Universidad internacional SEK

Biotecnologa
Victoria Jimnez
PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls Polimerasa

Chain Reaction) es, sin lugar a dudas, la tcnica ms importante y revolucionaria
en biologa molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de
un fragmento de cido desoxirribonucleico (ADN) a partir de una sola molcula.
La PCR se basa en la replicacin celular en la que actan varias protenas
para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como
molde. En procariontes se han encontrado al menos 12 protenas involucradas
en la replicacin. Estas protenas actan en diferentes actividades, como: 1) la
identificacin del sitio de origen de la replicacin; 2) el des enrollamiento de la
doble hlice; 3) la estabilizacin de la estructura desenrollada; 4) la generacin
de cadenas iniciadoras complementarias con un extremo 3 libre que sirve de
iniciador para que la ADN polimerasa comience su actividad catalizadora; 5) el
avance de la bifurcacin replicadora por des enrollamiento; 6) los pasos finales
del ensamblaje de dos cadenas complementarias; 7) la identificacin de los si-
tos de terminacin y 8) el superenrollamiento de las dos nuevas molculas de
ADN (Figura 1). Sin embargo, la enzima ms importante en la replicacin es la
polimerasa del ADN dependiente de ADN, comnmente conocida como ADN po-
limerasa, porque es la encargada de incorporar nucletidos durante la sntesis de
las nuevas cadenas de ADN (Bohinski 1991).

Figura 1. Proceso de replicacin del ADN a nivel celular. Horquilla de replicacin del
ADN con algunas de las protenas ms importantes que participan el proceso. La mo-
lcula original de ADN sirve de molde para que la ADN polimerasa genere una nueva
copia de un fragmento de ADN. La ADN polimerasa celular requiere la presencia de
un iniciador para llevar a cabo el proceso de replicacin. Modificada de www.biologia.
edu.ar/adn/imagenes/ch8f20.gif.
 En la PCR se simula en un tubo lo que ocurre durante la replicacin celular. La sn-
tesis de nuevas cadenas de ADN se lleva a cabo mezclando: el ADN que contiene el
o los fragmentos que se van a amplificar; la polimerasa; los iniciadores (fragmento
de ADN de 15-30 nucletidos que flanquean la regin a amplificar y que aportan el
extremo 3 libre para que inicie la transcripcin); desoxinucletidos (dNTPs); cloru-
ro de magnesio (MgCl2) u otro co-factor necesario para que trabaje la polimerasa
y una solucin amortiguadora que mantenga el pH apropiado para que se lleve a
cabo la sntesis (Espinosa 2007). Esta mezcla se somete a la repeticin de
varios ciclos a diferentes temperaturas (ciclo de PCR) que sustituye a la
mayora de las protenas que actan en la replicacin celular.

APLICACIoNES

La PCR es la tcnica ms importante en la biologa molecular porque con ella

se ha logrado la simplificacin e innovacin de muchas tcnicas moleculares
que permiten abordar nuevas lneas de investigacin en diferentes ramas de
la ciencia como biotecnologa, ecologa, evolucin, biologa de la conservacin,
arqueologa, patologa, medicina forense, entre otras (ver captulos de DGGE,
PCR en tiempo real, ISSR , AFLP y secuenciacin de ADN).

Figura 4. Cintica de amplificacin de la PCR. En los primeros ciclos de la PCR no

hay un incremento significativo en la cantidad de ADN sintetizado. El punto donde
inicia el incremento de ADN sintetizado (absorbancia) se conoce como fase inicial,
posteriormente se presenta la fase logartmica donde la eficiencia de la amplifica-
cin es cercana a 2n. Finalmente se encuentra la fase estacionaria, cuando la enzima
presenta un decaimiento en su actividad y los reactivos se empiezan a agotar. En un
gel de agarosa se aprecia como incrementa la concentracin de la regin que se est
amplificando conforme pasan los ciclos. Modificado de Herveg et al. 2006.
 Antes del desarrollo de la PCR las tcnicas de biologa molecular eran
muy onerosas y slo eran posibles cuando se obtenan numerosas copias
del ADN por clonacin. La PCR convirti en una rutina la aplicacin de es-
tas tcnicas, como es el caso de la secuenciacin gentica, permitiendo la
lectura completa del genoma humano, as como de muchos organismos que
se toman como modelos en la investigacin de distintos problemas biolgicos.
Hasta noviembre del 2013 existen clasificados en el sistema bibliogrfico
PubMed 320,953 publicaciones cientficas internacionales que mencionan el
uso de la tcnica PCR.

VENtAjAS y DESVENtAjAS

La principal ventaja de la PCR es que permite generar millones de copias

de la regin de inters a partir de una o muy pocas copias del ADN molde
(Shibata et al. 1988). Es una tcnica muy robusta debido, en gran medida,
a la gran capacidad de los oligonucleotidos (en este caso de los iniciadores)
de unirse firme y especficamente a sus secuencias complementarias de
ADN discriminando fcilmente entre centenares de millares de sitios (Mullis
1990).
La principal desventaja es la necesidad de estandarizar la tcnica para el
organismo o la tcnica de inters, lo cual puede ser tardado y costoso.
PERSPECtIVAS

Como hemos comentado, la PCR es la herramienta fundamental en biologa

molecular y son innumerables las aplicaciones que se derivan de ella. Las tc-
nicas asociadas a la PCR han avanzado de forma vertiginosa en los ltimos
aos (ver siguientes captulos del manual) y cada vez se encuentran nuevas
aplicaciones a la PCR.
El avance tecnolgico actual ha proporcionado a la tcnica un mayor poder
de resolucin al lograr la amplificacin a partir de una molcula de cido nuclei-
co empleando tcnicas de la nanotecnologa (Lagally et al. 2001).
Los termocicladores han evolucionado enormemente en cuanto a la velo-
cidad de amplificacin, el nmero de muestras por placa, la capacidad de al-
macenamiento de datos en la memoria interna, de controlar distintas placas
o bloques de amplificacin y de manejar distintas temperatura de las filas o
hileras de tubos en una misma placa de amplificacin. En los ltimos aos se ha
logrado una reduccin importante del tiempo de las pruebas y se espera que
los equipos sean cada vez ms rpidos y compactos.
Las compaas de reactivos para biologa molecular han desarrollado pro-
ductos que hacen que la tcnica sea ms rpida o sencilla y para pruebas espe-
cficas, como kits para trabajar muestras forenses degradadas.
Los costos de los equipos y los reactivos para la PCR han disminuido, en
referencia a las dcadas pasadas, haciendo que los procedimientos de anlisis
y diagnsticos de materiales biolgicos aumentaran el empleo de esta tcnica.
Sin embargo, la PCR an no est reconocida como una metodologa estanda-
rizada a nivel mundial. Lo anterior hace que los diagnsticos moleculares no
tengan valor legal en la reglamentacin oficial en algunos pases. Por ejemplo
la Organizacin Mundial de la Salud, no incorpora tcnicas moleculares dentro
de sus mtodos estandarizados debido a que en muchos pases de tercer mun-
do es imposible comprar equipos y reactivos para hacer los diagnsticos con
tcnicas moleculares, entre ellos la PCR (Kator y Rhodes 2003).
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