada uno de los sobrenadantes y colocarlos en tubos de prueba
conteniendo 9 ml de caldo levadura etanol ms de 0,2 de PD. Tapar hermticamente los
tubos y agitarlos durante un min. Hasta lograr la emulsin.
o Calibrar a cero el espectrofotmetro con tubo blanco conteniendo caldo extracto de
levadura con etanol no inoculado (testigo) y leer la absorbancia de cada una de las muestras
a 540 nm.
o Realizar la conversin de la absorbancia de cada una de las muestras a UAE
considerando 0.816 de absorbancia como una Unidad de Actividad Emulsificante por ml (1
UAE/ml).
V.
Resultados:
- Tiempo requerido para la utilizacin del PD como fuente de carbono y energa:
CEPA DAS DE VIRAJE COLOR DE VIRAJE pH
Cepa 01 --- --- ---
Cepa 02 5 das Violeta 6.8
Cepa 03 12 das Amarillo 5.2
El indicador utilizado en este proceso de cuantificacin fue el prpura de bromocresol. Este
indicador se caracteriza por virar de acuerdo al pH, siendo amarillo a un pH menor o igual a
5.2 y violeta a un pH mayor o igual a 6.8.

En las figuras siguientes, en orden:

Inculos al 1 da
Inculos al 5 da
Inculos a 15 das
- Cuantificacin de las Unidades de Actividad Emulsificante:
CEPA UAE
Cepa 01 1.281
Cepa 02 1.353
Cepa 03 1.561
- Con el tubo blanco se lee la absorbancia a 540 nm. Luego los resultados
obtenidos se los divide entre 0.816 (1 UAE = 0.816).
- Identificacin de las cepas aisladas:

VI.
Referencias:
- LU CHAU, T. (2006). Biorremediacin. Dpto. de Ingeniera Qumica.
Universidad de Santiago de Compostela. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en
http://www.usc.es/uscmn/investigacion/documento/Prestige-
Biorremediaci%F3n.pdf
- VIAS C., M. Biorremediacin de suelos contaminados por hidrocarburos: caracterizacin
microbiolgica, qumica y ecotoxicolgica. Facultad de Biologa. Universidad de Barcelona.
Obtenido el 24 de marzo de 2008 en
http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0920105-
085623//TESIS_MVI%D1AS_CANALS.pdf
- ALTAMIRANO, M. G. (2005). Aislamiento e identificacin de bacterias hidrocarburolticas
provenientes de un suelo sometido a biorremediacin.
- ORTIZ, J. y J. RODRIGUEZ (2007). Biomarcadores y su utilidad en la evaluacin de la
biodegradacin del petrleo. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en
http ://ingenierosdeminas.org/do cu/docu mentos/bio marcador es_petrol
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- V. BOTELLO, A. (1974) Utilizacin y degradacin del petrleo crudo por dos especies de
camarn: Penaeus duorarum y Peneaus aztecas. Universidad Nacional Autnoma de
Mxico. Centro de Ciencias del Mar y Limnologa. Obtenido el 24 de marzo del 2008 en
http://biblioweb.dgsca.unam.mx/cienciasdelmar/centro/1975-
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- SULBARAN MORA, Miguel, BAHSAS, Ali, VELASQUEZ, William et al. Caracterizacin de
Biosurfactantes producidos por Pseudomonas Fluorescentes aisladas de emulsiones de
petrleo pesado.CIEN, jun. 2005, vol.13, no.2, p.228- 239. ISSN 1315-2076.
- PINEDO R., T. (2005) Biosurfactantes. Obtenido el 24 de marzo del 2008 en
http://www.personal.us.es/evpolo/pdf/trab_dirig/pinedorevilla_trigochorda.p
df

VII. Anexos
Tamizar