Professional Documents
Culture Documents
Este tipo de pruebas tiene en comn que todas requieren un anticuerpo (antisuero)
para detectar un antgeno especfico del microorganismo buscado. Segn el procedimiento
usado para poner de manifiesto la reaccin Ag-Ac, existen diferentes tcnicas: aglutinacin,
inmunofluorescencia, enzimoinmunoanlisis o inmunocromatografa, inmuno-PCR, algunas de
ellas fcilmente automatizable.
1.1. Antisueros
La mayora de los antisueros para la deteccin de antgenos se hallan comercializados,
generalmente formando parte de un kit listo para el empleo.
1
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
Tanto los marcadores fluorescentes como lumnicos emiten luz, que puede ser
observada y cuantificada. La diferencia es que las sustancias fluorescentes emiten luz cuando
son excitadas al incidir sobre ellas radiacin ultravioleta y las lumnicas emiten luz por accin
de una reaccin qumica (quimioluminiscencia).
Los fragmentos de ADN podrn ser amplificados y observados por electroforesis. Estos
marcadores han superado en sensibilidad a los marcadores radiactivos, por lo que se estn
imponiendo debido al menor riesgo en su utilizacin.
2
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
solubles pero tambin pueden emplearse para la deteccin de Ag particulados como los de las
bacterias hongos y virus.
Las tcnicas de aglutinacin facilitada suelen ser menos sensibles que las de EIA, por lo
que, salvo excepciones no son adecuadas para la deteccin de antgenos vricos que
acostumbran a estar en menor cantidad que los bacterianos.
Muestra A
Muestra B
1.2.2. Inmunofluorescencia.
3
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
Frotis de esputo
Frotis de esputo
4
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
1.2.3. Enzimoinmunoanlisis
1.2.4. Inmunocromatografa
La prueba se realiza en una pequea tira de nitrocelulosa con tres zonas clave:
1, en uno de los extremos de la tira, en la que hay, en exceso,
anticuerpos de conejo contra el antgeno buscado marcados con una partcula
de color; en ese lugar se deposita la muestra lquida: LCR, orina, etc. Es la zona
de inoculacin (I).
2, en la mitad de la tira hay una banda de anticuerpos de conejo
fijados a la nitrocelulosa dirigidos contra el mismo antgeno. Es la zona de
resultados (Re)
3, cerca del otro extremo de la tira, hay una banda con anticuerpos
fijados dirigidos contra los anticuerpos de conejo. Es la zona de control (Ct)
5
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
Resultado -, la
Resultado +, la muestra no tiene
muestra tiene Ag Ag
6
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
7
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
2. DIAGNSTICO SEROLGICO
El diagnstico serolgico consiste en poner en evidencia una respuesta inmune del
husped frente a la infeccin por un microorganismo (bacterias, virus, hongos o parsitos). En
la prctica se trata de detectar los anticuerpos especficos dirigidos frente a los antgenos del
microorganismo infectante. Adems del diagnstico de las infecciones, los estudios
serolgicos tambin tienen su aplicacin para conocer el estado inmune de un individuo frente
a un agente infeccioso (embarazadas, estudios previos a una vacunacin), o en estudios
epidemiolgicos en que se quiere conocer el estado inmune de la poblacin.
8
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
la tcnica utilizada. Si, por el contrario, el anticuerpo buscado no est presente en la muestra
no se podrn fijar al antgeno y no se producir la seal.
En todas ellas conviene cuantificar los anticuerpos, los resultados se dan como ttulo de
anticuerpos. El ttulo de anticuerpos se determina de forma distinta segn el tipo de prueba.
Las tcnicas ms utilizadas para las pruebas serolgicas son las de:
Aglutinacin directa e indirecta. En la primera se usan antgenos particulados, es decir
los antgenos forman parte de microorganismos (bacterias protozoos). En la segunda
los Ag se han fijados a la superficie de partculas inertes.
Inmunofluorescencia indirecta (IFI).
Pruebas de enzimoinmunoensayo (ELISA)).
La tcnica de fijacin de complemento y la tcnica de neutralizacin, son cada vez
menos empleadas en los laboratorios clnicos.
Se basan en que la accin citoptica de un virus o una toxina, sobre una lnea
celular, puede ser bloqueada si los virus o la toxina se enfrentan previamente a
9
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
Las pruebas EIA para detectar anticuerpos son de tipo indirecto o heterogneo (ELISA
=Prueba de inmunoabsorcin ligado a enzimas).
Hay una modalidad de tipo competitivo que tiene mayor sensibilidad.
Con las pruebas de ELISA se puede detectar la existencia de IgM, o IgA.
10
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
Para detectar la presencia de IgM o IgA lo que hay que hacer es usar una anti-IgM o anti-
IgA humana marcada con la enzima. El procedimiento es similar a cualquier ELISA, por ejemplo
si se busca la existencia de IgM contra un antgeno en una muestra el procedimiento sera el
siguiente: sobre los pocillos en donde se encuentran fijados los antgenos se echa una cantidad
de muestra en la que se investigan la existencia de anticuerpos IgM, seguidamente se aade
anti-IgM humana que se fijar a los IgM de la muestra, se realiza un lavado; si en la muestra
haba IgM contra el antgeno, en el pocillo quedar fijados al antgeno y a ellos se fija IgM de la
muestra.arn los anti- IgM humana marcados con la enzima, al aadir el sustrato la cantidad
de producto ser proporcional a la cantidad de Ig M que hubiera en la muestra. En el caso de
que en la muestra tambin hubiera IgG u otro tipo de Ig contra el antgeno habrn reaccionado
con los antgenos pero al aadir la anti-IgM marcada con la enzima no se unir al complejo
Ag- Ac y por tanto en los resultados dar que no existe Ig M en la muestra (fijarse en el ltimo
grfico).
Se realizan sobre portaobjetos en los que estn adheridos los antgenos. Este
portaobjetos puede estar dividido en zonas para que en cada zona se eche suero a una
dilucin determinada. Despus de lavar el porta, se aade una solucin de anticuerpos anti-Ig
G humana marcada con un producto fluorescente. Alternativamente se pueden usar anti-IgM
humana marcada o Anti-IgA humana marcada, para detectar si los anticuerpos contra el
antgeno son de tipo IgG, IgM o IgA.
De todas formas siempre se seguirn las instrucciones del fabricante de los productos
para dar los resultados.
Infeccin estreptoccica
El estreptococo betahemoltico del grupo A, produce infecciones farngeas. El
diagnstico por cultivo es poco especfico, puede completarse estudiando el ttulo de
antiestreptolisina O (ASTO o ASO) y antiDNAsa.
En la prctica diaria la determinacin de ASO tiene escaso valor en la fase aguda de la
enfermedad, pero s es til en la deteccin de las complicaciones: fiebre reumtica y
glomerulonefritis aguda.
Infecciones respiratorias
En el diagnstico serolgico de infecciones por virus respiratorios (virus de la gripe,
virus respiratorio sincitial, parainfluenza y adenovirus) se usan tcnicas de fijacin de
complemento (FC), ELISA e IF. El diagnstico de infeccin aguda requiere demostrar una
seroconversin, pero la deteccin de un ttulo de IgM es tambin bastante especfico.
En las infecciones pulmonares por micoplasma: FC, ELISA, de varios tipos para IgG e
IgM , IF, hemaglutinacin, y aglutinacin pasiva. Lo recomendable es ver una seroconversin,
pero un ttulo alto del primer suero con una clnica compatible suele ser diagnstico.
Infecciones gastrointestinales
Se puede optar tambin por la deteccin por ELISA de los Ac anti Vi (IgG, IgA e IgM),
con sensibilidad y especificidad de alrededor del 90% en casos probados de fiebre tifoidea.
Brucellosis
Cuando un individuo presenta los primeros sntomas clnicos e brucelosis ya tiene
anticuerpos en el suero, en particular anti-LPS, se detectan por aglutinacin (prueba del Rosa
12
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
Mononucleosis infecciosa
La prueba fundamental para establecer el diagnstico de la MNI por VEB es el test de
Paul-Bunnel-Davidshon (PBD) que detecta la presencia de anticuerpos heterfilos.
En la actualidad existen mtodos comercializados de aglutinacin en porta
(MonospotR) basados en el test de PBD, considerndose positivos ttulos superiores a 1:2. Los
anticuerpos heterfilos son un grupo heterogneo de anticuerpos (expresin de la
transformacin linfocitaria de los linfocitos B tras la infeccin por el VEB).Aparecen a las dos
semanas de la infeccin y persisten durante 8-12 semanas, en algunos casos hasta 1 ao.
Tambin se estudian tres tipos de anticuerpos: anti-VCA, anti-EBNA, anti-EA mediante tcnicas
de IFI y ELISA.
Rubeola
Para el diagnstico de rubeola, la inhibicin de hemaglutinacin ha sido una tcnica
clsica para el diagnstico de rubola. Hoy en da los mtodos inmunoenzimticos ELISA para
deteccin de inmunoglobulinas (IgG e IgM) son los ms empleados.
La determinacin de anticuerpos IgG se utiliza como marcador de exposicin previa
(asumiendo su positividad como sinnimo de inmunidad). En Espaa, desde hace varios aos,
se realiza un control de IgG durante el embarazo recomendndose la vacunacin posparto de
las mujeres seronegativas.
El diagnstico serolgico de infeccin se basa en la determinacin de IgM, la
seroconversin de IgG (cambio de negativo en una muestra tomada en la fase aguda de la
enfermedad a positivo en una muestra tomada en la fase convaleciente) o el serorefuerzo de
IgG (aumento al menos cuatro veces el ttulo en la segunda muestra en un estudio en paralelo
con la primera).
Sfilis
Para el diagnstico serolgico de sfilis existen dos tipos de pruebas serolgicas, las no
treponmicas y las treponmicas. Las no treponmicas detectan los Ac denominados
inespecficos o reagnicos; las treponmicas detectan los Ac especficos o treponmicos.
13
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
Infecciones parasitarias
Las pruebas serolgicas son el principal mtodo diagnstico de la toxoplasmosis. La
inmunoglobulina G (IgG) anti-toxoplasma aparece entre 1-3 semanas tras la infeccin,
alcanzando el nivel mximo a las 6-8 semanas y disminuyendo progresivamente durante los
dos aos siguientes, aunque permanece positiva durante toda la vida. La inmunoglobulina M
(IgM) aparece durante la primera semana de la infeccin, y disminuye e incluso desaparece en
los siguientes meses (a veces puede persistir positiva durante aos). Para el diagnstico es
importante la existencia de seroconversin: elevacin del ttulo de anticuerpos en muestras
separadas 3 semanas (tanto de IgM como IgG), o en la presencia de IgM en ausencia de IgG.
14
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
Para el diagnstico de paludismo hay pruebas de IF que llevan antgenos de las cuatro
especies, son muy sensibles y de alta especificidad pero no permiten identificar la especie ni
entre infeccin actual o pasada. Tambin hay kits de ELISA. LA serologa no es la prueba
diagnstica recomendable, es ms til el examen directo.
Para el diagnstico de amebiasis hay tcnicas de ELISA o IFI, antes haba de
hemaglutinacin.
Infecciones fngicas
Infecciones congnitas
Las infecciones congnita causadas por virus de la rubola, citomegalovirus, parvovirus
19, toxoplasma, listeria y treponema de la sfilis se pueden diagnosticar detectando
anticuerpos IgM en la sangre de cordn (fetal) evitando la contaminacin por sangre materna.
15
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
16
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16
Hepatitis , A, B y C
Hepatitis B aguda
HBsAg HBeAg IgM antiHBc IgG antiHBc antiHBe antiHBs ADN-VHB GPT
Fase inicial + + + - - - +++ +++
Curacin - - - + + + +/- -
Hepatitis B crnica
17
Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico 2010/11 UD 15-16