Rezumat

Tratamentul cu substituie de insulin este esenial pentru persoanele cu diabet zaharat de tip 1 i este
necesar n aproximativ 40-50% din diabeticii de tip 2 pe durata vieii. ncercrile anterioare privind
regenerarea celulelor beta s-au bazat pe leziuni pancreatice pentru a induce proliferarea celulelor beta,
dediferenierea i activarea cii embrionare sau nlocuirea celulelor stem. Reportim o metod
alternativ de transformare a celulelor adulte non-stem (somatice) n celule beta pancreatice.
Abordarea prin intermediul reelelor celulare, integrrii i procesrii (CNIP) vizeaz mecanismele
celulare implicate n funcia pancreatic n starea adult a organelor i utilizeaz un mecanism sinergic
care integreaz trei niveluri importante de reglementare celular pentru a induce formarea celulelor
beta: (i) metabolismul glucozei; ) funcia receptorului membranar i (iii) transcripia genei. Scopul
studiului a fost de a induce formarea de celule beta pancreatice in vivo la animalele adulte fr celule
stem i fr dediferenierea celulelor pentru recapitularea cii embrionare aa cum a fost publicat
anterior (1-3). Rezultatele noastre care utilizeaz CNIP demonstreaz c: (i) celulele secretoare de
insulin pot fi generate n esutul pancreatic adult in vivo i pot eluda problema generrii de celule
endocrine (glucagon i somatostatin) care exercit efecte duntoare asupra homeostazei glucozei i (ii)
normalizarea toleranei la glucoz i a secreiei de insulin poate fi realizat ntr-un model de oarece
diabetic de tip slbatic. Cocteilul CNIP are potenialul de a fi utilizat ca tratament preventiv sau
terapeutic sau pentru tratamentul diabetului de tip 1 i de tip 2.

Cuvinte cheie: formarea celulelor beta, secreia de insulin, in vivo

Introducere

Scderea secreiei de insulin este o caracteristic caracteristic att a diabetului zaharat de tip 1, ct i
a diabetului zaharat de tip 2 i s-au utilizat o varietate de abordri pentru a genera celule beta in vivo i
in vitro [1-3]. n cele ce urmeaz, descriem o abordare complet nou pentru generarea de celule beta in
vivo ntr-un model de diabet zaharat de tip slbatic adult. Aceast metod, care integreaz niveluri
multiple de fiziologie celular pentru a regla funcia organelor, are ca rezultat normalizarea pe termen
lung a secreiei de insulin i a glicemiei i nu este asociat cu leziuni pancreatice. Am etichetat
abordarea noastr "Reele celulare, integrare i procesare (CNIP)" pentru ao deosebi de termenul
"biologie a sistemului", care este folosit n general pentru a se referi colectiv la diferite nivele ale
fiziologiei celulare, organelor i ntregului corp. Principiul fundamental care st la baza CNIP este acela
de a viza simultan i de a integra trei niveluri-cheie ale fiziologiei celulare care au fost implicate n
formarea celulelor beta. Acest lucru este n contrast cu modelul neintegrat care vizeaz numai
reprogramarea nuclear [1, 2]. Dou concepte importante caracterizeaz abordarea CNIP: (i) este
esenial s se integreze trei niveluri de fiziologie celular: metabolismul carbohidratului, funcia
receptorului membranar i transcripia genetic pentru a produce efectul dorit, adic formarea de celule
beta; (ii) din fiziologia celular este esenial pentru a produce un efect sinergie asupra formrii celulelor
beta. Sinergia este un factor cheie, n care mai multe molecule lucreaz mpreun pentru a produce un
efect mai mare dect suma efectelor lor individuale. Spre deosebire de abordrile anterioare, CNIP este
conceput pentru a viza mecanismele celulare implicate n funcia pancreatic n starea adult a
organelor i utilizeaz un mecanism sinergetic care integreaz mai multe nivele de reglementare
celular.

Metabolismul glucozei este primul element important n abordarea noastr CNIP de a induce formarea
de celule beta n pancreasul adult. Glucoza este sursa principal de energie utilizat de celulele de
mamifere i furnizeaz energia pentru funcia i proliferarea celular [4]. Inhibarea glicolizei oprete
progresia ciclului celular, demonstrnd necesitatea metabolismului glucozei pentru a induce proliferarea
celulelor [4, 5]. ntr-adevr, factorii majori care induc in vivo formarea formrii celulelor beta
pancreatice necesit metabolismul glucozei [6-8]. Prima etap de limitare a vitezei pentru metabolizarea
glucozei n calea glicolitic este la nivelul fosforilrii glucozei de ctre hexokinaz. Celulele beta
pancreatice conin o hexokinaz de tip IV, numit glucokinaz. Am demonstrat c, dac glucoza nu este
fosforilat la G-6-P de ctre glucokinaz, ea nu poate suferi un metabolism suplimentar i nu poate
genera un semnal ctre mecanismele transcripionale pentru a induce expresia genei [9, 10]. Prin
urmare, prima molecul inclus n cocktail-ul nostru CNIP pentru a induce formarea de celule beta
pancreatice este glucokinaza.

O a doua funcie celular implicat n formarea celulelor beta este legarea ligandului la receptorii tirozin
kinazei [7, 11]. Creterea masei celulelor beta pancreatice ca rspuns la stresul fiziologic, i anume
sarcina, este mediat de hormonul de cretere, de prolactin i lactogenul placentar care acioneaz
prin intermediul receptorului de prolactin [11, 12]. Receptorul de prolactin nu are activitate intrinsec
de tirozin kinaz, dar interacioneaz cu membrii familiei de kinaze Janus de tirozin kinaze [11, 12].
Aciunea insulinei, a factorilor de cretere asemntori insulinei, a factorului de cretere a hepatocitelor
i a factorului de cretere epidermal crete, de asemenea, masa celulelor beta prin activarea unui
receptor de tirozin kinaz legat de membran [11]. S-a artat c proteina-tirozin fosfataza 1B (PTP1B)
inhib capacitatea insulinei, a factorului de cretere asemntor insulinei, a prolactinei i a factorului de
cretere a hepatocitelor pentru a activa tirozin kinaza [13-15]. Prin urmare, a doua molecul inclus n
cocktailul nostru CNIP pentru a induce formarea de celule beta pancreatice prin creterea activitii
tirozin kinazei receptorului de membran este un shRNA care vizeaz PTP1B. Suprimarea produciei de
protein PTP1B de ctre shARN crete activitatea receptorului tirozin kinazei implicat n formarea
celulelor beta n pancreasul adult ca rspuns la legarea unei concentraii fiziologice a hormonului
corespunztor: insulin, factor de cretere asemntor insulinei, factor de cretere a hepatocitelor,
factor de cretere epidermal, hormonul de cretere, prolactina i lactogenul placentar [13-15].

Al treilea pas important n abordarea noastr CNIP este ndreptat spre nivelul de exprimare a genelor i
implic un factor de transcripie, care este utilizat ca un atractiv pentru a converge i a concentra
efectele metabolice / moleculare de glucoz generate de receptorii tirozin kinazei pentru a forma beta
noi celulele din pancreasul adult. O aciune important a metabolismului glucozei este de a trimite o
semnalizare la aparatul transcripional pentru a crete probabilitatea legrii factorului de transcripie
(TF) de molecula ADN [9, 10]. Am artat c metabolismul glucozei ofer un semnal pentru mecanismele
transcripionale de a induce expresia TF i translocarea TF de la citoplasm la nucleu pentru a activa
genele induse de glucoz [9, 10]. Un factor cheie de transcriere implicat n formarea celulelor beta este
Pdx-1, care are efecte distincte nainte i dup natere [16]. La stadiul embrionar, Pdx-1 este esenial
pentru dezvoltarea pancreatic i este exprimat n esuturile endocrine i exocrine. Cu toate acestea,
dup natere, Pdx-1 este exprimat numai n celule beta pancreatice i celule somatostatinice. Sa
demonstrat c Pdx-1 este implicat n formarea celulelor beta la animalele adulte [17] i a fost utilizat
n abordarea CNIP pentru aciunea sa post-embrionar pentru a mbunti formarea celulelor beta. Prin
urmare, supraexprimarea Pdx-1 joac un rol central n convergirea tuturor mecanismelor de semnalizare
n cocktail-ul CNIP pentru a stimula formarea celulelor beta.

Noi demonstrm n aceast lucrare c cocktail-ul nostru CNIP induce formarea de celule beta la oarecii
diabetici de tip slbatic adult direct din celulele somatice pancreatice. Aceast abordare a creterii
numrului de celule beta pancreatice secretoare de insulin la subiecii aduli poate fi utilizat ca
prevenire, tratament sau vindecare a diabetului zaharat. De asemenea, am comparat abordarea CNIP cu
un cocktail cu trei piloni care conine doar factori de transcripie (1) pentru a demonstra c integrarea
nivelurilor multiple de fiziologie celular este esenial pentru a produce un efect sinergie asupra
formrii celulelor beta care nu poate fi realizat prin utilizarea pur i simplu a unui cocktail a factorilor de
transcripie care vizeaz numai reprogramarea nuclear in vivo.

Materiale si metode

Viral Vector Construct

Am proiectat un construct vectorial lentiviral care exprim gena de glucokinaz sub controlul
promotorului citomegalovirus (CMV). Am ncorporat n vectorul nostru lentiviral construi un element
posttranscripional de reglementare a virusului hepatitei woodchuck (WPRE) la regiunea 3 'netranslatat
a secvenei de codificare; acest lucru a crescut substanial nivelul de exprimare al transgenei. WPRE
funcioneaz n interiorul nucleului pentru a stimula expresia genic posttranscripional prin creterea
nivelului de transcripie nuclear i creterea semnificativ a timpului de njumtire al ARN. Gena de
glucokinaz de oarece (GCK) a fost subclonat n vectorul plasmid CMV-WPRE i inseria a fost
verificat prin secvenierea ADN-ului. Plasmida-GCK a fost tratat cu enzima LR Clonase II (Invitrogen) i
ligat la un vector plasmidic Lenti. Produsul de recombinare a fost transformat n celule E. coli. Dup
incubarea peste noapte, clonele pozitive au fost selectate i ADN-ul plasmidic a fost purificat. Plasmida-
GCK i plasmida Lenti-GCK au fost transfectate n celule 293. La 48 de ore dup transfecie, celulele au
fost lizate n tampon SDS-PAGE i supuse la electroforeza gelului SDS-PAGE 4-20% i analiza Western
blot. Western blotul s-a efectuat utiliznd anticorp anti-GCK la diluie 1: 1000, urmat de un anticorp
secundar conjugat cu HRP. Membrana de blot Western a fost detectat de reactivii ECL. ADNc PDX-1 a
fost introdus ntr-o construcie lentivirus folosind aceeai metod descris mai sus pentru lenti-GCK sub
controlul promotorului CMV. Secvena de codificare a ADNc Pdx-1 a fost legat n aval de o etichet c-
myc pentru a permite supraexpresia de protein s fie identificat cu un anticorp mpotriva epitopului
Myc pentru ao diferenia de expresia endogen de tip slbatic a PDX-1. Plasmida PDX1 i plasmida Lenti-
PDX1 au fost transfectate n celule 293. La 48 de ore dup transfecie, celulele au fost lizate n tampon
SDS-PAGE i supuse la electroforeza gelului SDS-PAGE 4-20% i analiza Western blot. Western blotul a
fost realizat utiliznd anticorpul anti-Myc (pentru constructul PDX-1) la diluie 1: 1000, urmat de un
anticorp secundar conjugat cu HRP. Membrana a fost detectat de reactivii ECL. PTR1B shRNA a fost
introdus ntr-o construcie lentivirus folosind aceeai metod descris mai sus pentru lenti-GCK sub
controlul promotorului H1 polimeraz. Promotorul H1 al polimerazei III este activ omniprezent n toate
celulele, datorit funciei de menajare a polimerazei III. Lentivirusul a fost geretat de Welgen
(Worcester, MA, SUA). Pentru bloturile western, cantiti egale de protein total s-au separat pe 10 i
15% SDS / PAGE i s-au transferat pe membrane de nitroceluloz. Membranele au fost apoi blocate cu
5% lapte fr grsimi n TBS Tween-20 0,1% i sondate cu anticorpi specifici mpotriva PDX-1 (Cell
Signaling Technology, Danvers, MA, SUA), PTP1B (Abcam Inc., Cambridge, MA) glucokinaza (Santa Cruz
Inc, Santa Cruz, CA, SUA) i GAPDH (G9545, Sigma Aldrich, St Louis, MO, SUA). Membranele s-au incubat
apoi cu anticorp secundar conjugat HRP (NA934) i s-au dezvoltat cu un reactiv chemiluminiscent
(Amersham Bioscience, GE Healhcare, Pittsburgh, PA, USA). Genele mouse-ului Ngn3 i MafA au fost
subclonate n vectorul CMV plasmidic i inseriile au fost verificate prin secvenierea ADN-ului. Plasmida-
Ngn3 i MafA-GFP au fost tratate cu enzima LR Clonase II (Invitrogen) i ligate la un vector plasmidic
Lenti. Produsele de recombinare au fost transformate n celule E. coli. Dup incubare peste noapte,
clonele pozitive au fost selectate i ADN-ul plasmidic a fost purificat. Plasmida Lenti-Ngn3 i pLenti-MafA
au fost transfectate n celule 293. La 72 de ore dup transfecie, celulele au fost lizate n tampon SDS-
PAGE i supuse electroforezei gelului SDS-PAGE 4-20 i analizelor Western blot. Western blotul s-a
efectuat utiliznd anticorpul anti-Ngn3 i MafA la diluie 1: 1000, urmat de un anticorp secundar
conjugat cu HRP. Membrana de blot Western a fost detectat de reactivii ECL. Blocarea Western blot a
esutului pancreatic timp de patru sptmni post-injectare cu factori de transcripie cocktail (Lenti-
MafA + Lenti-PDX-1 i Lenti-Ngn3) i controlul cocktailurilor cu anticorpi mpotriva MafA, Ngn3 i PDX-
probat cu anticorpi anti-GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaz) sau anticorpi de tubulin ca
control de ncrcare. Pentru bloturile western, cantiti egale de protein total s-au separat pe 10 i
15% SDS / PAGE i s-au transferat pe membrane de nitroceluloz. Membranele au fost apoi blocate cu
lapte de grsime 5% n TBS Tween-20 0,1% i sondate cu anticorpi specifici mpotriva PDX-1 (Cell
Signaling Technology, Danvers, MA, SUA), Ng3 (Santa Cruz Inc, Santa Cruz, , MafA (Bethyl Laboratories,
Inc. Montgomery, TX, SUA) i GAPDH (G9545, Sigma Aldrich, St Louis, MO, SUA). Membranele s-au
incubat apoi cu anticorp secundar conjugat HRP (NA934) i s-au dezvoltat cu un reactiv
chemiluminiscent (Amersham Bioscience, GE Healhcare, Pittsburgh, PA, USA).

Metoda in vivo pentru administrarea genei orientate ctre pancreasul adult

Pentru a studia formarea celulelor beta la animalul adult, am folosit o nou abordare in vivo pentru a
viza pancreasul adult folosind un vector lentiviral (18). Am validat anterior aceast tehnic [18] i am
folosit-o n abordarea noastr CNIP pentru a genera celule beta pancreatice in vivo. Construcia
lentiviral (fig.11) este introdus n pancreasul mouse-ului prin conducta pancreatic dup cum
urmeaz: un cateter cu calibru 32 este introdus n conducta chistic printr-o mic deschidere a vezicii
biliare. Cateterul este apoi avansat n conducta biliar comun i fixat n poziie cu o sutur de 0/0 n
jurul canalului biliar i a cateterului pentru a mpiedica refluxul vectorului n ficat. Cu o micro-clem
plasat n jurul sfincterului Oddi, pentru a evita scurgerea vectorului n duoden, 100 pl de cocteil vector
vectorial total exprimnd cDNA glucokinaz, Pdx-1 i shTPN PTP1B (Figura 11) la 108 pn la 109 TU / ml
este injectat ncet n canalul pancreatic prin cateter. Cocteilul placebo de control a fost compus din lupta
shRNA a lentivirusului cu GFP exprimat n lentivirus la aceeai concentraie i volum ca i cocktailul
experimental. La patru sptmni dup infecia lentiviral, ntregul pancreas este ndeprtat pentru
examinarea histologic. Anterior am artat c, timp de 48 de ore dup injectarea codificrii lentivirusului
pentru proteina fluorescent verde (GFP) sub controlul citomegalovirusului promotor (CMV), GFP a fost
detectat numai n esuturile pancreatice [18]. Analiza morfometric cantitativ a transduciei
pancreatice de ctre vectorul Lentivirus, pe baza expresiei GFP, a artat c 60% din GFP exprimat n
esut [18]. Foarte important, expresia a fost detectat n pancreas chiar dup patru sptmni (Figura
1D1D). Vectorul Lentivirus exprimat proteina fluorescent verde nu a fost gsit n nici un alt esut din
organism, incluznd inima, plmnul, ficatul, creierul, muchiul piciorului i rinichi prin histologie i PCR
(datele nu sunt prezentate). Stratul pancreatic a fost colorat cu H & E pentru a cuta dovezi ale
inflamaiei (pancreatit) n ziua 2 i ziua 14 post-injectare a Lentivirusului. n concordan cu studiile
anterioare din laboratorul nostru [18], n studiul prezent nu s-a observat nici o dovad de inflamaie prin
metoda noastr de injectare a lentivirusului. oarecii C57BL / 6 masculi (Charles River, Wilmington, MA,
SUA) au fost utilizai i meninui pe o diet adiional de ap i de mncare normal pentru toate
experimentele. n ziua 1 post-injectare cu vectorul lentiviral, oarecii au fost injectai i.p. zilnic cu BrdU
(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA) n PBS la o doz de 50 pg / g greutate corporal timp de 12 zile
pentru a se cuantifica proliferarea celulelor beta. La 4 sptmni dup injectarea lentiviral, ntregul
pancreas a fost ndeprtat pentru examinarea histologic.

Mouse-ul diabetic parial pancreatectomizat

Diabetul a fost creat prin eliminarea a ~ 80% din pancreas, aa cum a fost descris anterior [19].
oarecele cu diabet zaharat parial pancreatectomizat [19] reprezint un model insulinopenic al
diabetului zaharat i are avantajul major fa de alte modele diabetice care, dup rezolvarea stresului
acut al interveniei chirurgicale n 5-7 zile, esuturile pancreatice rmase sunt perfect normale [20]. De
remarcat c am ateptat dou sptmni dup pancreatectomie nainte de injectarea cocktail-ului CNIP.
Dou sptmni sunt suficiente pentru ca orice efect al pancreatectomiei chirurgicale asupra proliferrii
celulare s dispar [21] (vezi Date suplimentare, model de oarece diabetic tip salbatic i parial
pancreatectomizat).

Testul de toleran la glucoz intraperitoneal cu rspuns la insulina din plasm

nainte i 4 sptmni dup pancreatectomia parial, oarecii (n = 5) au primit un test de toleran la

glucoz intraperitoneal. Dup un post peste noapte, oarecii au fost cntrii i au fost injectai i.p. cu
un bolus de glucoz (2g / kg). Concentraiile de glucoz din snge au fost determinate din sngele din
coad la 0, 10, 15, 30, 60 i 120 min utiliznd glucometrul Ascensia Breeze 2 (Bayer HealthCare,
Mishawaka, IN). Concentraia plasmatic a insulinei a fost msurat la 0, 15, 30 i 60 min pe probe de 5
pl (EDTA) folosind ELISA ultrasensibil cu insulin de oarece (Alpco Diagnostics, Salem, NH). Glicemia
din snge de glucoz a fost msurat n sptmni

-2, -1, 0 i n fiecare sptmn dup pancreatectomia parial.

Analiza imunofluorescent i imunohistochimic

La patru sptmni dup infecia cu lentiviral, ntregul pancreas a fost eliminat pentru o examinare
histologic orb. esutul pancreatic de oarece aduli a fost fixat prin imersare n tampon fosfat 4%
paraformaldehid - 1% glutaraldehid peste noapte la 4 C i ncorporat cu compusul TSTS-Tek OCT
pentru secionarea crisostatului. Urmtorii anticorpi primari au fost utilizai: anticorpi anti-
somatostatin (G-10), anti-glucagon (K79bB10) i anti-insulin A (C-12) i IgG de iepure control (Santa
Cruz Inc., Santa Cruz, CA). Pentru studiile de proliferare, esuturile pancreatice au fost colorate cu
anticorp monoclonal de obolan BrdU (Abcam Inc., Cambridge, MA). Reacionarea antigenului s-a
efectuat pentru anticorpii BrdU prin seciuni de fierbere timp de 10 min n tampon citrat 10 mM urmat
de rcire timp de 30 de minute la temperatura camerei. Nucleii au fost contracarate cu DAPI (Vector
Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Anticorpii secundari fluoresceni au inclus antigiul de capr-
fluorescein, capr anti-oarece fluorescein, rou Texas de capr anti-iepure i rou Texas de mgar
(Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA). Zonele cu celule beta reprezint suprafaa celulelor colorate pozitiv
pentru imunostanarea insulinei mprit la suprafaa pancreatic total scanat cu microscopul
confocal cu scanare laser Olympus FV-1000. Suprafaa pancreatic pozitiv i total a insulinei a fost
cuantificat cu ajutorul imaginii J (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Masa celulelor beta a
fost calculat ca suprafa beta-celular nmulit cu greutatea umed pancreatic.

Au fost analizate cel puin patru oareci cu condiie. Stratul pancreatic a fost colorat cu H & E pentru a
cuta dovezi de inflamaie (pancreatit) n zilele 2 i 14 post-injectare de Lentivirus.

Rezultate

Dup administrarea injeciei vectorului lentiviral coninnd cocktailul experimental de cocktail sau
control placebo, consumul zilnic de alimente a fost monitorizat pe parcursul celor patru sptmni post-
injectare (oareci cocktail de CNIP, 5,4 0,3 grame / zi [n = 4] 0,5 grame / zi [n = 6]). Creterea n
greutate a fost similar n grupurile de control CNIP i de control. Nici o diaree nu a fost observat nici n
grupul de control placebo cu cocktailuri, nici n grupurile experimentale de cocktail dup injectarea de
Lentivirus. Pancreas (lipaza) i enzimele hepatice (AST, ALT) msurate n zilele 7 i 14 dup injecia
lentiviral nu au fost ridicate, conform observaiilor anterioare [18]. Aceste rezultate demonstreaz c
tehnica de injectare Lentivirus nu provoac efecte adverse gastro-intestinale, pancreatice sau hepatice.
La patru sptmni post-injectare, am demonstrat n suprapresiunea pancreatic a PDX-1 i GK i
suprimarea expresiei PTP1B de ctre cocktail-ul CNIP (fig.1D1D i 1E1E). Am cuantificat numrul de
celule singulare sau duble cu insulin pozitiv n esuturile exocrine ca o indicaie a formrii celulelor
beta prin compararea grupului cocktail CNIP cu grupul de control cocktail. Am demonstrat o cretere
semnificativ a celulelor singulare sau duble cu insulin pozitiv n esuturile exocrine (figura 22).
Creterea numrului de celule singulare sau duble cu insulin pozitiv n grupul de cocktail-uri CNIP a
corelat cu creterea proliferrii celulelor beta, cuantificat de BrdU (Figura 33). Marcatorul BrdU a
demonstrat proliferarea celulelor beta n insule i esuturi exocrine. Co-localizarea markerului de
proliferare BrdU cu celule cu insulin pozitiv documenteaz formarea de celule beta pancreatice nou
formate la oarecii injectai cu cocktail CNIP (Figura 4A4A). Numai proliferarea celulelor beta-
pancreatice (insulin) a fost observat. Nu a fost demonstrat proliferarea celulelor alfa (glucagon) sau
delta (somatostatin) (datele nu sunt prezentate), n concordan cu scopul nostru de a induce numai
formarea post-embrionar a celulelor beta pancreatice.

Am cuantificat masa beta-celulelor n grupurile CNIP cocktail i control. Masele de celule beta
pancreatice au crescut semnificativ la oarecii aduli injectai cu cocktail CNIP fa de oarecii injectai cu
placebo de control (figura 4B4B). Am cuantificat, de asemenea, numrul clusterelor de celule beta
(reprezentnd 3 pn la 5 celule conectate mpreun i excludnd insulele) n pancreas i a documentat
o cretere semnificativ a grupului CNIP (Fig.4C4C). Creterea proliferrii i a masei celulelor beta
pancreatice a fost asociat cu o cretere de 2,5 ori a concentraiei plasmatice a insulinei n plasm (peste
noapte) la oarecii injectai cu cocktail CNIP comparativ cu grupul martor (Figura 5A5A, P <0,01). HOMA-
beta, un indice al seciunii de insulin (22), a crescut de 3,9 ori n CNIP comparativ cu grupul de control
(P <0,001) (Figura 5B5B). Concentraia de glucoz plasmatic n plasm (FPG) a fost redus la normal n
CNIP comparativ cu grupul martor (P <0,01) (Figura 5A5A); nu a fost observat hipoglicemia (FPG <70 mg
/ dl) la nici un oarece tratat cu CNIP, indicnd faptul c celulele beta nou formate au fost receptive
fiziologic la concentraia de glucoz din mediul ambiant (fig.5A5A). Este important s subliniem faptul c
am validat abordarea CNIP ntr-un model de oarece diabetic tip slbatic parial pancreatectomizat.
Aceasta elimin variabilele de confuzie asociate cu utilizarea altor modele de oareci (vezi Date
suplimentare, modelul de oarece diabetic tip salbatic i parial pancreatectomizat) utilizat anterior
pentru a examina formarea celulelor beta in vivo. Dup patru sptmni dup injectarea cocteilului CNIP
la oarecii diabetici parial pancreatectomizai, testul de toleran la glucoz a fost complet normalizat
(Fig.6A6A) i secreia de insulin a fost restabilit la normal (Figura 6B6B). Cel mai important,
concentraia de glucoz n plasm postural a rmas normal dup un an fr msurtori FPG mai mici
de 70 mg / dl (Figura 7A7A). Efectul sinergie al cocktail-ului CNIP de a induce formarea de celule beta
pancreatice a fost documentat de eecul fiecrei componente individuale a cocktail-ului CNIP de a
induce proliferarea celulelor beta, aa cum s-a demonstrat prin cuantificarea BrdU i eecul de a crete
masa celulelor beta (Fig.5C5C i Fig.5D5D). Dou molecule din cocktail-ul CNIP (glucokinaz plus PTR1B
shRNA) au indus o proliferare a celulelor beta i o cretere a masei beta-celule comparativ cu grupul
martor (fig.5C5C i 5D5D), dar creterea a fost mult mai mic dect n cocktail-ul complet CNIP grup.
Doar cocteilul CNIP a avut un efect de cretere a insulinei plasmatice de repaus alimentar i de scdere a
concentraiilor plasmatice de glucoz n plasm (datele nu sunt prezentate).