RELATRIO DE AULA PRTICA n2

Curso: Nutrio

Docente: Prcia Graczyk

Discentes: Esttefany Araujo, Mikaely
Keytiane, Milena Camilo e Priscila Fantini

Sinop-MT
Novembro/2017
 INTRODUO:

Colorao de Gram

chamado de colorao de Gram o mtodo de colorao utilizado para

diferenciar espcies bacterianas em dois grupos, bactrias gram-positivas e
gram-negativas. Entre os fatores que iro diferenciar gram-positivos de gram-
negativos, est a colorao das bactrias, a composio e propriedades
qumicas e fsicas das paredes celulares.
Outro mtodo de diferenciao a deteco de quantidade de
peptdeoglicano nas bactrias gram-positivas e nas bactrias gram-negativas.
As bactrias gram-positivas sero azul violeta, enquanto as gram-negativas
sero vermelhas.
A estrutura que as bactrias iro apresentar outro aspecto que pode ser
levado em considerao para diferenciar as bactrias gram-positivas das gram-
negativas.
O mtodo de colorao de Gram considerado um dos mais importantes
dentro dos laboratrios de anlises clnicas e microbiologia. Em laboratrios de
anlises clnicas, por exemplo, a tcnica essencial para obteno de
resultados. As bactrias so caracterizadas como gram-positivas ou gram-
negativas em esfregaos de pus ou fludos orgnicos, permitindo que o
profissional do laboratrio possa monitorar as infeces.
A tcnica de colorao Gram em anlises clnicas usada principalmente
para identificar preliminarmente a morfologia das bactrias ou para estabelecer
se h um nmero significativo de bactrias nas amostras clnicas.
Apesar da resposta positiva obtida com os resultados das tcnicas de
colorao de Gram, outros mtodos de identificao bacteriana devem ser
utilizados para que o resultado seja o menos controverso possvel.
Vale ressaltar que algumas bactrias no se coram ou coram-se fracamente.

Bactrias gram-positivas e gram-negativas, aps a colorao de Gram. Fotos:

Y_tambe / Wikimedia Commons ([1][2]) [CC-BY-SA 3.0]

A tcnica que consiste na colorao das bactrias apresenta diagnstico

clnico correto em 80% dos testes realizados, levando em considerao a
simplicidade e velocidade da tcnica, o nmero extremamente positivo. Essa
tcnica ainda possui baixo custo e instalaes simples.
 INTRODUO:

Diluies da amostra para alimentos

O processo de diluio da amostra para realizao de anlises

microbiolgicas de alimentos bem como o procedimento tcnico utilizado
durante esse processo constitui fatores importantes de interferncia nos
resultados finais da anlise microbiolgica.
Diluio o procedimento de adio de uma substncia a outra para reduzir a
concentrao de uma das substncias. Expressa de outra forma, uma diluio
indica a quantidade relativa de substncias em uma soluo.
O uso mais comum da palavra diluio ocorre no sentido de que tantas
partes de um material esto sendo diludas em um nmero total de partes do
produto final (diluente + material).
Uma diluio uma expresso de concentrao ou proporo, no de
volume.
Exemplo:
Fazer uma diluio 1 para 10 de leite em soluo salina peptonada.
Esta frase poderia ser escrita de outras formas, com o mesmo significado:
Fazer uma diluio 1 em 10, de leite em soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1 para 10, de leite com soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1/10, de leite com soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1:10, de leite usando soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio de 1 parte de leite e 9 partes de soluo salina
peptonada.
Em microbiologia de alimentos, comumente so utilizadas diluies decimais
da amostra, adotando-se rotineiramente dois critrios: massa por unidade de
volume (m/v) e volume por unidade de volume (v/v).
Diluies decimais so diluies em que a quantidade de substncia a ser
diluda corresponde unidade, ou mltiplos da unidade e o volume final da
soluo diluda igual a 10 ou mltiplo de 10 (diluies de base 10).
Diluies decimais seriadas so diluies decimais preparadas em srie e que
possuem um fator de diluio nico e igual a 10.
Exemplo:
Preparar diluies decimais de uma cultura bacteriana em fase estacionria
at 10 -3:
a) Preparar uma diluio 1:10 da cultura em fase estacionria em soluo
salina peptonada, isto , misturar 1 mL da cultura em fase estacionria com 9
mL de soluo salina peptonada (10-1).
A partir da diluio 1:10 preparada e aps homogeneizao em agitador de
tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de soluo salina peptonada, de forma
a obter a diluio 1:100 da cultura em fase estacionria (10-2). A partir da
diluio 1:100 preparada e aps homogeneizao em agitador de tubos, tomar
1 mL e misturar com 9 mL de soluo salina peptonada, de forma a obter a
diluio 1:1000 da cultura em fase estacionria (10-3).
 OBJETIVOS
PRTICA 1:
A colorao de Gram uma tcnica comum utilizada para diferenciar dois
grandes grupos de bactrias com base nos diferentes constituintes da parede
celular. O procedimento de colorao de Gram distingue entre grupos Gram
positivos e Gram negativos por colorao destas clulas vermelho ou violeta. A
bactria Gram positiva mancha a violeta devido presena de uma camada
espessa de peptidoglicano nas paredes celulares, que retm o cristal violeta
com estas clulas so coradas. Alternativamente, a bactria Gram negativa
mancha vermelho, o que atribudo a uma parede de peptidoglicano mais fino,
que no retm o cristal violeta durante o processo de descolorao.

Aprender a preparar esfregao de bactrias;

Realizar a tcnica de Colorao de Gram;
Aprender o fundamento do mtodo de colorao de Gram;
Comparar a estrutura da parede celular das bactrias Gram-positivas
e Gram-negativas;
Permitir a observao da morfologia bacteriana e fornecer
informaes a respeito do comportamento do seu material celular
diante dos corantes de Gram.

PRTICA 2:
Aprender a preparar diluies seriadas para posteriores anlises
microbiolgicas.

Observaes:

Com o alimento diludo, fica mais fcil encontrar uma placa ideal para se
fazer a contagem de microrganismos;

A homogeneizao das diluies pode ser realizada manualmente (1 minuto,

mas tenta-se sempre evitar este mtodo pela impreciso), com agitador de
tubos (at 1 minuto) ou com stomacher (30segundos a 2 minutos);

No utilizar pipetas cuja capacidade for superior a 10 vezes o volume a ser

medido;

Sempre utilizar uma pipeta para cada diluio;

A mesma pipeta poder ser utilizada para semeadura de diluies de
amostras, desde que se parta da maior diluio (amostra mais diluda) para a
menor diluio (amostra menos diluda)..
 METODOLOGIA

PRTICA 1: Colorao de Gram para Bactrias

Materiais necessrios usados

- Placa de Petri contendo meio de cultura gar nutriente inoculadas com as
bactrias
- Lmina para microscopia;
- ala de platina;
- tubo contendo soluo salina esterilizada;
- bateria de colorao de Gram (cristal violeta, lugol, lcool acetona, fucsina);
- microscpio, leo de imerso, papel absorvente;
- suporte para lminas para colorao.

Procedimentos feitos
a) Esfregao:
- flambou rapidamente uma lmina de microscopia limpa, nos dois lados,
cortando lentamente a chama do bico de Bunsen;
- identificou o lado da lmina onde foi feito o esfregao;
- flambou a ala de platina at o rubor, e a seguir, deixou esfriar,
conservando-a, todavia perto da chama;
- Preparou uma lmina, depositando no centro da mesma uma gotcula de
gua de suspenso bacteriana;
- tocou a colnia bacteriana isolada, com o auxlio da ala de platina, e
transferiu para a lmina anteriormente preparada.
- espalhou o material com movimentos de rotao da ala de platina, para se
obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme, secou naturalmente.

Esfregao
b) Fixao:
- fixou o esfregao, cortando lentamente a chama por 3 vezes, a fim de que
o material ficasse bem aderente lmina. A fixao sempre feita do lado
contrrio ao esfregao bacteriano.
c) Tcnica:
 - cobriu com 2 gotas de cristal violeta e deixou agir por 1 minuto;
- lavou com gua corrente;
- cobriu com 2 gotas de soluo de lugol por 1 minuto;
- lavou com gua corrente;
- cobriu com 2 gotas de lcool acetona e lavou com gua corrente
imediatamente;
- corou com 2 gotas de fucsina por 30 segundos;
- lavou com gua corrente;
- Por fim, utilizou o bico de Bunsen para secar a lmina.

Lmina secando no Bico de Bunsen.

PRTICA 2:

Materiais usados:
Soluo salina
Amostra de alimentos (fub)
Tubos de ensaio
Pipeta 1mL
Meio de cultura

Metodologia feita:
No caso de alimentos lquidos e slidos, para ensaios de quantificao
(mesfilos, psicotrficos, bolores e leveduras, bactrias lticas, enterococos,
enterobactrias, coliformes totais/termotolerantes, S. aureus, B. cereus, C.
perfringens), recomenda-se que seja de 25g ou 25mL (ISSO 6887-1 (1999),
Midura&Bryant (2001))
Slidos: retirou a quantidade necessria, de todas as partes do alimento (pull)
A Diluio inicial (1:10 ou 10-1) foi feita atravs da adio de m gramas ou mL
para 9xm. Ou seja para 25g de fub, adicionou a 9x25 de diluente, 225mL. O
Diluente estava em temperatura ambiente.
A Diluio seguinte (1:100 ou 10-2) foi feita a partir da diluio inicial.
Transferiu-se 1mL da diluio inicial para um tubo contendo 9mL do diluente. E
a 1:1000/10-3 a partir da diluio 10-2.
10-1: Com a pipeta, pegou 1 ml de gua peptonada com fub e colocou na
placa.
 10-2: Pegou 1 ml de gua peptonada com fub e injetou em um frasco com
gua peptonada e depois colocou na placa.
10-3: Colocou 1 ml do frasco 10-2 em outro frasco com gua peptonada e
depois colocou na placa.
Verteu o gar em todas as trs placas, vedou com fita e encubou.

.
APRESENTAO DOS RESULTADOS

PRTICA 1:
Primeira Placa: Azul/roxo (+) bactrias gram positivo

Segunda Placa/ E. Colli: Azul/ roxo (+) bactrias gram positivo

PRTICA 2:
Aps 1 semana:
 CONCLUSES

PRTICA 1:
Muitas descobertas da cincia, at mesmo as que ocorreram por acidente,
ajudaram muito na sade das pessoas. A descoberta de Hans hoje em dia,
fundamental para a taxonomia (cincia que classifica os seres vivos) e se voc
perguntar a um microbiologista qual a importncia da colorao de Gram,
certamente responder que sem ela seria impossvel diferenciar determinadas
bactrias.
(taxonomia: a cincia que classifica os seres vivos, ela estabelece critrios
para classificar todos os animais e plantas sobre a Terra em grupos de acordo
com as caractersticas fisiolgicas, evolutivas e anatmicas e ecolgicas de
cada animal ou grupo).

O descoramento para mais ou para menos resultante da incorreta

diferenciao pelo lcool-acetona.
A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental na
colorao de Gram. Em culturas envelhecidas, clulas Gram-positivas
freqentemente se tomam Gram-negativas.
Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou da
Gram-negatividade da cultura, uma colorao de Gram paralela
aconselhvel. Para isto, devem-se usar culturas bacterianas conhecidas
como Gram positivas, tal como Staphylococcus aureus e Gram-
negativas, tal como Escherichia coli, como controles.

PRTICA 2:
Os micro-organismos esto intimamente associados com a disponibilidade, a
abundncia e a qualidade do alimento para consumo humano. Os alimentos
so facilmente contaminados na natureza, durante manipulao e
processamento. Aps ter sido contaminado, este serve como meio para
multiplicao de microrganismos, podendo mudar as caractersticas fsicas e
qumicas do alimento, causar sua deteriorao, alm do potencial envolvimento
em casos e surtos de intoxicaes e infeces transmitidas por alimentos.
Assim, se tornam de extrema importncia as anlises microbiolgicas e fsico-
qumicas de alimentos, pois responsvel por certificar a inocuidade,
identidade e qualidade de um gnero alimentcio que ser comercializado ou
identific-lo como fonte de risco potencial contribuindo vastamente para a
sade pblica. Com as contribuies que a microbiologia e anlises fsico-
qumicas de alimentos fornecem para a produo, comercializao de produtos
e sade pblica, esta rea tende a crescer juntamente com as exigncias do
mercado consumidor, que a cada dia mais exige seu abastecimento com
alimentos atestados.
 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
https://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/
http://www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/coloracaodegram.htm
https://en.wikipedia.org/wiki/Gram_stain
https://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/microscopy/gramstain.
html
http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/coloracao-de-gram-passo-passo/