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RESUMO 1 INTRODUO
A PFO (EC 1.10.3.2) extrada de polpa de pinha madura (Annona As enzimas polifenoloxidases (PFO) so amplamente
squamosa L.), foi parcialmente purificada por fracionamento em
sulfato de amnio a 80% e purificada 411 (Frao I) e 118 (Fra-
distribudas na natureza, sendo primeiramente relacio-
o II) vezes aps cromatografia em coluna de troca inica em nadas com o escurecimento enzimtico dos vegetais in
DEAE-Toyopearl 650M, e 566 vezes em coluna de Toyopearl HW55F. natura, ocasionando perda da cor dos produtos de fru-
A enzima da frao mais ativa foi caracterizada bioquimicamente. tas e hortalias processados e ou congelados, diminui-
Quanto aos parmetros cinticos, a enzima apresentou valores o do valor nutricional, modificando as propriedades
de Km e Vmax de 7,14mM e 302,0 unidades/min/ml para catecol e organolticas, resultando na maioria dos casos em pro-
25,0mM e 180,2 unidades/min/ml para L-dopa respectivamente,
dutos com aparncia ruim, os quais so rejeitados pe-
substratos que demonstraram maior especificidade. O peso molecular
foi estimado em 90.700 daltons atravs de filtrao em gel Sephadex
los consumidores [4]. Por outro lado, a PFO tem papel
G-200. O teor de cobre da enzima purificada encontrado foi de importante no desenvolvimento do sabor e cor dos ali-
11ppm/peso da amostra liofilizada. Quanto composio de mentos como por exemplo do ch preto, diminuio do
aminocidos, a PFO apresentou maiores teores de cido asprtico, amargor e adstringncia dos produtos do cacau e for-
cido glutmico e lisina e menores teores de metionina, arginina mao de aldedos de aminocidos [26, 29, 38].
e tirosina, com ausncia de cistena.
A pinha ( Annona squamosa L.), originria da
Palavras-chave: purificao; polifenoloxidase; pinha; Annona Amrica Tropical sendo seu fruto um sincarpo arredon-
squamosa L. dado, ovide, esfrico ou cordiforme, com 5 a 10cm de
dimetro, formado por carpelos muito proeminentes na
SUMMARY maioria dos cultivares, coberto externamente de sali-
PURIFICATION OF POLYPHENOLOXIDASE (PPO) FROM RIPE ncias achatadas em forma de tubrculos e regular-
CUSTARD APPLE (Annona squamosa L.) PULP. The PPO (EC mente dispostos [3, 10, 17]. tambm denominada de
1.10.3.2) extract of ripe custard apple (Annona squamosa L.) ata e fruta-do-conde [3] e em ingls conhecida como
pulps, was partially purified by ammonium sulphate fractionation custard apple e sugar apple, apresenta polpa bran-
and purified 411 (Fraction I) and 118 (Fraction II) fold in an ion ca ou amarela, com aroma agradvel, muito doce, o
exchange column of DEAE-Toyopearl 650M, and 566 fold in a
que a torna importante para o consumo da fruta fresca
gel column of Toyopearl HW 55F. The enzyme of the most active
fraction was characterized biochemically. The partially purified e para a industrializao, sendo apropriada para elabo-
and purified enzyme used the o-diphenols as substrates and no rao de bebidas fermentadas e muito aceita na fabri-
activity towards monophenols was detected. With respect to the cao de sorvetes. Os plantios mais organizados de
kinetic parameters, the purified enzyme presented values for Km pinha esto localizados atualmente, no oeste do Esta-
and Vmax of 7.14 mM and 302.0 units/min/ml for catechol and do de So Paulo, interior da Bahia, Pernambuco e Ala-
25.0 mM and 180.2 units/min/ml for L-dopa respectively, substrates goas. De acordo com KAVATI [17], a situao atual de
which show greater specificity. The molecular weight was estimated
produo desta fruta no Brasil a coloca como a princi-
as 90.700 daltons using gel filtration on Sephadex G-200. In the
analysis of copper, the purified enzyme gave a value of 11ppm pal da famlia. Apesar da crescente demanda pela pi-
by weight of the liofilized sample. The amino acid composition nha, tanto para consumo in natura quanto para a in-
of the custard apple fruit PPO, presented greater amounts of dstria, existe escassez de conhecimentos sobre sua
aspartic acid, glutamic acid and lysine and smaller amounts of composio qumica, caracterizao bioqumica e fi-
methionine, arginine and tyrosine, with an absence of cysteine. siologia de ps-colheita. LIAO et al [21] apresentaram-
na como um fruto climatrico, cuja maturao em con-
Keywords: purification; polyphenoloxidase; custard apple; Annona
dies ambientais (20-25C) e 80% de umidade relati-
squamosa L.
va se processa de forma muito rpida, de 3-5 dias aps
1
Recebido para publicao em 08/11/00. Aceito para publicao a colheita, ocorrendo mudanas de textura e aroma,
em 26/03/01. com conseqente perda de aspecto e qualidade. O cri-
1
Parte do trabalho de Tese de Doutorado em Cincias de Alimen- trio utilizado para colheita do fruto da pinha o afas-
tos-UNICAMP tamento dos carpelos e colorao verde-amarelada dos
2
Laboratrio de Tecnologia de Alimentos-DSER-CCA-UFPb. E- tecidos intercarpelares.
mail: epozzob@zaz.com.br
3
Laboratrio de Bioqumica- Dept. de Cincias de Alimentos - H um grande mercado potencial para exportao
FEA - UNICAMP - Caixa Postal 6121, CEP 13081-970, Baro da pinha in natura, porm um dos obstculos a ser vencido
Geraldo, Campinas, SP, Brasil. a facilidade de escurecimento enzimtico que a fruta
* A quem a correspondncia deve ser enviada. apresenta, sendo este catalisado pela enzima
polifenoloxidase (PFO), que por sua habilidade em uti-
40
1
0,8
nm
30
Absorbncia(280nm)
Unidades de PPO/min/ml
Absorbncia 280
Atividade de PPO
0,6
20
0,4
10
NaCl 0,1M NaCl 0,2M NaCl 0,3M NaCl 0,5M
0,2
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
albumina bovina (67.000 Da), ovoalbumina (43.000 Da), anidrase
Nmero de fraes
carbnica (30.000 Da), inibidor de tripsina (20.100 Da) e a
lactoalbumina (14.400 Da). 1- PPO (Frao I) DEAE Toyopearl
FIGURA 1. Cromatografia da PFO de polpa de pinha madura 650M; 2- PPO (Frao II) DEAE-Toyopearl 650M; 3- PPO
em coluna de DEAEToyopearl 650M. Toyopearl HW 55F.
As fraes ativas reunidas obtidas na Frao-I em A Tabela 1 apresenta o sumrio dos processos uti-
coluna de DEAE-Toyopearl 650M foram aplicadas na lizados na purificao da PFO de polpa de pinha ma-
coluna de Toyopearl HW 55F, apresentando o perfil dura.
cromatogrfico mostrado na Figura 2. A atividade da
enzima foi obtida em um nico pico, e as fraes coletadas
TABELA 1. Purificao da enzima PFO
aps separaes em vrias colunas foram reunidas e
denominadas de enzima purificada. Etapas Volume Atividade Protena Atividade Fator de Recu-
(mL) total total especfica purificao perao
1 6 (U/min/mL) (mg/mL) (U/mg prot.) (%)
(x103) (x103)
Absorbncia (280nm)
5 Extrato bruto 850 16481,5 2133,5 7,73 1 100
0,8 Atividade de PPO
Unidades de PPO/min/ml
Aborbncia 280nm
Precipitado com
4 (NH4)2SO4 e
0,6 dialisado 200 10256,0 420,0 24,4 3,2 62,2
3 Cromatografia em
coluna DEAE-
0,4
Toyopearl 650M
2 (Frao I) 40 634,8 0,2 3174,0 411 3,85
1/V
55F, quando corou-se o gel em Coomassie brilliant blue 4
G-250, demonstrado por LIMA [22]. 2