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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE DE GROHMANN

Facultad de Ciencias

Escuela Acadmica Profesional Biologa- Microbiologa

AISLAMIENTO DE BACTERIAS METANOGENICAS

Alumno: Alexander Alfrez Talace

Curso: Microbiologa - Acutica

Ao: Quinto

Tacna Per
2017
AISLAMIENTO DE BACTERIAS METANOGENICAS

I. INTRODUCCION:

Las bacterias metanognicas (Arqueas productoras de metano) estn


ampliamente distribuidas en la naturaleza en ambientes anoxignicos; con mayor
frecuencia se encuentran en ambientes terrestres como microambientes de poro
medio en suelos, en bosques y praderas, aguas continentales, en especial en
pantanos y zonas encharcadas y, en alguna proporcin, en el mar. Este ltimo
ambiente les genera competencia con microorganismos reductores de sulfatos por
el acetato y el hidrgeno disponibles para su supervivencia, sustratos que pueden
ser reemplazados por las metilaminas, excretadas por algunos animales marinos.
En el suelo, agua y otros ambientes como el rumen, la disponibilidad de los
sustratos depende de la accin metablica de otros microorganismos que
degradan compuestos orgnicos a acetato, formiato, metilamina, metanol y
metilmercaptano entre otros. Estos son utilizados por las bacterias metanognicas
en la produccin de metano.

Existen varios grupos de bacterias metanognicas que se diferencian entre si por


su morfologa; se pueden encontrar bacilos y cocos filamentosos, agrupados en
cadenas, diplococos, tetradas y racimos. Pueden desarrollarse a temperaturas que
van desde a 38C a 75C. Su metabolismo se caracteriza por integrar las vas
biosintticas y bioenergticas para la produccin de ATP. En condiciones de
ausencia de hidrgeno, oxidan compuestos para la obtencin de electrones. Estas
bacterias permiten ser empleadas en diferentes procesos biotcnolgicos en
sistemas anaerobios: como componente de biorreactores para descomposicin de
basura orgnica, para la produccin de gas metano a partir de estircol de cerdo;
como modelo experimental en simulacin de suelos de otros planetas, entre otros.

Los sistemas anaerobios desarrollan procesos fermentativos de los cuales se


obtienen productos finales estables y una produccin celular muy baja, alrededor
del 3% de la materia orgnica presente en el agua residual es convertida en masa
celular y el 97% restante es convertido por catabolismo en CH4 y CO2 como
productos finales estables.

Teniendo en cuenta la importancia de estos microorganismos en los procesos de


bioremediacin para la conservacin del medio ambiente.

II. MATERIALES Y MTODOS


Reactivos:
Mtodo:

Recoleccin y obtencin de las muestras se realiza un muestreo por duplicado


con jeringas estriles de 60 mL, introducindolo aproximadamente a 40 cm. por
debajo del espejo de agua de Humedales de ITE. Las muestras se mantienen en
condiciones anaerobias inmediatas utilizando un tapn de caucho en cada jeringa
para evitar la entrada de oxigeno.

Verificacin de presencia de microorganismos en las muestras

Se realiza coloraciones de Gram de las muestras directas obtenidas en los


humedales de ITE para verificar por microscopa la presencia de bacterias.

Aislamiento y obtencin de los microorganismos

Los medios selectivos para el aislamiento son: Barker-Taha (MB) para


Methanobacterium y StadtmanBarker (MC) para Methanococcus. Estos medios
incluyen diversos sustratos que son usados por estos microorganismos como
fuente de energa para su crecimiento y metabolismo, Tabla 1 y 2.

La preparacin del medio (MB) requiere que una vez se esterilice, se le aaden las
siguientes soluciones: carbonato de sodio 0.50 g en 10 mL de agua destilada y
sulfuro de sodio 9 (H2 O) 0.1g en agua destilada 10 mL.

Pre-reduccin de los medios:

Para los medios lquidos, la pre-reduccin se realiza mediante choque


trmico, durante 10 minutos a a 100C en bao mara y luego se enfra en
chorro de agua fra con el fin de desplazar el O2 que pudiera encontrarse
en el tubo.
La pre-reduccin de los agares se realiza dejando los medios por 2 horas
en la jarra de anaerobiosis, utilizando los generadores de atmsfera
(AnaeroGen OXOID). A la prueba de esterilidad se le realiza un
seguimiento de 72 horas para descartar contaminacin con
microorganismos aerobios y prueba de selectividad para verificar el
desarrollo de bacterias anaerobias, con la inoculacin de Clostridiumspp.
como control.

Inoculacin de la muestra:

Se inoculan 100L de la muestra en los medios lquidos para Methanococcus y


Methanobacterium; seguido se realiza coloracin de Gram para verificar la
presencia de bacterias; los cultivos se incubaron durante 15 das a 37C en
atmsfera de anaerobiosis (AnaeroGen OXOID).

A los 15 das se verific el crecimiento bacteriano por turbidez en el medio y se


realiz la siembra en los medios slidos MC y MB pre-reducidos; se incubaron
durante 15 das a 37C en condiciones de anaerobiosis y se verific la presencia
de bacilos y cocos en el crecimiento obtenido en los medios lquidos y en los
medios slidos mediante coloracin de Gram.

Identificacin fenotpica y produccin de gas metano

El aislamiento de colonias en los medios slidos MC y MB confirma la presencia


de bacterias metanognicas.

La produccin metablica de gas metano, se realiza mediante la esterilizacin


previa de cada uno de los elementos que componen el sistema de produccin de
metano: tubos 16 x 150mm con desprendimiento lateral, tapones de caucho,
mangueras en ltex de 20 cm. y pinzas en garra.
Posteriormente en una cabina de flujo laminar se arma el sistema, seguido se
envasa el medio de cultivo y se inocula antes de sellar el sistema.

Los medios de cultivo utilizados son MC y MB lquidos en cantidad de 6 mL para


proporcionar espacio suficiente para el almacenamiento del gas producido por las
bacterias.

La medicin cualitativa se realiza por la tcnica de desplazamiento de agua


contenida en la probeta, evidenciando la produccin de burbujas generadas por el
gas y el aumento del volumen final del agua. El objetivo de utilizar este sistema es
controlar la posible prdida del gas producido por las bacterias durante la
incubacin y verificar la presencia del gas metano.
III. BIBLIOGRAFIA:

1. Woese C, Wolfe S, Balch E. Methanogens: reevaluation of a unique group.


MicrobiolRew 1979;43:260-296.

2. Balch E, Wolfe S. New Approach to the cultivation of methanogenic bacteria: 2-


mercaptoethanesulfonic acid (HS-COM) dependent grow of
MethanobacteriumRuminantium in a pressurized atmosphere.
ApplEnvironMicrobiol 1976;32:781-791.

3. Fredrickson JK, Onstott TC. Vida en las profundidades de la Tierra.


Investigacin y Ciencia 2003;243:22-28.

4. Rittmann B. Biotecnologa del Medio Ambiente: principios y aplicaciones, Ed. Mc


GrawHill 2000.

5. Madigan M, Martinko J, Parker J. Biologa de los Microorganismos, Madrid. 8


Ed. Prentice Hall, 2000.

6. Mertoglu B, Calli B, Guler N, Inanc B, Inoue Y. Effects of insufficient air injection


on methanogenicArchaea in landfill bioreactor. J Hazard Mater. 2007;42:258-265.
7. Padmasiri SI, Zhang J, Fitch M, Norddahl B, Morgenroth E, Raskin L.
Methanogenic population dynamics and performance of an anaerobic membrane
bioreactor (AnMBR) treating swine manure under high shear conditions. Water
Res. 2007;41:134 144.

8. Ormond DR, Kral TA. Washing methanogenic cells with the liquid fraction from a
Mars soil simulant and water mixture. J MicrobiolMethods. 2006;67:603-605.

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