REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 26, No.
1 DE 1997
DETERMINACIN DE VITAMINA A POR CROMATOGRAFA LQUIDA
DE ALTA EFICIENCIA (CLAE) EN BIENESTARINA CRUDA
Doris Mabel Gartner C Patricia Restrepo*
Recibido marzo -V97 - Aceptado septiembre 9/97
Keywords: vitamin A, HPLC, valida-
tion, fiour.
RESUMEN
En el presente trabajo se valida una
tcnica de Cromatografa Liquida de
Alta Eficiencia (CLAE) para la deter-
minacin y cuantificacin de la vita-
mina A en Bienestarina cruda (mezcla
alimenticia infantil producida por el
Instituto Colombiano de Bienestar Fa-
miliar. ICBF).
En primer lugar se lleva a cabo la
validacin del mtodo analtico, me-
diante el uso de patrones de concentra-
cin conocida de palmtato de vitami-
na A, para lo cual se determina la
linealidad, sensibilidad (lmites de de-
teccin y cuantificacin), la precisin
y la exactitud del mtodo.
En segundo lugar se determinan las
mejores condiciones de extraccin de
la vitamina, como son peso de la mues-
tra, uso de antioxidante y porcentaje
en peso de ste, adicin de a-amilasa:
unidades de actividad en relacin al
peso de muestra, temperatura y tiempo
de actividad enzimtica.
Finalmente se comparan dos mto-
dos de extraccin: el mtodo de extrac-
cin lquido-lquido (utilizado rutina-
*Departamento de Qumica. Facultad de
Ciencias. Universidad Nacional de Colombia,
Apartado Areo 14490 Santaf de Bogot,
Colombia.
riamente en el Laboratorio del ICBF)
con cl mtodo de extraccin slido-
lquido usando columnas Lichrolut.
Todas las variables son estadstica-
mente evaluadas con un anlisis de
varianza de una sola va y con la
prueba de Duncan.
El mtodo utilizado para la determi-
nacin por CLAE de vitamina A, es
lineal entre 1,75 y 8,50 UI, sensible
(con un limite de deteccin 2,73 X 10'*
UI y como lmite de cuantificacin
I.68UI), preciso y exacto. Para la ex-
traccin de la vitamina A de Bienesta-
rina, las mejores condiciones encon-
tradas son: lOg de muestra, 5,0 o 10%
de hidroquinona, 2.0 unidades de acti-
vidad (UA) de a-amilasa/g de muestra,
45 "C y 60 minutos.
La extraccin slido-liquido es ms
exacta, rpida, menos txica y con ma-
yor poder de recuperacin que el mto-
do de extraccin lquido-lquido.
ABSTRACT
In the present work is validated of
the HPLC (High performance Liquid
Chromatography) for determination of
vitamin A in special flour (Bienestari-
na) produced by Instituto Colombiano
de Bienestar Familiar (ICBF) as food
for Children.
In first place was used a commer-
cial standard of vitamin A (palmitate)
of known concentration for valdation
of method: linearity, the sensiblity, the
precisin and exactness.
31
REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 26, No. 1 DE 1997
In second place was studied the im-
prove conditions of vitamin A extrac-
tion; ofthe sample: the best weight of
sample, the best percentage of antoxi-
dant. units of activity of a-amilase, as
well as the temperature and best time
of enzymatic activity,
Finally, two methods of extraction
were compared: the extraction lquid-
liquid with ethyl ether (method used of
routine in the laboratory of ICBF) and
the method of extraction sold-lquid
used the Lichrolut columns. In both
methods were evaluated the precisin,
exactness and the percentage of recu-
peraton.
All the variables were statistically
evaluated with a variance analysis in
one way and with Duncan test.
It was determined that HPLC method
for the cuantifcation of vitamin A, was
linear between 1.75 UI and 8.5 UL sen-
sitive (detection limit of 2.73 X 10"'Ul.
cuantifcation limit of 1.68 UI), pre-
cise and exact. It shouid to use lOg of
sample, 5-10% of hidroquinone in re-
latonship to the weight of sample, as
for the parameters of enzymatic activ-
ity: 2.0 UA (units of enzymatic activ-
ity)/g of sample, 45 C and 60 minutes.
The extraction with Lichrolut is more
exact, rapid. fewer toxic and has more
vitamin A recuperation that method of
liquid-liquid extracton.
INTRODUCCIN
En 1975 el Instituto de Bienestar
Familiar (ICBF) present una formula-
cin la cual dio a conocer con el nom-
bre de Bienestarina. sta es cataloga-
da como una de las mejores mezclas
alimenticias, definindose como un ali-
ment de alto valor nutricional. con
una formulacin tcnicamente planea-
da que aporta protena con un balance
adecuado de aminocidos esenciales,
contribuyendo tambin con los requc-
rimientos de caloras, minerales y vi-
32
taminas como tiamina, rivoflavna, na-
cna y vitamina A (1). El ICBF produce
dos tipos de Bienestarina: la cruda que
es el resultado de la mezcla de las ma-
terias primas sin tratamiento trmico y
la precocida. la cual es sometida a un
proceso trmico con el fin de disminuir
la carga microbiolgica y prolongar la
vida til del producto,
La vitamina A ha sido determinada
utilizando mtodos biolgicos con bio-
ensayos que miden la actividad del
retinol en los alimentos de origen an-
mal y mtodos fisicoqumicos que mi-
den los carotenoides en trminos de
vitamina A sin determinar la potencia
biolgica (3).
Estos procedimientos utilizan mto-
dos de extraccin seguidos por una sa-
ponificacin y por mtodos fsicos para
separar pigmentos. El mtodo de cuan-
tificacn utlizado se basa en la absor-
cin de luz a 620 nm por el complejo
formado en la reaccin de Carr-price
con la vitamina (7), tcnica utilizada
en el ICBF. La reaccin es rpida y
debe leerse antes de 5 segundos para
impedir lecturas inexactas, por la pr-
dida de color del complejo formado; el
reactivo utilizado en este mtodo (clo-
ruro de antimonio) es altamente corro-
sivo. Adems los volmenes de ter
etlico empleados para la extraccin de
vitamina A, resultan txicos para quien
realiza el procedimiento.
Por la importancia de la vitamina A
en la nutricin de los nios y por la
tcnica utilizada para su determinacin,
se hace necesario desarrollar tcnicas
rpidas, reproducibles y sensibles, que
evalen la calidad nutricional de la
Bienestarina.
La cromatografa Lquida de Alta
Eficiencia (CLAE) es una tcnica rpi-
da, reproducible y cuantitatvamente
sensible para el anlisis de carotenos
y de retinol en alimentos compuestos
por matrices sencillas como jugos de
frutas (4,5). y de algunas matrices a
 REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 26, No. 1 DE 1997
base de almidn como alimentos infan-
tiles (9). En este mtodo se utilizan
diferentes columnas y solventes, iden-
tificando la vitamina por el tempo de
retencin y cuantificndola en forma
ms rpida y precisa que otros procedi-
mientos utilizados para la determina-
cin de vitamina A.
Por las anteriores razones este tra-
bajo tiene como objetvo principal es-
tablecer las tcnicas de extraccin y
determinacin por CLAE de la vitami-
na A en Bienestarina cruda, que es una
matriz muy compleja por su composi-
cin y de la que no se conocen reportes
bibliogrficos de la extraccin ni de-
terminacin cromatogrfica de la vita-
mina.
METODOLOGA
Puesta a punto del mtodo analtico.
Condiciones cromatogrficas del estu-
dio.
Las condiciones cromatogrficas uti-
lizadas (4), para la validacin del m-
todo analtico son:
- Cromatgrafo lquido Merck-Hitachi.
- Fase estacionaria: silicagel (activa-
da, 60;5 mm ) de 12.5 cm de longitud
y 0.4 cm de dimetro int.
- Fase mvil: n-Hexano-isopropanol
(98 : 2).
- Flujo de la fase mvil: 0.5 mL/mn.
- Detector: UV (326 nm).
- Volumen de inyeccin: 20mL.
- Atenuacin 4.
Estas condiciones se mantienen
constantes durante todo el estudio.
Determinacin de la sensibilidad y la
linealidad.
Con un patrn de palmitato de
retinol (que tiene el mismo comporta-
miento cromatogrfico de la vitamina
A) de rSOO.OOO UI (SIGMA) se prepa-
ra una curva de calibracin con puntos
desde 18 UI diluyndose sucesivamen-
te a la mitad hasta cuando el rea del
pico corresponda al doble del ruido (se
utiliza la mayor sensibilidad del equi-
po). Cada uno de los puntos se pasa 10
veces, para determinar el rea en cada
concentracin, se determinan adems
la media, la desviacin estndar, el l-
mite superior e inferior de confianza
para cada concentracin y a partir de
estos datos la sensibilidad del mtodo
medante el lmite de deteccin y de
cuantificacin (4) y la linealidad me-
diante el clculo de los lmites de con-
fianza inferior y superior del total del
grfico, el intercepto, la pendiente y el
coeficiente de correlacin, entre los l-
mites establecidos.
Determinacin de la precisin y
exactitud del mtodo.
Un patrn de concentracin 4.5 UI
correspondiente al punto medio de la
porcin lineal de la curva, se pasa por
el equipo 19 veces y se determinan la
media y los lmites de confianza para
los datos obtenidos de la medida del
rea. La precisin se expresa matem-
ticamente como la desviacin estndar
relativa o coeficiente de variacin
(RSD), evaluando la dispersin de da-
tos obtenidos con el estndar de 4,5 UI
en relacin al valor medio. La exacti-
tud se expresa matemticamente como
cl porcentaje del valor medio de los
datos obtenidos en relacin al valor
verdadero, adems se aplica un ensayo
(t) de student a un nivel de 9 5 % de
confianza para encontrar si existen di-
ferencias significativas entre el por-
centaje obtenido experimentalmente y
el 100%.
Puesta a punto del mtodo de extrac-
cin de la vitamina A de la Bienesta-
Debido a que la Bienestarina es un
alimento con una matriz compleja y no
existen reportes bibliogrficos de la
extraccin de la vitamina de dicho ali-
33
REVISTA C O L O M B I A N A DE Q U M I C A , V O L U M E N 2 6 , No, 1 DE 1997
ment, es necesario poner a punto un
mtodo de extraccin que permita obte-
ner la vitamina, en un nivel de concen-
tracin que est dentro del rango lineal
del mtodo analtico, para lo cual se
estudian tres diferentes pesos de mues-
tra inicial de Bienestarina: 5g, lOg,
I5g; se estudia el uso de hidroquinona
como antioxidante al 5. 10 y 15% y la
adicin de a-amilasa (taca diastasa.
Parke Davis and Co.) con el fin de de-
gradar los polisacridos presentes en la
muestra que absorben la vitamina e
impiden su extraccin cuantitativa; se
estudian cuatro niveles de enzima:
O.IUA, l.OUA, 2.0UA, y 5.0UA por
gramo de muestra; tres tiempos: 10,30,
y 60 minutos y cuatro temperaturas de
actividad enzimtica: 20. 37. 45 y 60
"C. Cada uno de los niveles, de cada
variable se estudia dejando constantes
los dems parmetros en los niveles
mximos estudiados, excepto la tempe-
ratura que se mantiene constante a 37
C. Cada determinacin se realiza m-
nimo por triplicado y se evalia estads-
ticamente con un anlisis de varianza
de una sola va, para encontrar s exis-
te diferencia significativa entre las de-
terminaciones. En caso de encontrar
diferencia significativa, se lleva a cabo
la prueba de Duncan para encontrar la
mnima diferencia significativa (dms)
entre los tratamientos estudiados.
Finalmente una vez deabsorbda la
vitamina de la matriz de polisacridos
se realiza una saponificacin con el fin
de separar posteriormente, mediante
extraccin lquido-lquido o slido-
lquido, la vitamina A en forma de al-
cohol de los lpidos saponificables pre-
sentes en la Bienestarina. La saponifi-
cacin se lleva a cabo con KOH alco-
hlico al 1%, a ebullicin durante una
hora.
Extraccin lquido-liquido y slido-
liquido.
Para separar la vitamina A de los
lpidos saponificables, se comparan los
mtodos de extraccin con ter y en
34
columnas de silica gel (Lichrolut marca
Merck): en la extraccin con ter se
realizan cinco extracciones; el extracto
etreo es lavado con agua hasta pH neu-
tro y se seca con sulfato de sodio anhi-
dro. La mezcla se solubiliza en hexano
para ser inyectada al cromatgrafo.
En la extraccin slido-lquido se
utilizan columnas de silicagel de I cm'
de fase estacionaria y una capacidad
total de 3 mL. Una vez saponificada la
muestra se realiza una extraccin con
10 mL de hexano, el total del extracto
obtenido se pasa por la columna de
slica, previamente lavada con 2 mL de
n-hexano, la vitamina es eluida del car-
tucho con 2 mL de una mezcla de n-
hexano-acetato de etilo (1:1) y este ex-
tracto es sometido a anlisis por CLAE.
Determinacin de la precisin y exac-
titud del sistema.
Con el fin de validar el sistema y
comparar los mtodos de extraccin
de la vitamina A de la Bienestarina, se
prepara un placebo de Bienestarina cru-
da, al que se le adiciona una premezcla
de vitaminas y minerales que aportan
2000 UI de palmitato de retinol por
cada I OOg de muestra. Se realizan 10
determinaciones de la extraccin con
ter y 10 determinaciones de la extrac-
cin slido-lquido, teniendo en cuen-
ta los parmetros ajustados de peso de
muestra, peso de antioxidante y las di-
ferentes variables enzimticas. Se cal-
cula la meda poblaconal. la desvia-
cin estndar, la precisin como la
desviacin estndar relativa o coefi-
ciente de variacin y la exactitud como
el porcentaje promedio de recupera-
cin, su desviacin estndar y se apli-
ca una prueba (t), para cada uno de los
mtodos de extraccin.
Comparacin de los mtodos de ex-
traccin lquido-lquido y slido-
lquido.
Para conocer la diferencia de los
mtodos de extraccin y cmo afectan
 REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 26, No. 1 DE 1997

los niveles de recuperacin de la vita- recta con un coeficiente de correlacin

mina A en Bienestarina cruda se reali-
zan por triplicado, en una muestra de
Bienestarina de la Planta de Paipa los
dos mtodos de extraccin estudiados;
se analiza la vitamina A por CLAE y se
realiza un anlisis de varianza de los
resultados obtenidos.
RESULTADOS Y DISCUSIN
de 0.997 existiendo una alta correla-
cin entre la concentracin de vitamina
A y la respuesta del mtodo de detec-
cin, con una pendiente de 4 . 9 3 x 1 0 ' y
un intercepto de 0.54 UL
La determinacin de sensibilidad del
mtodo muestra que posee un lmite de
deteccin de 2,73x10-'^ UI y un lmite
de cuantificacin de 1.68UI.

Puesta a punto del mtodo analtico.

La validacin del mtodo se realiza
para confirmar y documentar que los
resultados del anlisis de vitamina A
por CLAE, en la condiciones cromato-
grficas mencionadas en la metodolo-
ga son confiables.
Determinacin de la precisin v la
exacttud del mtodo.
Las tablas I y 2 muestran, respecti-
vamente, los resultados obtenidos para
determinar la precisin y la exactitud
del mtodo analtico aplicado.

Determinacin de la linealidad y la sen- Como se muestra en la tabla I el

sibilidad.
La determinacin de vitamina A por
CLAE resulta ser un mtodo lineal en-
tre 1.75 y 8.50 UI, obtenindose una
RSD o coeficiente de variacin es un
nmero menor al determinado por el
criterio de aceptacin confirmando la
precisin del mtodo. En la tabla 2 se
muestra que el porcentaje de recupera-

Tabla 1. Precisin del mtodo de determinacin de vitamina A por CLAE.

Parmetros para evaluar la precisin

N 19
Media 5.21
Desviacin estndar 1.21x10"'
RSD 2.33
Criterio de aceptacin 2.77 (4)
Intervalo de confianza p = 0.05 5.00x10"' / 5.42x10"'

Tabla 2. Exactitud del mtodo de determinacin de vitamina A por CLAE.

Parmetros para evaluar la exactitud

N 19
% de recuperacin 104.22
Desviacin estndar 9.06
RSD 8.69
t-calculado 2.11
t-tabulado 2.10

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cin medio es mayor al 100%, es decir Tabla 3. Prueba de Duncan para el

los valores que se obtene de vitamina peso de muestra.
A dan 4,5 Ul o superiores, probable-
mente debido a pequeos cambios en Peso de peso de
muestra muestra P. Duncan,
los valores del rea obtenida bajo la p=0,05
curva de los picos de vitamina A, ade- (g) (g)
ms el t-calculado es igual al t-tabula-
do demostrando este resultado que el 5 15 Hay dms
mtodo es exacto. 5 10 No hay dms
10 15 Hay dms
Puesta a punto del mtodo de prepa-
racin de la muestra.
do (4.46), por lo tanto hay diferencia
Peso de muestra. significativa entre los diferentes pesos
de muestra.
La figura 1 muestra los resultados
obtenidos al analizar la vitamina A ob- Porcentaje de antioxidante.
tenida a partir de los tres niveles
diferentes de peso de Bienestarina. Se utiliza hidroquinona como ant-
oxdante. con el fin de disminuir las
La mayor recuperacin de vitamina perdidas de vitamina A por oxidacin
A se obtiene cuando se utilizan 5 o 10 durante el proceso de extraccin por
g de muestra; cuando se emplean 15 g contacto con aire o luz o cuando se
la recuperacin es baja debido a que realiza la evaporacin del solvente.
esta cantdad de muestra dificulta su
manejo, presentndose prdidas duran- La figura 2 y la tabla 4 muestran los
te la extraccin. Para el desarrollo de resultados obtenidos al utilizar tres ni-
la tcnica se decide emplear 10 g por veles de antioxdanle.
que la cantdad de muestra es de fcil
manejo y es adems representativa en El anlisis de varianza muestra que
el anlisis de alimentos. No obstante, el F calculado es mayor que F tabulado
en algunos casos cuando haya poca (2I4>4.46), lo que significa que existe
cantidad de muestra, se pueden utili- diferencia entre los diferentes porcen-
zar 5 g. tajes de antioxidante utilizados. Los
resultados obtenidos muestran que en-
La tabla 3 muestra los resultados
del anlisis estadstico, donde el F cal-
culado (225) es mayor que el F tabula-
<u

m
0) oO)
a
O) 15 o ro
o o^ m
o ro innn ^ 0)
3^ <u nn
3
*-< F
< Ez >
J 0
> lO o lO
3
peso de la muestra (g)
Porcentaje de
antioxidante

Figura 1. Recuperacin de vitamina A de Figura 2. Recuperacin de vitamina A con

acuerdo al peso de Bienestarina, relacin al porcentaje de anloxdante.

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 REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 26, No. 1 DE 1997

tre 10 y 15% de antioxidante no existe tra que existe diferencia significativa

diferencia significativa, lo que si ocu- entre todos los tratamientos estudiados
rre entre 5 y 10% y 5 y 15%. Por esta y se establece que se deben utilizar 2.0
razn se pueden utilizar tanto 10 como UA /g de Bienestarina porque se obte-
15% de antioxidante. ne la mayor recuperacin de vitamina A.

Puesta a punto de la actividad de a- Los resultados para las diferentes

am lasa.
Las figuras 3, 4 y 5 y la tabla 5,
muestran, respectivamente, los resul-
tados obtenidos del estudio de los di-
ferentes niveles de unidades de enzi-
ma, tiempo y temperaturas de activi-
dad enzimtica.
La figura 3 muestra cmo la mayor
recuperacin de vitamina A se obtiene
al utilizar 2.0 UA/g de Bienestarina.
Con unidades de actividad menores, la
recuperacin de vitamina A es poca por
que la cantdad de carbohidrato presen-
te supera la capacidad de hidrlisis de
la a-amilasa y a unidades de actividad
enzimtica mayores, los productos de
hidrlisis de los polisacridos presen-
tes en la Bienestarina, producen inhi-
'bicin competitiva de la actividad
enzimtica. El anlisis estadistico
muestra un F calculado (66) mayor que
el F tabulado (3.98), lo que significa
que hay diferencia significativa entre
los tratamientos utilizados para encon-
trar las UA que facilitan la recupera-
cin de la mayor cantidad de vitamina
A. La prueba de Duncan, tabla 4, mues-
temperaturas ensayadas se muestran en
la figura 4 y la tabla 5. La mayor recu-
peracin de vitamina A se obtiene al
realizar el ensayo con 45 C; con tem-
peraturas menores se presenta una
disminucin en la velocidad de reac-
cin y con 60 C hay probablemente
alguna leve alteracin a nivel del sitio
activo de la enzima, disminuyendo su
actividad. El tratamiento estadstico
muestra que existe diferencia entre las
temperaturas ensayadas ya que el F cal-
culado (24) es mayor que el F tabulado
(3.98) y esta diferencia se establece
segn la prueba de Duncan, entre to-
dos los tratamientos excepto a 20 C y
37 C donde la actividad enzimtica es
muy baja y entre 45 C y 60 C donde
se obtiene la mayor actividad hidrolti-
ca de la a-amilasa, pero se decide uti-
lizar 45 "C puesto que garantiza una
mayor recuperacin de vitamina A, se
produce un ahorro de energa y se hace
menos vulnerable la reaccin a la con-
taminacin microbiana.
La figura 5 muestra que con 60 mi-
nutos de actividad enzimtica se recu-
pera la mayor cantidad de vitamina A

Tabla 4. Prueba de Duncan para las Unidades de Actividad, t e m p e r a t u r a y

tiempo de actividad de a-amilasa.
UA Tempe- Tempe-
P. P. Tiempo Tiempo P.
Enzim- Enzim- ratura ratura
Duncan Duncan (min) (min) Duncan
tica lica c c

0.1 1.0 Hay dms 20 37 No hay dms 10 30 Hay dms

0.1 2,0 Hay dms 20 45 Hay dms
0.1 5.0 Hay dms 20 60 Hay dms 10 60 Hay dms
1.0 2,0 Hay dms 37 45 Hay dms
1.0 5.0 Hay dms 37 60 Hay dms 30 60 Hay dms
2.0 5,0 Hay dms 45 60 No hay dms

37
REVISTA C O L O M B I A N A DE Q U M I C A , V O L U M E N 2 6 , No. 1 DE 1997

2000
c i:
o re 1500

- 5 500H
= O)

UA enzimtica

Figura 3. Vitamina A recuperada de acuerdo a las UA de

a-amilasa adicionadas a la Bienestarina.

2000
a .-I^
rae 1500
o t z
r 1000

> i 500
20
Hld 37 45 60
Temperatura grados C

Figura 4. Recuperacin de vitamina A con diferentes tempe-

raturas de actividad de a-amlasa.

2000
O) ro
o . 1500
5 -g I IOOOIH
> .1 500|
5 m

Tiempo (min)

Figura 5. Vitamina A recuperada a diferentes tiempos de

actvidad de a-amlasa.

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 REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 26, No. 1 DE 1997
de la muestra de Bienestarina, y que
de acuerdo al anlisis estadstico el F
calculado (6.047) es mayor al F tabula-
do (4.46) y existe diferencia significa-
tiva entre los tempos estudiados. Esta
diferencia, segn se muestra en la ta-
bla 5, existe entre los tres tiempos es-
tudiados; a 10 y 30 minutos la enzima
no alcanza a actuar en forma eficiente,
mientras que a 60 minutos se encuen-
tra la mayor recuperacin de vitamina;
cs probable que a tiempos mayores la
actividad de la enzima aumente, pero a
este tiempo se obtienen mejores resul-
tados que los determinados por extrac-
cin directa de la vitamina a partir de
la muestra, por el mtodo lquido-
lquido con ter y posterior cuantfica-
cin por Carr-price. Se recomienda en-
sayar tempos mayores teniendo en
cuenta que el mtodo de extraccin sea
aplicable para anlisis de rutina.
P u e s t a a p u n t o del m t o d o de e x t r a c -
cin.
El proceso de extraccin se realiza
para separar la vitamina A de los de-
ms componentes de la matriz alimen-
ticia, aprovechando sus caractersticas
de ser soluble en solventes orgnicos
T a b l a 5. P r e c i s i n de la e x t r a c c i n
de la de v i t a m i n a A de B i e n e s t a r i n a
con t e r .
Precisin
N 10
Media I 1 1 1.34 UI
Desviacin 178.24
estndar
RSD 16.0
Criterio de 1.9
aceptacin
Intervalo de 983.85-1238.83UI
confianza.
p = 0.05
y no saponifieable. La extraccin se
debe hacer despus de la saponfica-
cin y en este caso se realiza con cinco
lavados sucesivos con ter; los resulta-
dos obtenidos del proceso se reportan
en la tabla 5 donde se muestra la pre-
cisin del sistema y en la tabla 6 la
exactitud del mismo,
Comparando los resultados obteni-
dos en el RSD o coeficiente de varia-
cin con cl criterio de aceptacin dado
por las tablas estadsticas (4). este va-
lor es mayor, lo que hace el mtodo de
extraccin con ter no preciso; los va-
lores obtenidos en UI de vitamina A se
acercan entre s, pero se alejan del va-
lor medio. Con respecto a la exactitud,
el tratamiento estadstico de los resul-
tados muestra que al comparar el t-
calculado con el t-tabulado el sistema
de extraccin con ter es no exacto y
slo se recupera un 51,96% a partr
del placebo de 2000 UI.
Debido a los resultados obtenidos
en la extraccin con ter y a la conta-
minacin que esta metodologa produ-
ce, se decide ensayar el mtodo de ex-
traccin de la vitamina A utilizando
columnas Lichrolut de silicagel; los re-
T a b l a 6. E x a c t i t u d de la e x t r a c c i n
de v i t a m i n a A de B i e n e s t a r i n a con
ter.
Exactitud
N 10
Porcentaje (%) 51.96
de recuperacin
medio
Desviacin 18.20
estndar
RSD 35.03
t-calculado 4.33
t-tabulado 2.26
39
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sultados del anlisis estadstico del es-
tudio de este sistema se muestran en
las tablas 7 y 8.
El obtener un valor de RSD mayor
al criterio de aceptacin, hace de la
extraccin con columnas Lichrolut de
silicagel un sistema no preciso para la
extraccin de vitamina A de Bienestar-
na Cruda; este resultado se puede de-
ber al bajo nmero de replicaciones y a
la poca experiencia en el manejo de las
columnas, no se efecta una buena ac-
tivacin de la columna, por lo que se-
ra recomendable realizar un mayor n-
mero de determinaciones mejorando el
sistema de activacin de la columna y
la elucin de la vitamina de sta.
Los resultados de la exacttud del
sistema de extraccin con columnas de
Lichrolut de silicagel muestran que es
un sisten"ia exacto, con un porcentaje de
recuperacin del 80% mucho mayor que
el obtenido en el sistema de recupera-
cin con ter; es importante por tanto
implantar este sistema de extraccin,
porque adems de ser exacto, aporta
beneficios de tipo econmico y ambien-
tal al reducir la cantdad de ter utliza-
Tabla 7. Precisin de la extraccin
de vitamina A de Bienestarina con
slica.
Precisin
N 10
Media 1628.5 UI
Desviacin 163.5
estnda
RSD 10
Criterio de 1.9
aceptacin
Intervalo de 1223.06-2003.32
confianza.
p = 0.05
40
do en el proceso, el cual es altamente
txico para quien realiza la tcnica,
CONCLUSIONES
-La CLAE rene los requerimientos
analticos de: linealidad, sensibilidad,
precisin y exactitud; por tal razn los
resultados producidos por CLAE para
el anlisis de vitamina A son confia-
bles,
-Se encuentra que las mejores con-
dcones para la extraccin de vitami-
na A de Bienestarina cruda son: lOg de
muestra; adicionar 15% de hdroquno-
na como antioxidante; 2.0 UA de a-
amlasa por gramo de muestra, a 45 C,
durante 60 minutos,
-El mtodo de extraccin lqudo-
lquido con ter de la vitamina A no
cumple los requerimientos de precisin
y exactitud, adems que slo permite
la recuperacin del 50% de la vitamina
presente en la Bienestarina.
-La extraccin slido- lquido de la
vitamina A utlizando columnas Lchro-
Tabla 8. Exactitud de la extraccin
de vitamina A de Bienestarina con
slica.
Exactitud
N 10
Porcentaje (%) 80
de recuperacin
medio
Desviacin 21.64
estndar
RSD 27.0
t-calculado 1.28
t-tabulado 4.303
 REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, VOLUMEN 26, No. 1 DE 1997

lut de silicagel es un sistema exacto y 3. The Association of Vitamin Chemist,

permite una recuperacin mayor del Inc. Methods of Vitamin Assay. Inters-
80% de la vitamina a partir de la cience Publishers, N.Y. 1966, 63-79.
Bienestarina cruda.
4. QUATTROCCHI, O.; ABELAIRA, S.
L; LAB A, R. Introduccin a la HPLC
AGRADECIMIENTOS Aplicacin y Prctica. MERCK.. 1992.

Las autoras desean agradecer a la 5. SKOOG, A. L.; JAMES, J. Anlisis

Universidad Nacional de Colombia, al Instrumental. Mac Graw Hill. Espaa.
Instituto Colombiano de Bienestar Fa- 1994.
miliar y a MERCK Colombia.
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Nutricional Especificaciones Tcnicas 8. MERCK. Adsorbex, Aplication No-
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