ESTABILIDAD Y

DESNATURALIZACIN
DE PROTENAS
 Estabilidad Adaptabilidad de
conformacional protenas

Depender de:
La diferencia de energa libre
entre estados

nativo y desnaturalizado
 Mecanismo de desnaturalizacin proteica:

Definicin: un proceso o secuencia de procesos

Nativo Desnaturalizado

Nativo:
Bajo ciertas condiciones de pH y temperatura cada
polipptido asume una conformacin especfica.
Corresponde a:
Una estructura termodinmicamente estable y
Un sistema organizado con mnima energa libre.

La conformacin nativa esta relacionada con la:

Polaridad
Hidrofobicidad
Impedimento estrico.
Estado nativo es termodinmicamente ms estable

Cambios en entorno:
(pH, fuerza inica, temperatura, composicin, disolvente, etc)

Provocan que la molcula asuma nueva estructura

(adaptabilidad conformacional).

Cambios en estructura cuaternaria, terciaria y

secundaria sin afectar la estructura primaria.

Dependiendo de las condiciones las protenas asumen

algunos estados desnaturalizados.

Nativo Desnaturalizado
 Consideraciones termodinmicas.
El plegamiento de una protena depende de muchos
factores:

Intrnsecos: estructura primaria, presencia de

puentes disulfuro, interacciones electrostticas,
interacciones hidrofbicas.

Extrnsecos: polaridad del medio, fuerza inica,

pH, temperatura, presencia de otros compuestos.

La estructura de una protena nunca es esttica, est

sujeta a un equilibrio donde intervienen estos factores.
 Variables de estado de la protena
Variable de estado:
parmetro que describe una parte de cierto sistema energtico.

Energa de Gibbs (G)

Seala la espontaneidad de un proceso, es decir, la capacidad
potencial para que un proceso o reaccin suceda.

Es imposible medir la energa de Gibbs en trminos absolutos, no as

sus cambios (aumentos o descensos)

La energa de Gibbs se define mediante la expresin siguiente:

DG=DH-TDS

DH: cambio de entalpa asociado a absorcin o emisin de

energa
DS: cambio de entropa, asociada al grado de desorganizacin
del sistema
Para que un proceso pueda ocurrir espontneamente:
Necesario que el cambio de energa de Gibbs sea
negativo.
Un sistema tiende a alcanzar el nivel ms bajo posible de
energa de Gibbs.

TIPOS DE SISTEMAS:
Inestable:
Elevada energa de Gibbs
Fcilmente reaccionar para disminuir esta energa.
Metaestable:
Mnimo de energa de Gibbs bajo condiciones especficas
Puede permanecer en ese estado indefinidamente,
cambios leves en condiciones pueden provocar que se
modifique.
Estable:
El sistema ha alcanzado el menor estado de energa de
Gibbs para ciertas condiciones
No se modificar a menos que condiciones se modifiquen.
Proceso de desnaturalizacin de Protenas,

Difcil conocer por complejidad de interacciones de fuerzas

que estn involucradas en la determinacin de la estructura
de la protena.

Sin embargo, se han elaborado algunos modelos para tratar

de describir este proceso:

Un modelo basado en esta idea es el modelo del

Estado de glbulo fundido (= molten globule state):

Propone prdida casi inmediata de la estructura

cuaternaria y terciaria pero conservando la estructura
secundaria, que se pierde gradualmente en cada etapa
metaestable.
 Mecanismo de desnaturalizacin:

Desnaturalizacin de protenas
Proceso cooperativo.
Fenmeno de transicin de dos estados:

a)Desdoblamiento parcial (pocas rupturas de interacciones)

b)Desdoblamiento total (generacin de interacciones netas)

NATIVO INTERMEDIOS DESNATURALIZADO

MOLTEN GLOBULE STATE

Molten globule state:
estados parcialmente desdoblados
diferentes al estado nativo y
diferente al estado desdoblado total.

Los estados intermediarios molten globule state

Presentan alta afinidad por ligantes hidrofbicos

Se favorece formacin de complejos

lipoprotecos que provocan cambios en las
caractersticas que presentaba inicialmente.
Estados energticos de las Protenas
El nivel de energa de Gibbs que posee una protena bajo
determinadas condiciones (pH, temperatura, fuerza inica, etc):

Determina su estabilidad conformacional

es decir, la fortaleza de su estructura.

Modelo para explicar desnaturalizacin

Proceso de desnaturalizacin difcil de conocer:

Complejas interacciones de fuerzas involucradas en
determinar la estructura de la protena.

Modelo de glbulo fundido (molten globule state):

Modelo basado en esta idea, propone:

Estructura terciaria y cuaternaria:

prdida casi inmediata

Estructura secundaria,
Conservada, que se pierde gradualmente en
cada etapa metaestable.
A.Protena en estado estable y estructura nativa.
B.Cambio de condiciones (Aumento de temperatura, adicin de
cido, etc). La protena entra en un estado inestable.

C.La protena pasa por una serie de estados metaestables.

(Conforme se desnaturaliza, pierde organizacin)

D.Finalmente, se alcanza un nuevo estado estable, con una

estructura desnaturalizada y desorganizada.
 Mediante este modelo es posible
explicar:
Prdida de funcin de Enzimas:
no sbita, sino de forma paulatina.

Procesos de renaturalizacin.

Protena puede regresar del mismo modo a

forma nativa, especialmente si no se
desnaturaliz excesivamente, es decir, si
permaneci en alguna de las etapas
metaestables.

Parte de la estructura que se conserv puede

actuar como molde sobre el cual se reorganiza
la parte desnaturalizada.
Mediante este modelo es posible
explicar:

Descenso de solubilidad (desenmascaramiento

de grupos hidrofobos).

Modificacin de capacidad de retencin de agua.

Perdida de actividad biolgica.

Incremento en viscosidad intrnseca.

Incapacidad de cristalizar.
Dependiendo de protena y condiciones
de tiempo y temperatura,
desnaturalizacin es parcial o total
Disociacin reversible:
Prdida de estabilidad de estructura cuaternaria (primer paso
de desnaturalizacin, puede o no recuperar sus propiedades
funcionales).

Desnaturalizacin irreversible:
Perdida en la estabilidad de estructura cuaternaria y terciaria
(perdida total de sus caractersticas y propiedades
funcionales).
 DESNATURALIZACION
DE PROTENAS

Factores fsicos
Temperatura: calor y fro
Presiones hidrostticas

Factores qumicos
cidos y lcalis (pH)
Disolventes orgnicos
Detergentes
Sales
 Factores fsicos

Temperatura:
calor y fro

Presiones hidrostticas
 Calor
VARIABLES:
Temperatura,
velocidad y tiempo de calentamiento.

Todo alimento procesado pasa por alguna etapa

de tratamiento trmico.

Aumenta energa cintica de toda la protena.

Se debilitan interacciones electrostticas ms

dbiles (inicas), se pierde este importante
soporte.
 Calor
Desestabilizacin de interacciones no covalentes:

1.Puentes de Hidrogeno en interior de protena,

interacciones electrostticas y Van der Waals
(exotrmicas). Perdida de estabilidad a altas
temperaturas y viceversa.

2.Hidrofbicas: estables a altas temperaturas 60

70 C y poco estables a bajas temperaturas.
(endotrmicas).
 Perfiles de desnaturalizacin trmica:
A.Cambio brusco al pasar temperatura crtica
(temperatura de desnaturalizacin o molting point)

B.Cambio gradual de las propiedades

C.Prdida progresiva con cambios bruscos ocasionales

C C C
[A] [B] [C]
 Posibles consecuencias de tratamiento
trmico:

Prdida estructura terciaria y/o cuaternaria

afecta actividad de enzimas.

Prdida de solubilidad,
provoca floculacin de protena
(agregacin y precipitacin)
 Caractersticas estructurales que protegen a protena
de desnaturalizacin trmica:

Tamao:
Protenas pequeas ms resistentes que grandes

Puentes disulfuro:
Interacciones covalentes
Poco afectados por incremento de temperatura)
confieren rigidez a la estructura de la protena)

Hidrofobicidad:
Protenas con ms residuos hidrofbicos (Phe, Val, Ala, Thr)
ms estables a cambios de temperatura que otras ricas
en aminocidos polares o inicos.

Fuerzas inicas
son de muy corto alcance
se debilitan al aumentar temperatura.
Contenido de agua:

Agua interviene en desnaturalizacin una vez iniciada:

al perder estructura nativa, se producen grietas
a travs de las cuales el agua penetra al interior
de protena.

Protenas deshidratadas
Mas resistentes a desnaturalizacin trmica
Tienen estructuras ms estticas
Movilidad de segmentos polipeptdicos mas
restringidos
 Calorimetra Diferencial de Barrido

Tcnica muy til en estudios de desnaturalizaciones

trmicas de las protenas.

Cualitativa
Identificacin y caracterizacin de una sustancia
por su huella trmica y cooperatividad de una
transicin

Cuantitativa
Transicin de calor, parmetros termocinticos
Calormetro
Representacin esquemtica de
diagrama de fases (elptico) de
estabilidad de las protenas
 Factores qumicos

cidos y lcalis (pH)

Disolventes Orgnicos
Detergentes
Sales
 pH
Modifica:
Temperatura de desnaturalizacin
Propiedades funcionales tales como:
Gelificacin
Espumado
Emulsificacin.

Protenas estables en ciertos rangos de pH

A pH extremadamente altos o bajos ocurre:

Desnaturalizacin

A pH isoelctrico:
Falta de fuerzas repulsin inhibe desdoblamiento de
protenas.
Punto isoelctrico, pH al cual :
Suma de cargas positivas igual a cargas negativas
Interacciones inicas a nivel mnimo
Frecuentemente a la menor solubilidad de protena

A pH lejanos de punto isoelctrico:

Fuerzas de repulsin son inducidas por carga neta
de la protena, produce:

desdoblamiento o desnaturalizacin

Una exposicin prolongada de protenas a pH altos

inhibe la formacin de agregados.
 Disolventes orgnicos
Afectan estabilidad de:
Interacciones hidrofbicas,
Puentes de H
Interacciones electrostticas.

EFECTOS:
Cadenas laterales son mas solubles
Se debilitan las interacciones hidrofbicas.
Efecto neto depende de magnitud del cambio
sobre las interacciones polares / no polares.

Se favorecen las interacciones entre grupos de

carga opuesta y aumentan la repulsin entre
grupos con la misma carga
 Iones metlicos
pH y fuerza inica de una solucin,
Determina la carga neta de una protena y su
susceptibilidad a la desnaturalizacin trmica.

Concentracin y/o la fuerza inica de la sal.

[M] < 0.5 protenas tienen mayor estabilidad

[M] > 1 altas concentraciones de sales neutras,

disminuye solubilidad de protena, tiende a
precipitar.
 Los metales alcalinoterreos (Mg, Ca) mas reactivos
que sodio y potasio.

Cu, Fe, Hg y Ag reaccionan fcilmente con protenas.

Serie Hofmeister

SO42- < F- < CH3COO- < Cl- < Br - < I - < ClO4 -

< SCN - < NH4+ < K < Na < Li < Mg < Ca

Iones a la izquierda promueven insolubiliuzacin,

agregacin y estabilizacin de la conformacin
nativa.

Iones a la derecha promueven desplegamiento,

disociacin y solubilizacin.
 Azcares y polioles

Estudios DSC en
-lactoglobulina, BSA, y conalbmina
incremento en T desnaturalizacin en presencia de
glucosa y sacarosa (mayor incremento con glucosa).

Hay incremento de estabilidad:

Azcar estabiliza a protena parcialmente

desnaturalizada, Inhibiendo agregacin
Incremento estabilidad brindado por azcares y
polioles depende:
Tipo y concentracin del poliol
Naturaleza de la protena.

La T de desnaturalizacin de la -lactoglobulina:
Con sacarosa, glucosa y glicerol aumenta con
concentracin
Con etilenglicol disminuye.

Etilenglicol:
Poliol
Baja la constante dielctrica del medio
Interacta con cadenas no polares (disminuye
estabilidad trmica)
Modificadores de protena
Urea y clorhidrato de guanidina

Producen desnaturalizacin de protena sin necesidad de calor

Solo a muy altas concentraciones
Causan formacin de agregados)

EFECTOS:
Enlace preferencial de urea con protena desnaturalizada.
Solubilizacin de residuos de aminocidos hidrofbicos
Formacin de enlaces H
Competencia con el agua.
Detergentes aninicos:

SDS
Disminuye estabilidad trmica de conalbmina y
albmina.

Incrementa estabilidad de -lactoglobulina (hasta 7

C) a bajas Concentraciones.

EFECTOS:
Enlace preferencial a protena desnaturalizada.

Modifica estructura de protena de forma

irreversible.
 Mtodos de medicin de
desnaturalizacin trmica y
coagulacin

Solubilidad
UV y Espectrofotometra de fluorescencia
Espectroscopia de infrarrojo
Electroforesis
Calorimetra Diferencial de Barrido
Microscopa electrnica