Universidad Autnoma de Yucatn

Facultad de Ingeniera Qumica

Reporte 2

Fermentacin Lctica

Procesos de fermentacin en la industria alimentaria

Profesor (a):

Dra. Patricia Zapata

Integrantes

Arrieta Hernndez Vanessa

Duarte Mndez Joaqun

Heredia Ceballos Cristina

Montejo Briceo Julin

Oliveros Baz Liliana

Vela Can Raymundo

Ingeniera en Alimentos/ Ingeniera Qumica Industrial

 Fecha: 31 de octubre de 2017

INTRODUCCIN

La fermentacin lctica es causada por algunos hongos y bacterias. El cido lctico ms

importante que producen las bacterias es el lactobacillus. Otras bacterias que produce el
cido lctico son: Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus cerevisiae, Estreptococo lactis
y Bifidobacterium bifidus.

La presencia del cido lctico, producido durante la fermentacin lctica es responsable del
sabor amargo, y de mejorar la estabilidad y seguridad microbiolgica del alimento. Este
cido lctico fermentado es responsable del sabor amargo de productos lcteos como el
queso, yogurt y el kefir. El cido lctico fermentado tambin da el sabor amargo para
fermentar vegetales, tales como los tradicionales pikles, y sauerkraut. El azcar en las coles
son convertidas en cido lctico y usado como preservante.

El yogur se hace fermentando la leche con bacterias compatibles, principalmente

Lactobacillus bulgaricus y Estreptococo thermophilus. El yogurt fermentado fue inventado
probablemente, por tribus balcnicas hace miles de aos. El yogur era solo un alimento de
Europa Oriental hasta los aos 1900s, cundo el bilogo Mechnikov cre la teora de que
esas bacterias lactobacillus del yogur eran responsables de la longevidad de las personas de
Bulgaria. La leche azucarada o lactosa son fermentadas por estas bacterias y se forma el
cido lctico el cual da origen a la formacin de la cuajada. El cido tambin restringe el
crecimiento de bacterias que causan descomposicin del alimento. Durante la fermentacin
del yogur, se generan algunos sabores, que le dan especial caracterstica. El yogur puede ser
hecho en casa, usando un yogur vivo como iniciador. Para hacer su propio yogur, siga el
siguiente procedimiento. Lleve la leche a su punto de ebullicin y enfrela, bajando la
temperatura a rangos entre 40-45C. Vierta esta leche en un recipiente esterilizado y ponga
100 ml de yogur vivo por cada litro. Mezcle con una cuchara esterilizada, e incubar a 40-
44C durante 4 a 6 horas o hasta que el yogur est listo. Coloque el yogur en el refrigerador.
Si usted trabaja, bajo condiciones higinicas, usted puede usar su propio yogur como un
iniciador para los prximos lotes.
OBJETIVO

Obtener un producto de la fermentacin de leche (yogurt) por medio de una fermentacin

lctica.

Determinar la cantidad de bacterias presentes por medio de siembra en placa, visualizar la

morfologa de las bacterias y cuantificar la presencia de los azcares en el producto
obtenido.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

METODOLOGA

Inoculacin de la leche con el yogurt, siembra e incubacin de las disoluciones -1, -2, -
3.

1. Se coloc el mechero en la toma de gas y se encendi cuidadosamente, despus se

coloc el matraz estril cerca del mechero y el yogurt comercial, para as adicionar
los 960 mL de leche al matraz de 2L.

2. Se tom con la pipeta 24 mL del yogurt comercial y se aadi a la leche.

3. Se extrajo 15 mL de la muestra del da 17 de octubre de 2017, una vez inoculado la

leche con el yogurt Activia se agit para la homogenizacin para proseguir con la
extraccin de una muestra de la solucin con una pipeta esterilizada, para
posteriormente depositarla en un tubo Corning de 15 ml.

4. En este paso se prepararon las disoluciones -1, -2, -3 de la muestra extrada y se

deposit en un tubo Corning, se tomaron 100 L y se deposit en un tubo
eppendorf, posteriormente al mismo tubo se le adiciono 900 L de la solucin
salina, para obtener la disolucin 101 , una vez obtenida dicha disolucin se
tomaron 100 L de esta para adicionarlos en otro tubo eppendorf vaco, al cual se le
adicionaron seguidamente 900 L de la solucin salina, obteniendo as la disolucin
102, de la cual se repiti el proceso de tomar 100 L para adicionarlos en otro
tubo eppendorf al cual finalmente se le adicionaron 900 L de la solucin salina,
obteniendo la disolucin 103, una vez finalizadas las diluciones se llev la muestra
del tubo Corning del da 17 de octubre del 2017 al congelador para evitar en ella la
fermentacin y tomarla como tiempo inicial para el posterior anlisis de
concentracin de azucares reductores y pH, el matraz de 2 litros con los 960 mL de
leche inoculada con 24 ml de yogurt Activia, se llev a un rincn del laboratorio
para dejarlo fermentar por 1 da a la temperatura ambiente del laboratorio de
microbiologa, posteriormente se refrigero en un cuarto frio de la nave de alimentos
hasta la siguiente sesin, que correspondera al da 19 de octubre de 2017.
 5. Siembra en cajas Petri de las disoluciones -1, -2, -3: se tomaron 100 L de la
disolucin -1 mediante la Micropipeta de 20-200 L y se adicionaron a una caja de
Petri con Agar MRS, se tom el asa de siembra y se pas por la flama del mechero
aproximadamente 10 segundos para asegurar su esterilizacin, se esper
aproximadamente entre 1 y 2 minutos, y se esparcieron mediante el asa los 100 L
sobre toda la superficie de la caja de Petri con agar MRS, se tap y marc la caja de
Petri con la disolucin respectiva para su identificacin, posteriormente se repiti
todo el proceso anterior para la siembra de las disoluciones -1 y -2.

6. Incubacin en anaerobiosis a 37 C por 48 horas: se tom un frasco de vidrio y

se le introdujo y acomodo algodn en la superficie del fondo, posteriormente se
introdujeron y acomodaron las cajas de Petri a incubar de casi todos los equipos,
una vez acomodadas las cajas de Petri y el vaso con agua en la superficie del fondo,
se introdujo dentro del frasco y coloco sobre las cajas de Petri, una vela la cual fue
encendida inmediatamente, posteriormente se introdujo una pastilla de alka seltzer
en el vaso con agua y se cerr el frasco hermticamente con su tapa, se observ que
la vela se apague indicando as el consumo de oxgeno y creacin de un medio
anaerobio, se prosigui a introducir el frasco en un horno a 37 C por 48 horas.

7. Determinacin del nmero de colonias: pasadas las 48 horas se sac el frasco con
las cajas de Petri del horno a 37 C, se destapo y sacaron de este las cajas de Petri,
posteriormente se observaron y determinaron las unidades formadoras de colonias,
todo esto se anot y lo veremos en la parte de resultados.

Siembra e incubacin de las disoluciones -7, -8, -9.

1. Extraccin de la muestra del da 19 de octubre del 2017: Se encendi el mechero

Fisher, se acerc el matraz de 2 L con el yogurt a este, y se prosigui a extraer con
la ayuda de una probeta una muestra que se deposit en un tubo Corning de 15 ml,
siendo esta muestra tapada y marcada con la fecha del dia 19 de octubre de 2017, se
midi el pH.
2. Preparacin de las disoluciones -7, -8, -9: de la muestra del 19 de octubre de 2017
extrada y depositada en el tubo Corning de 15 ml, se tomaron 100 L y se
elaboraron las disoluciones 101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 ,
107 , 108 , 109 segn el procedimiento descrito para la preparacin de las
disoluciones -1,-2, -3, finalizadas las diluciones se llev la muestra, al congelador
para evitar que siga la fermentacin y tomarla como el tiempo final, para el
posterior anlisis de concentracin de azucares reductores y pH.

3. Siembra en cajas Petri de las disoluciones -7, -8, -9: se tomaron 100 L de la
disolucin -7 mediante la Micropipeta de 20-200 L y se adicionaron a una caja de
Petri con Agar MRS, se tom el asa de siembra y se pas por la flama del mechero
aproximadamente 10 segundos para asegurar su esterilizacin, se esper
aproximadamente entre 1 y 2 minutos, y se esparcieron mediante el asa los 100 L
sobre toda la superficie de la caja de Petri con agar MRS, se tap y marco la caja de
Petri con la disolucin respectiva para su identificacin, posteriormente se repiti
todo el proceso anterior para la siembra de las disoluciones -8 y -9.

4. Incubacin en anaerobiosis a 37 C por 48 horas: se tom un frasco de vidrio y

se le introdujo y acomod algodn en la superficie del fondo, posteriormente se
introdujeron y acomodaron las cajas de Petri a incubar de casi todos los equipos,
una vez acomodadas las cajas de Petri y el vaso con agua en la superficie del fondo,
se introdujo dentro del frasco y coloco sobre las cajas de Petri, una vela la cual fue
encendida inmediatamente, posteriormente se introdujo una pastilla de alka seltzer
en el vaso con agua y se cerr el frasco hermticamente con su tapa, se observ que
la vela se apague indicando as el consumo de oxgeno y creacin de un medio
anaerobio, se prosigui a introducir el frasco en un horno a 37 C por 48 horas.

5. Determinacin del nmero de colonias: En este paso solo se determin el nmero

de colonias en la disolucin de -8, ya que las placas se contaminaron.
 6. Determinacin de azucares y pH

Con las muestras de la leche inoculada con el yogurt se realiz una dilucin 1:50 con agua
destilada. Despus se tom 100 L de la dilucin, y se coloc en un tubo eppendorf, para
as aadirle 100 L de reactivo de DNS.

Despus se colocaron las muestras en un bao de agua caliente a 94 C por 5 min, una vez
transcurrido el tiempo, se colocaron las muestras en un bao de hielo durante 10 minutos.
Luego se aadi a cada tubo con muestra 1mL de agua destilada y posteriormente se agit.
Finalmente se leyeron las muestras a 540 nm y se anotaron los resultados.

7. Observacin de la morfologa de las clulas bacterianas

Tomar con el asa de platino una pequea cantidad de la muestra en un portaobjeto y aadir
dos gotas de xileno a las muestras para eliminar la grasa y extenderlas con el asa. Dejar que
sequen las muestras

Una vez secas pasar por el mechero las muestras para fijar las muestras al

Portaobjetos luego plicar 2 gotas del colorante cristal violeta durante 2 min, para
posteriormente lavar los portaobjetos con abundante agua destilada hasta que no quede
colorante.

Cubrir las muestras con cubreobjetos y observar al microscopio.

CLCULOS

1. Realizar la curva de calibracin para la glucosa.

2. Presentar los datos de R2 la ecuacin de la recta y la desviacin estndar de los duplicados
de la curva patrn.
3. Obtener la Absorbancia para cada muestra problema e interpolar en la curva para obtener la
cantidad de glucosa en cada una de las muestras problemas.
RESULTADOS Y DISCUSIONES

Resultados sesin 1 martes 17 de octubre de 2017: Inoculacin y siembra en placa.

En esta sesin se procedi a verter el yogurt en el litro de leche, para empezar el proceso de
fermentacin, y con la mezcla, y con esta se realizaron disoluciones a -1, -2, -3 para
sembrar en la placa para realizar el conteo de colonias pasadas las 48 horas.
Se determin el pH de la muestra leche-yogurt siendo de 6.65
Resultados sesin 2 jueves 19 de octubre de 2017: Conteo en placa, obtencin de
muestra y siembra en placa.
Pasadas las 48 horas de la siembra, se procedi a contar las colonias formadas en las
disoluciones de -1, -2, -3, donde se obtuvo el siguiente resultado.
Disolucin Colonias

596
-1

-2
166 157

85 77
-3
116 49

El pH determinado en la muestra ya fermentada en esta sesin fue de 4.35.

En la presente sesin se procedi a hacer disoluciones a -7, -8, -9 con la muestra ya
fermentada, para realizar de nuevo el conteo de placa.
Resultados sesin 3 martes 24 de octubre de 2017: Conteo celular, observacin
microscpica y determinacin de azcares reductores.
De nuevo, se esper que pasaran 48 horas se la siembra, se procedi a contar las colonias
formadas en las disoluciones de -7, -8, -9, donde todas las cajas de Petri, de vieron
contaminadas con hongo, sin embargo, la muestra de disolucin a -8 contena menos
contaminacin, por lo cual pudimos contar las colonias.

-8
38

Esta sesin, se determin la concentracin de azcares reductores, los estndares para la

curva de calibracin fueron los utilizados en la prctica de vino de frutas, donde se obtuvo
los resultados que se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Medicin de la curva de calibracin de glucosa.

Concentracin Volumen final L de DNS Absorbancias

de glucosa [g/L] L

1.5 100 100 0.442

1.2 100 100 0.312

0.9 100 100 0.154

0.3 100 100 0.115

0.0 100 100 0.042

Luego se procedi a tomar las absorbancias de las muestras de la sesin 1 y 2, donde

tenamos el producto sin fermentar y el producto fermentado, como se muestra en la tabla
3.
Tabla 3. Anlisis de las muestras problema.

Muestra Tiempo Absorbancia

problema transcurrido

Muestra sin 0 horas 0.426

fermentar del
da 17 de
octubre

Muestra 48 horas 0.217

fermentada del
da 19 de
octubre

Creacin de la curva de calibracin de la glucosa.

Curva de calibracin de la glucosa

0.45
y = 0.0961x - 0.0789
0.4
R = 0.9562
0.35

0.3

0.25
Abs

0.2

0.15

0.1

0.05

0
1 2 3 4
Muestras

Los resultados de la curva se ajustan a una grfica lineal, por encontrarse un coeficiente de
correlacin de 0.9562 que est muy cercano a la unidad, como se puede apreciar en la
grfica 1.
Los resultados de las absorbancias de nuestras muestras ya fueron mencionados con
anterioridad, ahora para encontrar la concentracin de la glucosa en cada muestra,
utilizaremos la ecuacin de la recta que es:
= 0.0961 0.0789
Y es igual al valor de las absorbancias para cada muestra, por lo tanto, se resolver para
cada caso:
Muestra 17 de octubre
0.426 = 0.0961 0.0789

= 5.2539

Muestra 19 de octubre
0.217 = 0.0961 0.0789

= 3.07908

Entonces se puede concluir

Muestra Resultados
17 de octubre (sin fermentar) pH: 6.65
Colonias: Se tomo en cuenta la disolucin
de -3 donde se obtuvo 120,000 UFC/ml
Glucosa: 5.2539 g/L

Muestra Resultados
19 de octubre (fermentada) pH: 4.35
Colonias: Se tomo en cuenta la disolucin
de -8 donde se obtuvo 38109 UFC/ml
Glucosa: 3.0708 g/L
 Tiempo vs concentracin y pH
7

4
Concentracin de glucosa en
3 g/L
pH
2

0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo

CUESTIONARIO
1. Investiga acerca del proceso de yogurt a nivel industrial
-Recepcin de materia prima: Seleccionar leche fresca de buena calidad sin antibiticos,
sin mastitis.
-Homogenizacin: Se adiciona leche en polvo para tener leche rica en grasa.
- Pasteurizacin: Se realiza de 85 a 90C con un perodo de retencin de 5 minutos. Este
tratamiento trmico es algo ms intenso que el aplicado a la leche para consumo, se
consigue mayor viscosidad y menor tendencia a la liberacin del suero, y se eliminan
bacterias.
- Inoculacin y fermentacin: Se realiza despus del tratamiento trmico, bajando la
temperatura a 45C. En este momento se adiciona el fermento lcteo que est conformado
por bacterias lcticas productoras de cido lctico y aroma. La incubacin se realiza durante
4 a 6 horas manteniendo la temperatura entre 45 y 40C. Despus de ese tiempo, se hace un
anlisis de acidez y si es ptima (4.5 a 4.7), la fermentacin se llev a cabo y puede iniciar
el enfriamiento del yogurt
-Batido: Se hace para que el producto tenga una consistencia adecuada.
- Adicin de sabores y frutas (opcional): se efecta al terminar la incubacin; se rompe el
gel mediante una agitacin suave, se baja la temperatura a 20C y se le adiciona la
mermelada de frutas, azcar, colorantes, esencias, saborizantes y conservantes.
- Envasado y almacenamiento: Se coloca en los recipientes, para posteriormente refrigerar
a 4C, quedando el producto listo para su comercializacin.

2. Discutir el cambio de PH y decir los factores involucrados

La reduccin del pH, es debido a la produccin de cido lctico, este causa la

desestabilizacin micelar de la caseina a pH 5.1 a 5.2 ocurriendo una completa coagulacin
a pH de 4.6. al alcanzar este pH la casena forma grandes conglomerados que atrapan la
grasa y el suero y etas son las responsables de las altas viscosidades del producto. Al pH
final deseado la leche coagulada se enfra rpidamente de 4 a 10C para reducir el proceso
de fermentacin.
El producto antes de la fermentacin obtuvo un pH de 6.65 y al final de la fermentacin
lleg a un pH de 4.35 a causa del tiempo en que se dej fermentar, por lo cual de acuerdo a
la norma CODEX STAN 243-2003 est entre los parmetros permitidos, ya que una baja
acidez es un indicativo de insuficiencia de bacterias lcticas para la fermentacin. Por otro
lado, la leche fermentada debe tener los contenidos de calcio similares a los de la leche;
valores menores indican una posible adulteracin del producto (Profeco).

3. Discutir la variacin de los azcares reductores y explicar los cambios.

Dado que la Lactosa es un azcar inaccesible para muchos microorganismos la
generacin de glucosa y galactosa a partir de esta la hace aprovechable para un mayor
nmero de ellos, el aumento de azcares reductores favorece las reacciones de Maillar, no
obstante para este producto no lo favorece, por ello al fermentar la leche que contienen
un porcentaje moderado de azcares reductores resulta ptimo para que consiga una
consistencia deseable para el consumidor, de acuerdo a los resultados obtenidos la
glucosa fue consumido por el microorganismo alrededor de un 15% lo suficiente como
para generar el cido lctico en donde alcanz el pH mencionado anteriormente, al
generar el cido lctico suficiente este es responsable de la coagulacin, firmeza y sabor
cido del yogurt pero tambin funciona como inhibidor de microorganismos patgenos
como la Salmonella y el Staphylococcus aueus. (Biotecnologa, 2004)
4. Describir y discutir las observaciones al microscopio.
Durante la observacin en el microscopio se pudieron observar, a causa del colorante
utilizado, un tipo de microorganismo alargado en forma de bastn no mvil la cual tiene
la caracterstica del Lactobacillhum Delbrueckii, bulgaricus, este bacilo es
homofermentativo y es capaz de fermentar fructosa, galactosa, glucosa y lactosa, la cual
este ltimo es el azcar predomnate de la leche y por ende de este producto, tiene la
habilidad de crecer a pH inferiores de 5.0 y presenta metabolismo fermetativo aun en
presencia de aire.

BIBLIORAFA
Alicia Hernandez. (2003). Microbiologa Industrial. Costa Rica: Euned. (Introduccin)
Biotecnologa Alimentaria Garca Garibay, Quintero Ramrez, Lopez Mungua LIMUSA,
Noruega Editories. 2004
CODEX STAN 243-2003. NORMA DEL CODEX PARA LECHES FERMENTADAS
Lzaro Mario Mendoza Romero. Proceso de Elaboracin de Yogur Batido. (2007)
https://www.tempeh.info/es/fermentacion-lactica.php
Profeco. Laboratorio Profeco aporta. 2006.