BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kesehatan masyarakat Indonesia saat ini sedang berada di garis merah,
buruknya kesehatan tersebut, juga di dukung oleh kondisi fasilitas kesehatan
yang memprihatinkan, kondisi kesehatan yang buruk dibuktikan dengan
beragam penyakit yang di derita oleh berbagai lapisan masyarakat.
Di musim pancaroba seperti ini, banyak sekali masyarakat menderita
penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme, sepert bakteri, virus, maupun
jamur. Pengobatannya biasanya diberikan antibiotik. Antibiotik diperlukan untuk
menghambat pertumbuhan mikroorganisme maupun dapat mematikan
mikroorganisme tersebut.
Untuk dapat mengetahui antibiotik yang cocok digunakan untuk mengobati
penyakit yang disebabkan oleh bakteri tertentu, perlu dilakukan penyuluhan
aktivitas antibakteri atau antimikroba. Oleh karena itu, dilakukan salah satu
metoda uji aktivitas antimikroba terhadap suatu bakteri yaitu metoda Kirby-
Bauer. Potensi suatu senyawa untuk membunuh bakteri atau yang dikenal
sebagai antimikroba dapat diujikan dengan metoda pengujian antimikroba yaitu
metoda Kirby-Bauer yang mudah dilakukan dan tidak memerlukan peralatan
yang khusus dan relatif murah.
Pada metoda Kirby-Bauer ini menggunakan ekstrak daging sebagai media
pertumbuhan bakteri. Bakteri yang digunakan yaitu bakteri E.coli dan bakteri
S.aureus.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana potensi suatu senyawa antibiotik dalam menghambat
pertumbuhan mikroba?
2. Apakah kelebihan media Mueller-Hinton sehingga digunakan sebagai
medium untuk percobaan ini?
3. Bagaimana melakukan pemindahan mikroba secara aseptik dengan
metoda spreading?
1.3 Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk :
1. Mampu membuat kultur cair bakteri untuk uji aktivitas antimikroba
2. Mampu melakukan pengujian aktivitas antimikroba dengan metoda
Kirby-Bauer
3. Melatih keterampilan bekerja secara aseptik

1.4 Manfaat
Manfaat dari praktikum ini sebagai berikut:
1. Dapat mengetahui metoda-metoda pengujian antimikroba
2. Dapat mengetahui seberapa besar potensi antibiotik yang digunakan
untuk membunuh mikroorganisme
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikroorganisme
Mikroorganisme merupakan salah satu makluk hidup yang dapat hidup pada
ekosistem maupun dalam tubuh makluk hidup lainnya. Mikroorganisme terdapat
beberapa yang menguntungkan bagi makluk hidup lainnya tetapi ada juga yang
dapat merugikan bagi makluk hidup lainnya. Menurut habitatnya mikrooganisme
ada yang hidup di udara, tanah, tubuh makluk hidup, dan ada juga yang hidup
di air. Sedangkan menurut kebutuhan oksigennya mikroorganisme ada yang
aerob (membutuhkan oksigen) maupun ada juga yang anaerob (tidak
membutuhkan oksigen) (Mik Hindersah, 2007).
Mikroorganisme yang disebut jamur bersifat heterotrof, dinding sel spora
mengandung kitin, tidak berplastid, tidak berfotosintesis, tidak bersifat fatogrof,
umumnya memiliki hifa yang berdinding yang dapat berinti banyak
(multinukleat), atau berinti tunggal (mononukleat), dan memperoleh nutrient
dengan cara absorpsi.
Bakteri merupakan uniseluler, pada umumnya tidak berklorofil, ada
beberapa yang fotosintetik dan produksi aseksualnya secara pembelahan dan
bakteri mempunyai ukuran sel kecil dimana setiap selnya hanya dapat dilihat
dengan bantuan mikroskop. Bakteri pada umumnya mempunyai ukuran sel 0,5
1,0 m kali 2,0-5,0 m, dan terdiri dari tiga bentuk dasar yaitu bentuk bulat atau
kokus, bentuk batang atau Bacillus, bentuk spiral (Dwidjoseputro,1985).

2.2 Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif

Bakteri Gram Positif Adalah bakteri yang mempertahankan zat warna kristal
violet sewaktu proses pewarnaan gram sehingga akan berwarna ungu di bawah
mikroskop, Perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding
sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan gram,
ditemukan oleh ilmuwan Denmark bernama Christian gram dan merupakan
prosedur penting dalam klasifikasi bakteri (Jawetz, 2005).
 Bakteri Gram Negatif merupakan bakteri yang tidak mampu
mempertahankan warna kristal violet pada dinding selnya saat perwarnaan
gram dilakukan, pewarnaan gram sangat penting untuk mengetahui klasifikasi
bakteri dan mengetahui identifikasinya (Radji, 2006).
E.coli merupakan bakteri gram negatif, bentuk batang, tidak bersepora,
memiliki flagel, ukuran kecil - sedang, konsistensinya halus, tepi rata,
menghasilkan tes positif terhadap indol dan menghasilkan gas dari glukosa,
E.coli mempunyai morfologi yang khas pada media pembeda seperti media
agar EMBA akan menunjukkan warna kemilau Metalic sheen dan tes indol
positif (Jawetz, 2005).
Sifat Perbedaan Relatif
SIFAT
Bakteri gram positif Bakteri gram negatif
Komposisi dinding Kandungan lipid Kandungan lipid
sel rendah (1-4 %) tinggi (11 22 %)
Ketahanan
Lebih sensitif Lebih tahan
terhadap penisilin
Penghambatan
Lebih dihambat Kurang dihambat
oleh pewarna basa
Kebanyakan spesies
Kebutuhan Nutrien Relatif sederhana
relatif komplek
Ketahanan
terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik
Tabel 1. Perbedaan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negative

2.3 Medium Pertumbuhan Mikroba

Medium yang baik memiliki syarat yaitu unsur hara yang diperlukan; suhu, pH
dan tekanan yang cocok untuk pertumbuhan mikroorganisme; stabil, alat dan
bahan tidak terkontaminan (Pelczar, 1986).
Macam-macam media pertumbuhan:
a. Berdasarkan sifat fisik
- Media padat, yaitu media yang mengandung agen pemadat (misalnya
agar atau gelatin) dengan konsentrasi tertentu sehingga setelah dingin
media menjadi padat.
 - Media cair, yaitu media yang mengandung larutan cair dari satu atau
lebih bahan, sebagai contoh NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
- Media setengah padat, yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4%
sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat dan tidak begitu cair.
b. Berdasarkan kandungan bahan
- Media sintetik, yaitu media yang seluruh komposisinya diketahui.
- Media kompleks, yaitu media yang sebagian komposisinya tidak
diketahui dengan pasti.
c. Berdasarkan tujuan
- Media isolasi, yaitu media umum yang digunakan mengandung semua
kebutuhan untuk tumbuh misalnya Blood agar.
- Media selektif, yaitu media menseleksi mikroba target berdasarkan
kelompok, genus, atau spesiesnya.
- Media untuk peremajaan kultur, yaitu media yang seharusnya tidak
begitu kaya nutrisi sehingga mempercepat pertumbuhan.
- Media untuk penentuan kebutuhan nutrisi/kemampuan penggunaan
substrat, yaitu media yang berfungsi untuk mendeteksi dan
mengidentifikasi kebutuhan suatu substrat dari bakteri (yang tidak
diketahui kebutuhan nutrisinya) dengan menghilangkan atau
mensubtitusi komponen suatu substrat.
- Media untuk karakterisasi bakteri, yaitu mengandung nutrisi yang cukup
untuk pertumbuhan dan diitambah substrat yang akan diuji
penggunaannya.
- Media skrining, yaitu media yang diperuntukkan untuk menggambarkan
sekilas reaksi yang diperoleh dari beberapa substrat seperti produksi
H2S pada TSI oleh enterobacteria.
- Media uji mikrobiologi untuk vitamin, asam amino, dan antibioik, yaitu
media yang memerlukan pengontrolan ketat pada saat preparasinya
untuk memastikan kemurniannya.
- Media dasar tanpa nutrisi, yaitu media yang berfungsi untuk berbagai
keperluan pendukung pertumbuhan mikroba seperti pelapisan Chitin
 agar menggunakan media chitin yang dilarutkan pada salt agar (Indra
Pradhika, 2014).

2.4 Muller Hinton Agar

Muller Hinton Agar adalah media untuk pertumbuhan mikroba. Agar ini biasa
digunakan untuk sensitivitas antibiotik. Agat ini biasanya digunakan untuk
mengisolasi spesies Nesisseria dan Moraxella. Mueller Hinton Agar ini
mengandung 30% infuse daging sapi; 1,75% Casein Hydrolysate; 0,15% kanji;
1,7% Agar (Atlas, 2004).
Media ini telah direkomendasikan oleh FDA dan WHO untuk tes
antibakteri terutama bakteri aerob dan facultative anaerobic bacteria untuk
makanan dan materi klinis. Media ini juga telah terbukti memberikan hasil yang
baik dan reprodusibel. Media agar ini juga telah mengandung sulfonamida,
trimethoprim, dan inhibitor tetrasiklin yang rendah serta memberikan
pertumbuhan patogen yang memuaskan. Prinsip penggunaan media ini yaitu
perhitungan zona hambatan menggunakan paperdisc.
Pola kerentanan antimikroba dipelajari oleh teknik difusi Kirby-Bauer.
Teknik ini dikembangkan oleh Bauer. Metoda ini yang paling nyaman dan
banyak digunakan untuk pengujian kerentanan antimikroba. Kultur murni
digunakan sebagai inokulum, kultur bakteri diinokulasi pada medium Mueller-
Hinton Agar. Biarkan inokulum mengering selama 5 menit (Kimaya Potdar dkk,
2015).

2.5 Teknik Inokulasi

Inokulasi bakteri dimaksudkan untuk menumbuhkan, meremajakan mikroba dan
mendapatkan populasi mikroba yang murni. Inokulasi adalah pekerjaan
memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan
tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Media untuk membiakkan bakteri haruslah
steril sebelum digunakan. Pencemaran terutama berasal dari udara yang
mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahan biakan mikroba yang
dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratorium agar
tidak terjadi kontaminasi. Perlu teknik-teknik dalam pembiakan mikroorganisme
yang disebut dengan teknik inokulasi biakan. Teknik inokulasi merupakan suatu
pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru
dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi.
Salah satu metoda yang sering digunakan untuk menginokulasi mikroba di
media padat dikenal dengan metoda spreading (sebar). Dengan metoda
spreading (sebar) bakteri akan tumbuh rata di permukaan media dan bakteri
yang tumbuh hanya sejenis. Metoda ini cocok digunakan untuk menguji
aktivitas senyawa antimikrobial dengan metoda zona inhibisi. Metoda spreading
(sebar) digunakan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi, memurnikan, dan
memperbanyak mikroba.

2.6 Antimikroba
Antibakteri atau antimikroba adalah bahan yang dapat membunuh atau
menghambat aktivitas mikroorganisme dengan bermacam-macam cara.
Senyawa antimikroba terdiri atas beberapa kelompok berdasarkan mekanisme
daya kerjanya atau tujuan penggunaannya. Bahan antimikroba dapat secara
fisik atau kimia dan berdasarkan peruntukannya dapat berupa desinfektan,
antiseptik, sterilizer, sanitizer dan sebagainya.
Daya hambat antibakteri berbeda-beda. Antibakteri dapat dibedakan
berdasarkan mekanisme kerjanya, yaitu antibakteri yang menghambat
pertumbuhan dinding sel, antibakteri yang mengakibatkan perubahan
permeabilitas membrane sel atau menghambat pengangkutan aktif melalui
membrane sel, antibakteri yang menghambat sintesis protein dan antibakteri
yang menghambat sintesis asam nukleat sel. Aktivitas antibakteri dibagi
menjadi dua yaitu bakteriostatik (menghambat pertumbuhan tetapi tidak
membunuh, bakteri tumbuh lagi setelah agen dihilangkan) dan bakterisid
(bakteri tidak dapat tumbuh lagi walaupun tidak terkena zat itu lagi).
Kekuatan daya hambat bakteri dibagi atas: sangat kuat (zona bening >
20mm), kuat (zona bening 10 20mm), sedang (zona bening 5 10mm),
lemah (<5mm) (Dewi,2010).
2.7 Metoda Uji Aktivitas Anti-Mikroba
Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang
efektif dan efisien.
1. Metode Dilusi
Metode dilusi dibedakan menjadi dua, yaitu dilusi cair (broth dilution) dan
dilusi padat (solid dilution).
a. Metode dilusi cair, digunakan unutk mengukur MIC atau kadar hambat
minimum dan MBC atau kadar bunuh minimum. Cara yabg dilakukan
adalah dengan memberi seri pengenseran agen antimikroba pada
medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen
antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya
pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang
ditetapkan sebagi KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media
cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba dan
diikubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah
diinkubasi ditetapkan sebagai KMB.
b. Metode dilusi padat, metode ini serupa dengan metode dilusi cair
namun menggunakan media padat (soil). Keuntungan metode ini
adalah suatu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan
untuk menguji beberapa mikroba uji.
2. Metode Difusi
a. Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan aktivitas
agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan
pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan
berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan
adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba
permukaan media agar.
b. Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC (minimum inhibitory
concentration) atau KHM (kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi
minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghabat pertumbuhan
mikroorganisme. Pada metode ini digunakan strip plastik yang
mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan
 diletakkan permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme.
Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang
menunjukkan kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan
mikroorganisme pada media agar.
c. Ditch-plate technique
Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan
pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam
cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji
(maksimum 6 macam) digoreskan kearah parit yang berisi agen
antimikroba.
d. Cup-plate technique
Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, dimana dibuat sumur
pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan
pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji.
e. Gradient-plate technique
Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara
teoretis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan
larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang kedalam cawan
petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya
dihitung diatasnya.
 BAB III
METODA KERJA

3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini disamping tabung reaksi,
Erlenmeyer 250 mL dan 100 mL, pipet tetes, spatula, kaca arloji, lampu spiritus,
magnetic stirrer, dan hot plate yang lazim digunakan di laboratorium kimia, juga
ada alat-alat lainnya seperti autoclave yang digunakan untuk mensterilkan alat
dan media. Tempat untuk media pertumbuhan mikroba dibuat menggunakan
petridish dan tabung reaksi dimana kapas, kasa steril, dan alumunium foil
digunakan untuk menutup tabung reaksi maupun medium. Jarum ose pada
praktikum ini digunakan untuk memindahkan bakteri ke medium. Selain itu,
untuk menguji aktivitas antimikroba, digunakan paperdisc yang sudah
disterilkan, dan pinset steril untuk meletakkan paperdisc pada permukaan agar.

3.2 Bahan
Bahan praktikum yang digunakan meliputi ekstrak daging, tepung tapioka,
aquadest, agar, dua jenis larutan senyawa antimikroba 1B dan 4B, larutan
antibiotik (kontrol positif dan kontrol negatif), tripton/pepton, ekstrak khamir,
NaCl, Stock glycerol E.coli dan Stock glycerol Staphylococcus aureus.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan Ekstrak Daging
Daging sapi 100 gram dicincang dan dihaluskan lalu disimpang di dalam freezer
satu malam sebelum praktikum. Kemudian daging direbus sampai matang dan
selanjutnya dipisahkan antara ampas dan air rebusan daging. Air rebusan
(kaldu) diambil dan kemudian airnya diuapkan pada suhu 80 oC sampai
terbentuk pasta. Jumlah ekstrak yang didapat ditimbang untuk digunakan dalam
pembuatan media pertumbuhan bakteri. Ekstrak daging bisa disimpan pada
suhu -20oC.
3.3.2 Pembuatan Kultur Cair Bakteri Untuk Uji Antimikroba
Media LB cair steril dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 1/5 volum
tabung secara aseptik. Kemudian inokulasi 200 L kultur bakteri murni E.coli
dan S.aureus. Tabung reaksi yang telah berisi kultur bakteri ditutup dengan
kapas-kasa, lalu kultur bakteri diinkubasi pada suhu 37 oC selama 12-18 jam.
Setelah itu, diamati pertumbuhan bakteri sampai kekeruhannya sama dengan
Standard McFarland 0,5.

3.3.3 Pembuatan Media Mueller-Hinton Agar

Semua bahan seperti 0,2 g ekstrak daging, 2 gr pepton, 0,2 g tepung tapioca,
0,5 g agar disiapkan dan dimasukkan ke dalam gelas piala 250 mL lalu
ditambahkan 100 mL akuades dan dipanaskan. Kemudian medium disterilkan
selama 20 menit pada suhu 121. Medium bisa dibagi ke dalam 4 tabung
reaksi pada saat mensterilkan. Setelah itu tabung reaksi yang berisi medium
didinginkan sebentar sampai suhu 60oC. Sementara itu 4 buah cawan petri
disiapkan dan dibagi 6 bagian berdasarkan garis diameter. Lalu media MH agar
dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan mengeras. Setelah diinkubasi 1
malam, angkat dan amati dengan teliti semua cawan petri. Media yang baik dan
bebas kontaminasi adalah bening tanpa ada bercak atau spot dari bakteri atau
jamur yang tidak diinginkan. Tutup sisi cawan petri menggunakan alumunium
foil dengan rapat dan simpan di lemari es.

3.3.4 Teknik Pemindahan Mikroorganisme Secara Aseptik dengan metoda

Spreading (untuk pengujian senyawa antimikroba dengan metoda
zona inhibisi)
1 mL kultur cair yang diinkubasi pada hari sebelumnya dimasukkan ke dalam
cawan petri medium padat kemudian diratakan. Biarkan inokulat mengering
selama 3-5 menit. Sementara itu, disiapkan paperdisc yang sudah disterilkan
lalu paperdisc dicelupkan ke dalam larutan senyawa antimikroba dan ke dalam
larutan kontrol positif dan kontrol negatif. Kemudian paperdisc diletakkan di
permukaan agar dengan menggunakan pinset steril. Inkubasi biakan tersebut
dengan membalikkan posisi cawan petri. Kemudian amati, ukur, dan foto zona
bening yang terbentuk setelah 24, 48, dan 72 jam.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

No Gambar Keterangan

Pertumbuhan bakteri E.coli dan

S.aureus pada media LB cair
1
setelah inkubasi

Media Mueller-Hinton (MH)

agar yang telah ditanami
2
bakteri hasil biakan pada media
LB cair

Zona inhibisi bakteri tidak

terlihat pada media MH
3 pengujian aktivitas antimikroba
sehingga pengukuran zona
inhibisi tidak dapat dilakukan

Tabel 1. Hasil Pengamatan Zona Inhibisi

4.2 Pembahasan
Uji aktivitas antimikroba dengan metoda Kirby-Bauer dilakukan untuk
mempelajari bagaimana potensi suatu senyawa antibiotik dalam menghambat
pertumbuhan mikroba. Potensi suatu senyawa untuk membunuh bakteri atau
yang dikenal sebagai antimikroba dapat diujikan dengan metoda pengujian
antimikroba yaitu metoda Kirby-Bauer. Bakteri yang digunakan untuk uji
aktivitas senyawa antimikroba yaitu E. coli (bakteri gram -) dan S.aureus
(bakteri gram+).
Selain itu, pembuatan medium cair atau pembuatan kultur cair bakteri juga
dilakukan. Pembuatan Medium cair dilakukan untuk menumbuhkan atau
membiakan bakteri yang akan digunakan untuk uji akivitas senyawa
antimikroba. Media pertumbuhan yang dibuat yaitu medium LB dengan
komposisi yaitu tripton atau pepton, ekstrak khamir, dan NaCl yang sesuai
dengan kebutuhan nutrisi mikroba sehingga mikroba dapat tumbuh dan
berkembang biak dengan baik.
Media pertumbuhan bakteri yang digunakan untuk uji aktivitas senyawa
antimikroba biasanya mengandung komposisi yang lebih kompleks yaitu media
Mueller-Hinton Agar (MH). Media tersebut telah direkomendasikan oleh FDA
dan WHO untuk tes antibakteri dan juga telah terbukti memberikan hasil yang
baik dan reprodusibel. Komposisi dari media tersebut adalah kaldu daging sapi,
agar, pepton, dan tepung tapioka. Komponen tersebut merupakan sebagai
sumber nutrien bagi bakteri yang berfungsi untuk mengatur pertumbuhan
bakteri.
Ekstrak daging sapi yang digunakan mengandung karbohidrat atau
berfungsi sebagai sumber energi bagi bakteri untuk tumbuh. Tepung tapioka
yang digunakan juga berfungsi sebagai sumber karbohidrat, sehingga jumlah
karbon yang digunakan untuk tumbuhnya bakteri semakin banyak. Hal ini
dikarenakan untuk pertumbuhannya, bakteri memerlukan senyawa karbon
sebagai sumber energi dan senyawa nitrogen yang akan digunakan untuk
sintesis protein. Pepton yang digunakan berfungsi sebagai sumber protein.
Jumlah sumber protein yang digunakan lebih sedikit daripada jumlah sumber
karbohidrat. Hal ini dikarenakan protein hanya berfungsi untuk menjaga sel-sel,
sedangkan karbohidrat berfungsi sebagi sumber energi untuk tumbuh.
Agar yang digunakan berfungsi sebagai pengeras atau pemadat media.
Penambahan agar selain berfungsi sebagai pemadat, juga berfungsi untuk
memberikan nutrisi plus yang dapat membantu pertumbuhan mikroba. Kadar
agar yang ditambahkan mempengaruhi kekenyalan dari media padat. Wadah
yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri disterilkan menggunakan
autoclave. Suhu optimal autoclave untuk sterilisasi yaitu 121oC.
Media MH dimasukkan ke dalam petridish secara aseptik. Hal ini bertujuan
supaya tidak ada mikroba dari lingkungan tumbuh pada media tersebut.
Sehingga hanya bakteri yang diinginkan tumbuh pada media tersebut. Setelah
media MH diinkubasi satu malam, berdasarkan hasil yang diperoleh, media
padat MH tersebut masih kenyal dan belum padat. Hal ini disebabkan oleh
penambahan agar yang lebih sedikit daripada penambahan pepton. Apabila
media padat terlalu kenyal akan mempermudah terjadinya kontaminasi pada
medium.
Pemindahan mikroorganisme dilakukan secara aseptik dengan metoda
spreading. Metoda ini dilakukan dengan cara menebarkan bakteri pada media
padat. Sedangkan untuk uji aktivitas antimikroba dilakukan dengan metoda
Kirby-Bauer (zona inhibisi). Prinsip dari metoda ini yaitu melihat zona bening
disekitar paperdisc yang sudah ditambahkan senyawa antimikroba (4B dan 1B)
dan antibiotik. Antiobiotik yang digunakan berupa kontrol positif dan kontrol
negatif, dimana berfungsi sebagai pembanding aktivitas antimikroba terhadap
senyawa antimikroba yang ingin diuji. Jika senyawa yang diuji memiliki aktivitas
antimikrobial maka senyawa tersebut akan menghambat pertumbuhan mikroba
disekitarnya, yang dapat diamati dengan warna bening dari media. Daerah
bening ini disebut dengan daerah atau zona inhibisi. Semakin besar zona
inhibisinya makan semakin aktif senyawa tersebut sebagai antimikroba.
Namun, berdasarkan hasil yang diperoleh, daerah bening atau zona
inhibisi dari media MH tidak terlihat, sehingga pengukuran luas zona inhibisi
tidak dapat dilakukan. Hal ini disebabkan oleh adanya kontaminan yang
menyebabkan senyawa yang diuji tidak terlihat melakukan aktivitas antimikroba,
bukan berarti senyawa yang diuji tidak memiliki aktivitas antimikroba. Selain itu,
media kultur cair bakteri yang digunakan berbentuk sedikit padat dan tidak cair,
hal ini dikarenakan penggunaan pepton yang terlalu banyak sehingga sewaktu
diinokulasi ke dalam petridish yang sudah terdapat media MH, inokulat masih
basah dan tidak mengering. Sehingga, paperdisc yang telah dicelupkan ke
dalam senyawa yang diuji aktivitas antimikrobanya terendam oleh media kultur
cair bakteri yang tidak mengering. Hal ini menyebabkan senyawa yang diuji
tidak terlihat melakukan aktivitas antimikroba atau daerah bening dari media
MH tidak terlihat.
Kontaminasi dapat terjadi karena pengerjaan tidak dilakukan secara
aseptik atau perlatan yang digunakan tidak steril. Ketidaksterilan ini terjadi
akibat kurangnya waktu yang digunakan untuk autoclave atau sterilisasi
peralatan sebelum pembuatan media.
S aureus merupakan bakteri gram positif sedangkan E. coli merupakan
bakteri gram negatif. Bakteri gram positif memiliki struktur yang lebih sederhana
sehingga antibiotik ataupun senyawa antimikroba lebih mudah masuk ke dalam
sel bakteri dan menemukan sasaran untuk bekerja menghambat pertumbuhan
bakteri. Sedangkan bakteri gram negatif memiliki struktur yang lebih kompleks
dan berlapis tiga. Sehingga, daya hambat masuknya antibiotik ke dalam sel
lebih kuat dibanding gram positif.
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa
media kultur cair bakteri dapat digunakan sebagai media untuk tumbuhnya
bakteri. Media pertumbuhan bakteri yang digunakan untuk uji aktivitas senyawa
antimikroba biasanya mengandung komposisi yang lebih kompleks yaitu media
Mueller-Hinton Agar (MH). Metoda Kirby-Bauer dapat digunakan untuk uji
aktivitas antimikroba dengan prinsip berdasarkan pengukuran diameter zona
inhibisi atau luas area jernih. Permukaan media MH yang tidak kering (basah)
menyebabkan terendamnya paperdisc yang telah dicelupkan ke dalam
senyawa antimikroba sehingga daerah warna bening atau zona inhibisi dari
media tidak terlihat dan tidak bisa diukur.

5.2 Saran
Untuk percobaan selanjutnya sebaiknya jumlah agar yang digunakan sesuai
takaran dan lebih banyak daripada jumlah pepton, proses autoclave mencapai
waktu dan suhu yang ditetapkan, dan tetap menjaga kesterilan saat proses
inokulasi dan pengujian aktivitas senyawa antimikroba dilakukan. Selain itu,
pahami prosedur kerja supaya percobaan selanjutnya berjalan dengan lancar.
 DAFTAR PUSTAKA

Atlas, R. M. 2004. Handbook of Microbiological Media. London: CRC Press.

Dwidjoseputro, D. 1985. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang : Djembatan.

Jawetz, E., J.L. Melnick., E.A. Adelberg., G.F. Mikrobiologi untuk Profesi
Kesehatan (Review of Medical Microbiology). Jakarta : Penerbit Buku
Kedokteran.

Mik Hindersah, dkk. Isolasi dan identifikasi bakteri aerob dan fungi dari lumpur
kolam anaerob di instalasi pengolahan air limbah bandung. Jurnal Teknik
Lingkungan., 2007, 13(2):1-4.

Pelczar, Michael J. 1986. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Universitas

Indonesia.

Potdar, K., Gharpure, M., Wadher, B. Antimicrobial activity of

eucalyptuscamaldulensis and calotropis gigantean against various
pathogens. International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical
Technology., 2015, 6(3):104-110.

Pradhika, I. 2014. Isolasi dan Inokulasi Mikroba. http://imansyahrul.blogspot.co.

id/2014/06/isolasi-dan-inokulasi-mikroba.html 25/10/2015. 01:04. WIB.

Radji M. 2006, Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi Edisi 2. Depok:

Departemen Farmasi FMIPA UI.
 Lampiran I
Skema Kerja

A. Pembuatan Ekstrak Daging

100 g daging sapi

- dicincang & dihaluskan
- didinginkan dalam freezer
- direbus sampai matang

Ampas Air rebusan

- diambil & diuapkan pada suhu 80
- ditimbang ekstrak
- disimpan pada suhu -20
-
Hasil

B. Pembuatan Kultur Cair Bakteri untuk Uji Antimikroba

Media LB cair steril

- diisikan pada tabung reaksi
- diinokulasi 200 L E.Coli & S.Aureus
- ditutup dengan kapas
- ditutup dengan aluminium foil
- diinkubasi pada suhu 37 selama 12-18 jam
- diamati kekeruhan
- digunakan untuk uji antimikroba

Hasil
C. Pembuatan Media Mueller-Hinton Agar
0,2 g ekstrak daging + 2 gr pepton
+ 0,2 g tepung tapioka + 0,5 g agar
- dimasukkan dalam beaker glass 250 mL
- di(+) 100 mL aquadest
- dipanaskan
- disterilkan selama 20 menit pada suhu 121
- dibagi dalam 4 tabung reaksi
- didinginkan pada suhu 60
- disiapkan 4 buah petridish & dibagi 6 bagian
- dituangkan MH & dibiarkan mengeras
- diinkubasi selama 1 malam
- diamati & petridish ditutup
- disimpan di refigerator
Hasil

D. Teknik Pemindahan Mikroorganisme Secara Aseptik dengan Metode

Spreading (untuk pengujian senyawa antimikroba dengan metoda
zona inhibisi)

1 mL kultur cair inkubasi

- dimasukan ke dalam petridish medium padat
- diinokulasi selama 3-5 menit
- disiapkan paperdisc yang sudah disterilkan
- dicelupkan paperdisc ke dalam larutan senyawa
antimikrobial dan ke dalam larutan kontrol + dan kontrol
- diletakan di permukaan agar menggunakan pinset steril
- diinkubasi biakan dengan membalikkan posisi petridish
- diamati, diukur, difoto zona bening setelah 24, 48, dan 72
jam
Zona bening
 Lampiran II
Tugas

1. Apa yang dimaksud dengan sifat antimikroba suatu senyawa?

Jawab:
Antimikroba adalah salah satu senyawa yang dapat mematikan
mikroorganisme atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme.
a. Mematikan mikroorganisme (mikrobisidal)
Komponen kimia yang bersifat membunuh jasad renik disebut sifat
bakterisidal (membunug bakteri) atau fungisidal (membunuh fungi).
b. Menghambat pertumbuhan mikroorganisme (mikrostatik)
Beberapa komponen kimia pada konsentrasi rendah tidak dapat
membunuh jasad renik, tetapi hanya menghambat pertumbuhannya.

2. Tuliskan beberapa contoh sumber-sumber senyawa antimikroba!

Jawab:
Senyawa anti mikroba dapat berupa dari bahan alam maupun sinstetik.
Antimikroba alam:
a. Dari tumbuhan, contohnya Alicin pada bawang putih.
b. Dari hewan, contohnya Lactoperoksidase (LP) di susu dan mata air.

3. Jelaskan beberapa metoda lain untuk uji antibakteri dan antijamur!

Jawab:
1. Metode Dilusi
Metode dilusi dibedakan menjadi dua, yaitu dilusi cair (broth dilution)
dan dilusi padat (solid dilution).
a. Metode dilusi cair, digunakan unutk mengukur MIC atau kadar
hambat minimum dan MBC atau kadar bunuh minimum. Cara yabg
dilakukan adalah dengan memberi seri pengenseran agen
antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba
uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat
jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai
 KHM. Larutan yang ditetapkan sebagi KHM tersebut selanjutnya
dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji
ataupun agen antimikroba dan diikubasi selama 18-24 jam. Media
cair yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai
KMB.
b. Metode dilusi padat, metode ini serupa dengan metode dilusi cair
namun menggunakan media padat (soil). Keuntungan metode ini
adalah suatu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat
digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.

2. Metode Difusi
a. Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan
aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba
diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme
yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih
mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme
oleh agen antimikroba permukaan media agar.
b. Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC (minimum
inhibitory concentration) atau KHM (kadar hambat minimum), yaitu
konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghabat
pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan strip
plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah
hingga tertinggi dan diletakkan permukaan media agar yang telah
ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih
yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba
yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.
c. Ditch-plate technique
Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan
pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam
cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji
(maksimum 6 macam) digoreskan kearah parit yang berisi agen
antimikroba.
d. Cup-plate technique
Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, dimana dibuat
sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme
dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji.
e. Gradient-plate technique
Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar
secara teoretis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar
dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang
kedalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi
kedua selanjutnya dihitung diatasnya.