Enzimologia clnica - Introduo

AS ENZIMAS DO PLASMA

Funo fisiolgica:
- renina
- factores de coagulao

Libertadas das clulas resultante:

- do turnover normal da clula (intervalo de referncia)
- da leso celular

DIAGNSTICO ENZIMOLGICO

Determinao da actividade enzimtica no soro pode fornecer informaes ao

diagnstico em relao ao local e extenso da leso

Enzimologia clnica - Diagnstico enzimolgico

DIAGNSTICO ENZIMOLGICO:

Leso celular
Isolada ligeira grave grave grave

Extenso da
leso celular grande grande pequena pequena

Evoluo
lento
rpido rpido rpido
do processo

Subida da
actividade alta alta moderada escassa
enzimtica

D f
Deformao
i t
intensa escassa moderada
d d escassa

Exemplo Hepatite Intoxicao Cirrose Ictercia

aguda por fungos obstrutiva

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Enzimologia clnica - Diagnstico enzimolgico
Quando h leso patolgica celular, h maior libertao de enzimas, havendo
um aumento da sua concentrao srica
Porm o aumento da concentrao srica pode tambm ser devida:
Aumento do turnover celular
Aumento da quantidade ou actividade da enzima
Libertao
Lib t na corrente t sangunea
da
d enzimai devido
d id a hhaver obstruo
b t
dos canais
Diminuio da clearance da enzima no soro
A maioria das enzimas , provavelmente, removida pelo
retculo endoplasmtico
Pequenas molculas (ex.: amilase) so filtradas pelo glomrulo

a (%)
As condies do ensaio tm de estar
Actividade enzimtica
optimizadas
ti i d e padronizadas
d i d d de fforma
a fornecer resultados fiveis e 100
reprodutveis Desnaturao
os valores de referncia dependem Temp.
ptima
das condies do ensaio:
temperatura (factor de converso
especfico da enzima) Acelerao
da velocidade
variaes fisiolgicas de reaco
Temperatura

Enzimologia clnica - Diagnstico enzimolgico

Uma desvantagem do uso de enzimas no diagnstico de leses tecidulares
a falta de especificidade para um tecido particular ou tipo de clula
Muitas enzimas existem em mais do que um tecido aumento
pode reflectir leso de qualquer um dos tecidos

os diferentes tecidos podem conter (e libertar quando lesados) duas ou mais

enzimas em propores diferentes
algumas enzimas existem sob a forma de isoenzimas (muitas vezes
caractersticas de um determinado tecido)

Aps uma leso do tecido, a actividade da enzima intracelular aumenta no

soro em proporo leso celular
celular, diminuindo a sua concentrao
proporcionalmente depurao da enzima importante considerar o tempo
de intervalo entre a leso celular e a colheita
Se a colheita for muito cedo, pode a enzima ainda no ter chegado
corrente sangunea
Se a colheita for muito tarde, pode a enzima j ter sido totalmente
eliminada

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Enzimologia clnica - Diagnstico enzimolgico
Tempos mdios de vida no plasma de algumas enzimas de uso corrente no
diagnstico:

ENFARTE DE MIOCRDIO
GOT 175 horas U/I
GPT 4710 horas
700
LDH1 (HBDH) 113 60 horas 600
LDH5 10 2 horas 500
LDH
CK Aprox. 15 horas 400

AP 3-7 dias 300

CK HBDH
-GT 3-4 dias 200
100
Amilase 3-6 dias
Lipase 3-6 dias 1 2 3 4 5 6 7 8
Dias
HBDH - LDH1 tem maior actividade GPT
cataltica com a -hidroxibutirato GOT
(como substrato) do que com o S o LDH e o HBDH permite diagnosticar aps
lactato (maior actividade com as
outras isoenzimas), logo recebe o o 5/6 dia
nome de -hidroxibutirato
desidrogenase (HBDH)

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

FOSFATASE ALCALINA (ALP)
Enzima presente em elevadas concentraes no fgado, ossos (osteoblastos),
placenta e intestino

Causas de aumento srico:

Fisiolgico:
Fi i l i - gravidez
id (lti
(ltimo trimestre)
ti t )
- infncia
Patolgico: - doena de Paget (aumento da actividade osteoblstica)
- colestase
- cirrose
- tumores sseos
- doena inflamatria do intestino, ....

Ateno idade da pessoa

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 Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
FOSFATASE ALCALINA (ALP) (cont.)
Determinao da fosfatase alcalina
MTODO
P-nitrofenil fosfato + H2O p-nitrofenol + fosfato
ALP
- determinao
d t i cintica
i ti a pH
H alcalino
l li
- p-nitrofenol tem uma absoro mxima a 405 nm
- o aumento da absorvncia directamente proporcional actividade de
ALP na amostra

Intervalo de referncia (adulto): 20-70 U/L (30C)

Determinao de isoenzimas (permite determinar o tecido de origem da

enzima)

Fonte da enzima %inibio calor

Fgado 60
sseo 90
Intestino 60
Placenta 0
Carcinoma 0

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

FOSFATASE CIDA (ACP)
Enzima presente em elevada concentrao na glndula prosttica, mas tb nos
GV, plaquetas, ossos, fgado e bao

Causas de aumento srico:

A concentrao aumenta em 20% dos doentes com tumores confinados
glndula prosttica.
A concentrao est elevada em 80% dos doentes com metstases,
sendo usado como um marcador tumoral
Alguns casos de prostatite
Hipertrofia prosttica benigna
Doenas dos ossos
trombocitmia

Retirar a amostra para anlise antes do exame clnico,

clnico visto que o exame
realizado por toque rectal que pode originar libertao de ACP na
circulao, produzindo um aumento passageiro da actividade enzimtica.

uma enzima pouco estvel:

transportar rapidamente para o laboratrio, manter o soro arrefecido at
a realizao da anlise.
A pH acima de 6 inactivada (aconselhvel adicionar um estabilizador-
cido)

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 Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
FOSFATASE CIDA (ACP) (cont.)
Mtodos de determinao da fosfatase cida

Amostra: Soro e plasma

heparinizado. O oxalato e
detergente
g inibe a enzima.
Rejeitar amostras hemolisadas

Intervalo de referncia:
0,5 - 1,9 U/L

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

ASPARTATO AMINOTRANSFERASE (AST ou GOT) e ALANINA
AMINOTRANSFERASE (ALT ou GPT)
Designadas por transaminases. Ambas amplamente distribudas pelo
organismo. A concentrao de GPT menor em todos os tecidos.

Causas de aumento srico da GOT:

Hepatite aguda e necrose do fgado
Hipoxmia severa dos tecidos

Enfarte de miocrdio
Doena muscular esqueltica
Colestasis

Fisiolgico (neonatal)
Outras doenas
do fgado
g
Pancreatite
Hemlise

A GPT plasmtica est aumentada em igual extenso em doenas do fgado (na

hepatite a GPT pode ultrapassar a GOT), mas em menor extenso em outras
condies. O ndice de Ritis (GPT/GOT) normalmente inferior a 1, torna-se maior
que a unidade nesta situao (principalmente hepatite de origem viral).

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Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
ASPARTATO AMINOTRANSFERASE (AST ou GOT) e ALANINA
AMINOTRANSFERASE (ALT ou GPT) (cont.)
Mtodos de determinao da GOT (no tem isoenzimas) e GPT
Amostra:
GOT - soro (preferido) ou plasma (no usar anticoagulantes com amnia).
Rejeitar amostras hemolisadas
hemolisadas.
GPT - O oxalato, heparina e citrato no inibem a actividade enzimtica mas
podem introduzir uma pequena turvao.
estvel no soro durante 3 dias temperatura ambiente e 1
semana a 4C.
- a urina tem pouca ou nenhuma actividade e no recomendada

Intervalo de referncia
GOT: Adulto: 8 - 33 U/L (37C)

GPT: 4-36 U/L (37C)

Recm-nascido e crianas: 2x superior ao adulto (normaliza ao

fim de 6 meses de vida)

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

ASPARTATO AMINOTRANSFERASE (AST ou GOT) e ALANINA AMINOTRANSFERASE
(ALT ou GPT) (cont.)
Mtodos de determinao da GOT (no tem isoenzimas) e GPT (cont.)

COO- COO-
C O H3N+ C H
COO- COO-
CH2 CH2 O
+ C
+ H3N+ C H
CH2 Aminotransferase CH2 R
R
COO - COO-
-cetoglutorato aminocido glutamato -cetocido

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Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
ASPARTATO AMINOTRANSFERASE (AST ou GOT) e ALANINA AMINOTRANSFERASE
(ALT ou GPT) (cont.)
Mtodos de determinao da GOT (no tem isoenzimas) e GPT (cont.)

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

ASPARTATO AMINOTRANSFERASE (AST ou GOT) e ALANINA AMINOTRANSFERASE
(ALT ou GPT) (cont.)
Mtodos de determinao da GOT (no tem isoenzimas) e GPT (cont.)

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Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
-GLUTAMIL TRANSPEPTIDASE (-GT)
Encontra-se em concentraes elevadas:
Fgado
Rins
Pncreas

Causas de aumento srico da -GT:

Colestase
Doena heptica de origem alcolica

Hepatite
Cirrose
Pancreatite

Ingesto
g excessiva de lcool (p
(pode manter-se at 3 a 4 semanas aps
p a
suspenso da ingesto, mesmo na ausncia de leso heptica) -
existem excepes

Importante indicador da disfuno heptica, podendo apresentar valores

elevados em colestases, antes dos valores da fosfatase alcalina estarem
elevados.

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

-GLUTAMIL TRANSPEPTIDASE (-GT)
Determinao da -GT:
Princpio da anlise -
-GT
-glutamil-p-nitroanilina + glicilglicina -glutamilglicilglicina + p-nitroanilina
pH=8,25
H H
N

p-nitroanilina (405 nm)

N
O O

Intervalo de referncia:
Mulher: 1-24 U/L (37C)
Homem: 2-30 U/L (37C)

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 Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

LACTATO DESIDROGENASE (LD)
Esta enzima existe nos tecidos do corpo sob a forma de um tetramero
Existem dois monmero: H e M que se podem combinar em diferentes
propores originando cinco isoenzimas.

ISOENZIMAS DA LACTATO DESIDROGENASE E SUA DISTRIBUIO

Isoenzima 1 2 3 4 5

Subunidades H4 H3M H2M2 HM3 M4

Soro normal + ++ + vestgios vestgios

Msculo
+++ +++ Vestgios - -
+ = presente; cardaco
- = ausente Eritrcito + + +/-
/ vestgios vestgios
Fgado - - - + +++
Msculo
- - - + +++
esqueltico
Rim ++ ++ + vestgios vestgios

Determina-se a concentrao da LD quando se suspeita de enfarte de

miocrdio e no diagnstico de crise hemoltica na anemia falsiforme.

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Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
LACTATO DESIDROGENASE (LD)
Aumento da actividade da LDH
Leso grave:
- fgado
- rins
- msculos

Anemias:
- megaloblsticas
- hemolticas

Determinao da LD:
Amostra - soro (preferido) ou plasma (alguns anticoagulantes como o
oxalato interferem com a reaco). Rejeitar amostras hemolisadas. A
estabilidade enzimtica varia com a temperatura (varia com as
isoenzimas). A congelao resulta em perda de actividade.

Princpio da anlise -
CH3 CH3
LDH
C=O + H+ + NADH CHOH
+ NAD+
COOH COOH
piruvato L-lactato

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

LACTATO DESIDROGENASE (LD) (cont.)
Determinao da LD :

Intervalo de referncia: os valores da actividade da LD no soro depende

da reaco, tipo de mtodo e parmetros experimentais
120-240 U/mL (adulto a 25C) (mtodo usado nas aulas
prticas)

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Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
LACTATO DESIDROGENASE (LD) (cont.)
Determinao das isoenzimas da LD:

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

CREATINA CINASE (CK)
A molcula activa de CK constituda por um dmero de dois distintos
monmeros (M e B)

Esto descritas 3 isoenzimas:

BB - existem p
principalmente
p no crebro e tiride. A sua
concentrao srica normal baixa e a subida pequena
mesmo em casos de acidente vascular cerebral.
MM - a isoenzima que normalmente est presente em maior
quantidade no soro, tendo como origem o msculo esqueltico.
MB - cerca de 30% desta isoenzima encontra-se no msculo
cardaco.

Causas de aumento da creatina cinase

Enfarte
E f t d de miocardio
i di

Aps uma cirurgia

Trauma a nvel do msculo esqueltico
Exerccio severo

Fisiolgico (neonatal)

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Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
CREATINA CINASE (CK) (cont.)
Determinao da creatina cinase
Amostra - soro (preferido) que deve ser separado rapidamente, plasma
(com heparina, devido a que outros inibem a enzima), fludo
cerebrospinal e lquido amnitico.
O soro deve ser armazenado no escuro a 4C ou -20C se a anlise
no for realizada de imediato
imediato.
Princpio da anlise -
Oliver (mtodo cintico) - pH=6,8
pH=9,0
creatina + ATP creatina fosfato + ADP
CK, Mg2+
pH=6,8
ATP + glucose glucose-6-fosfato + ADP

glucose-6-fosfato + NADP+ 6-fosfogluconato + NADPH + H+

A taxa de aumento na absorvncia a 340 nm a medida da actividade da CK

presente na amostra.

Intervalo de referncia:Homem - at 160 U/L

Mulher - at 130 U/L
Recm-nascidos - 2 a 3 vezes o valor do adulto

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

CREATINA CINASE (CK) (cont.)
Determinao das isoenzimas da creatina cinase

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Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
AMILASE (AMS)
Enzima presente nas glndulas salivares e nas secrees excrinas do
pncreas

Causas de aumento da amilase

Pancreatite

lcera duodenal perfurativa

Obstruo intestinal
Outros distrbios abdominais agudas

Doenas a nvel das glndulas salivares (clculos, inflamaes,...)

Macroamilasemia (diminuio de clearance aps complexao com uma
Ig)

Determinao da amilase
Amostra - soro ou plasma com heparina (no usar anticoagulantes que
actuem baseados na quelatao, como citrato, oxalato e EDTA;
porque a amilase necessita de ies clcio e tambm cloreto).
- soro e urina, sem contaminao bacteriana, no perdem actividade
enzimtica da amilase durante 1 semana temperatura ambiente
ou vrios meses a 4C.

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

AMILASE (AMS) (cont.)
Determinao da amilase
Princpio da anlise -
AMS -glucosidase
maltopentose maltotriose + maltose 5-glucose + 5 ATP
Hexocinase
5 l
5-glucose + 5 ATP 5-glucose-6-fosfato
5 l 6 f f t + 5 ADP + 5 NAD
G6PD
5,6-fosfogluconato + 5 NADH (340 nm)

Intervalo de referncia:
Soro - inferior a 1800 U/L
Urina - inferior a 5000 U/24
horas
Recm-nascidos - 18% do
valor do adulto

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 Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise
5-NUCLEOTIDASE (5-NT)
Causas de aumento da 5-NT
Doenas hepato-biliares
Malignidades

Determinao da 5-NT
Amostra - soro

Princpio da anlise - 5-NT

5-AMP Adenosina + Pi
ADse
Adenosina Inosina + NH3

No existe mtodo de referncia

(f f t
(fosfatases cidas
id e alcalinas
l li
hidrolisam os fosfatos de estr):

5-AMP Adenosina + Pi

(usar Ni+ inibe a aco da 5-NT)

Intervalo de referncia: 0-11 U/L (37C)

Enzimologia clnica - Enzimas com valor diagnstico e seus mtodos de anlise

LIPASE (LPS)
til no diagnstico de pancreatite. No entanto os mtodos de determinao
no a determinam de forma exacta e reprodutvel.

Determinao da LPS
Amostra - soro ou fludo duodenal (armazenados a 4C at serem analisados).
Evitar estar sempre a refrigerar e a degelar.
- normalmente no encontrado na urina.

Princpio da anlise LPS

triglicerdeos -monoglicerdeo + 2 cidos gordos

A lipase actua apenas sobre a interface estr-gua. Logo os substractos

devem estar sob a forma de emulses. Uma emulso no adequada permitir
a actuao de enzimas no lipases.

Intervalo de referncia: 2-7,5 U/mL (aps 60 anos aumenta em cerca de 20%)

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