Microbiota de la osteomielitis en el pie diabtico

S. A. V. van Asten1,2 & J. La Fontaine1 & E. J. G. Peters2 & K. Bhavan3 & P. J. Kim4 & L. A.
Lavery1

Resumen El objetivo de esta investigacin fue evaluar la diversidad de bacterias en la osteomielitis del pie
diabtico utilizando un mtodo de secuenciacin de ARNr 16S y comparar los resultados con tcnicas de
cultivo convencionales. En este estudio prospectivo observacional, se obtuvieron 34 muestras seas de
pacientes ingresados en nuestro hospital con una infeccin moderada a severa de pie diabtico. Se analiz la
distribucin de la 16S rRNA secuencias de genes en las muestras de hueso, utilizando un Illumina MiSeq
Personal Sequencer. Se compararon los gneros que se detectaron con los patgenos cultivados en las
muestras de hueso con tcnicas convencionales. En las 23 muestras que presentaron resultados positivos con
ambas tcnicas, Staphylococcus, Corynebacterium, Streptococcus y Propionibacterium spp. Fueron detectados
en 20, 18, 13 y 11 muestras, respectivamente. Se detectaron significativamente ms anaerobios con la
secuenciacin 16S rRNA en comparacin con las tcnicas convencionales (86.9% vs. 23.1%, p = 0.001) y
ms bacilos Gram positivos (78.3% vs. 3.8%, p <0.001). Los Staphylococcus spp. se identificaron en todas las
muestras de hueso secuenciadas que eran negativas con tcnicas convencionales. Los gneros mixtos estaban
presentes en el 83,3% (5 de 6) de las muestras negativas. Los organismos anaerobios e importunos pueden
desempear un papel ms significativo en la osteomielitis de lo que se inform anteriormente. Se necesitan
ms estudios con poblaciones ms grandes para comprender completamente la importancia clnica de la
diversidad microbiana de la osteomielitis del pie diabtico.

Abreviaturas

DFI Infeccin del pie diabtico

DFO Osteomielitis del pie diabtico
IDSA Sociedad de Enfermedades Infecciosas de Amrica
NCBI Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica OTU Unidades taxonmicas operacionales
ARN cido ribonucleico

Introduccin

La osteomielitis del pie diabtico (DFO) se desarrolla aproximadamente en el 44-68% de los pacientes con
diabetes mellitus ingresados en el hospital con una infeccin del pie diabtico (DFI) [1] y es la principal causa
de amputacin entre estos pacientes [2]. El espectro microbiolgico del DFO parece ser similar a las
infecciones de los tejidos blandos profundos del pie diabtico [3] y consiste principalmente en bacterias
Gram-positivas, especialmente Staphylococcus aureus y estreptococos beta hemolticos [4, 5]. Los patgenos
anaerbicos son generalmente infrecuentes, con algunos estudios que informan que slo 3-14% de las
infecciones involucran anaerobios [6]. Estudios ms recientes indican que el 46-85% de los DFO son
monomicrobianos [7, 8]. Sin embargo, las tcnicas convencionales de cultivo se centran en organismos
fcilmente cultivados utilizando evaluaciones microbiolgicas tradicionales y estn limitados por el tiempo
requerido para que los organismos crezcan [9]. El fenmeno de que slo un pequeo porcentaje de
microorganismos crecen en placas de agar se conoce como la "gran anomala de cuenta de placas" desde
principios del siglo XX [10]. Poco se sabe acerca de la diversidad de bacterias en el DFO y la contribucin de
organismos anaerbicos y molestos en estas infecciones [11]. Este estudio tuvo como objetivo caracterizar
mejor la ecologa bacteriana del DFO usando un mtodo moderno de secuenciacin del gen ribosomal 16S
(rRNA).
Materiales y Mtodos

Poblacin de Pacientes

Obtuvimos consecutivamente 34 muestras seas de pacientes ingresados en nuestro hospital con DFI
moderado-grave de acuerdo con la clasificacin de infeccin del pie diabtico de la Sociedad de
Enfermedades Infecciosas de Amrica (IDSA) [12]. Se incluyeron pacientes que tenan 21 aos de edad o ms
y tenan alta sospecha de DPO sobre la base de su clasificacin IDSA. Los criterios de exclusin incluyeron
otras enfermedades infecciosas, DFO activo, previamente diagnosticado, terapia inmunosupresora, neoplasias
malignas de rganos y / o hematolgicas y enfermedad renal terminal que requiere dilisis. Se realiz una
biopsia percutnea utilizando una aguja de Jamshidi calibre 16 introducida por lo menos a 2 cm del sitio de la
lcera [6] (n = 7) o se obtuvieron muestras seas intraoperatorias de los pacientes que requirieron
desbridamiento quirrgico o amputacin (n = 27). Enviamos las muestras seas obtenidas al laboratorio para
el cultivo convencional y las pruebas histopatolgicas. Utilizamos el protocolo establecido por nuestro
laboratorio de microbiologa para el muestreo anaerbico y el transporte. Las muestras de hueso se colocaron
en vasos estriles sin ningn medio de transporte y se procesaron en el plazo de 1 h de recogida. Los tcnicos
de laboratorio no tenan conocimiento de los datos clnicos. Almacenamos una parte de las muestras obtenidas
rpidamente a -80 C hasta el final del estudio. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los
participantes individuales incluidos en el estudio.

Secuenciacin de genes 16S rRNA

Despus de la descongelacin, se recuperaron porciones de las muestras de hueso con pinzas estriles. Se
extrajo el ADN genmico utilizando el Kit Roche High Pure PCR de preparacin de plantillas (Roche Life
Sciences, Indianapolis, IN, EE.UU.) con un paso de lisis modificado. Se lisaron nuestras muestras
combinando 25 mg de muestra, 200 l de tampn de lisis y tampn de unin (kit amortiguadores 1 y 2), 500
l de perlas de xido de zirconio y un solo reborde de acero de 5 mm en una tapa roscada de 200 l .
Sacudimos los tubos usando un TissueLyser II (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EE.UU.) durante 5 min a 30 Hz.
Continuamos la extraccin siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilizamos el Illumina MiSeq Personal
Sequencer (Illumina, Inc., San Diego, CA, EE.UU.) en colaboracin con PathoGenius Laboratories
(PathoGenius, Lubbock, TX, EUA) para evaluar la distribucin de las secuencias de genes 16S rRNA. Se
amplificaron las muestras para la secuenciacin utilizando un iniciador de fusin hacia adelante y hacia atrs.
El cebador directo construy con el adaptador (5'-3 ') Illumina i5, un cdigo de barras de 8-10 pb, una capa de
cebador y el cebador 28F. El cebador de fusin inversa se construy con el adaptador (5'-3 ') illumina i7, un
cdigo de barras de 8-10 pb, un cebador y el cebador 519R. Utilizamos el kit de mezcla principal de
HotStarTaq Plus (Qiagen, Inc., Valencia, CA, EUA) para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) bajo
las siguientes condiciones: 94C durante 3 min; seguido de 30 ciclos de 94C durante 30 s, 60C durante 40 s
y 72C durante 1 min; y un paso final de elongacin a 72 C durante 5 min.

En la preparacin de la secuenciacin 16S, se redujo el ADN para eliminar secuencias cortas, secuencias
nicas y lecturas ruidosas [13]. Con las malas lecturas eliminadas, se realiz la deteccin de quimeras
utilizando el mtodo de novo construido en UCHIME [14] para ayudar en la eliminacin de secuencias
quimricas [15]. Corregimos las secuencias restantes base por base para ayudar a eliminar el ruido dentro de
cada secuencia. Hemos comprobado y demultiplexado las lecturas reducidas y de quimeras generadas durante
la secuenciacin. A continuacin, agrupados estas secuencias en unidades taxonmicas operativas (OTU)
utilizando el algoritmo UPARSE [16]. Hicimos la secuencia de centroides de cada grupo contra una base de
datos de secuencias de alta calidad derivada de la base de datos del Centro Nacional de Informacin sobre
Biotecnologa (NCBI), marzo de 2015. Utilizamos un programa Python desarrollado internamente que asigna
informacin taxonmica a cada secuencia para analizar la salida y escribir los archivos de anlisis final.
Anlisis estadstico

El anlisis se realiz utilizando el paquete estadstico SAS 9.4. Los datos se presentaron como el nmero de
pacientes (%). Las diferencias entre ambas tcnicas de cultivo se midieron usando la prueba de McNemar. Los
valores de p <0,05 se consideraron estadsticamente significativos.

Resultados

De las 26 muestras de hueso en las que crecieron patgenos con tcnicas de cultivo convencionales, tres no se
secuenciaron. En las tres muestras que no se secuenciaron crecieron Stenotrophomonas maltophilia (n = 1), S.
aureus (n = 1) y Enterobacter cloacae (n = 1) con cultivo convencional. Las tres muestras eran infecciones
monomicrobianas. La tabla 1 presenta una visin general de todos los gneros que se secuenciaron y se
produjeron en al menos el 21,7% (5 de 23) de las muestras de hueso positivo. La tabla incluye la contribucin
promedio de cada gnero a la poblacin bacteriana total en esas muestras representadas como un porcentaje.
Los Staphylococcus spp. fueron el gnero predominante identificado en las muestras de hueso positivo. Las
Secuencias de Staphylococcus spp. se detectaron en 20 de las 23 muestras, con una contribucin media del
28,6% a la poblacin bacteriana total. Las poblaciones ms prevalentes de cocos Gram-positivos identificados
despus fueron, por orden, Corynebacterium (n = 18), Streptococcus (n = 13) y Propionibacterium spp. (N =
11). Los anaerobios facultativos incluyeron Actinomyces y Helcococcus spp. en las muestras 5 y 6,
respectivamente. Se detectaron anaerobios obligatorios como Peptoniphilus, Finegoldia, Anaerococcus,
Clostridium, Porphyromonas y Prevotella en las muestras 17, 15, 12, 9, 7 y 5, respectivamente. Dos de las
muestras positivas fueron muestras de baja cobertura (recuentos de secuencia de 9 y 534, respectivamente).
Ambas muestras de baja cobertura slo tenan secuencias que coincidan con Staphylococcus spp. y crecieron
estafilococos coagulasa-negativos con tcnicas convencionales.

La Tabla 2 presenta una comparacin de los resultados de ambas tcnicas de cultivo. Solamente los gneros
que resultaron en por lo menos 21.7% (5 de 23) de las muestras positivas del hueso con el mtodo de
secuenciacin se divulgaron. Con la secuenciacin del 16S rRNA, encontramos significativamente ms
patgenos anaerbicos (86.9% vs. 23.1%, p = 0.001), significativamente ms bacilos Gram positivos (78.3%
vs. 3.8%, p <0.001) y ms infecciones polimicrobianas (91.3% vs , 64,0%, p = 0,125). Adems, se observ
una mayor diversidad bacteriana tanto en los cocos Gram-positivos como en los anaerobios.

No se identificaron patgenos en las muestras seas del 8 al 34 (23,5%) con tcnicas convencionales de
cultivo.

Dos de las ocho muestras negativas tampoco se secuenciaron. Los gneros que se secuenciaron en los seis
restantes y se produjeron en al menos el 33,3% (2 de 6) de las muestras se presentan en la Tabla 3. Los
Staphylococcus spp. fueron detectados en todas las muestras negativas, con una contribucin promedio del
21,8% a la poblacin bacteriana total. Una de las muestras negativas fue una muestra de cobertura muy baja
(conteo de secuencia 3); Las tres secuencias coinciden con el Staphylococcus spp. derivadas de la base de
datos NCBI. Esta fue la nica muestra de hueso negativo que tuvo un solo gnero presente.

Conclusiones

El gnero primario detectado en las muestras seas del presente estudio fue el Staphylococcus spp., tanto con
tcnicas de cultivo convencionales como con la secuenciacin del gen 16S (rRNA). No slo se lo detect en el
89,6% (26 de 29) de las muestras secuenciadas, sino su contribucin media en la poblacin bacteriana total
fue la ms alta en todos los gneros. Este no es un resultado sorprendente, ya que casi todos los estudios
publicados en la literatura norteamericana y europea identifican al Staphylococcus aureus como el patgeno
ms comn cultivado en la osteomielitis del pie diabtico (DFO), seguido del S. epidermidis.

La Corynebacterium spp. fue la poblacin ms prevalente despus de Staphylococcus spp. sin embargo, la
contribucin media de este gnero a la poblacin bacteriana total parece ser mucho menor. Este organismo
molesto se ha asociado a DFO en estudios anteriores que utilizaron mtodos tradicionales del cultivo [17, 18].
En un estudio reciente realizado por Dowd et al., el corynebacterium spp. fue incluso identificado como el
gnero predominante en las microbiotas individuales de 40 lceras de pie diabtico utilizando un enfoque de
secuenciacin similar. El Staphylococcus spp. slo se detect en 13 de las 40 muestras de desbridamiento. Sin
embargo, el papel patgeno del Corynebacterium spp. en las infecciones no se entiende bien y el gnero se
considera generalmente un contaminante.

Debido a que el DFO no est tpicamente expuesto al aire, especialmente si la enfermedad arterial perifrica
est presente, los anaerobios pueden desempear un papel ms grande de lo esperado. Como se ha informado
anteriormente en estudios utilizando pirosecuenciacin para caracterizar la diversidad bacteriana en la
osteomielitis crnica de la mandbula [19], la osteomielitis no fue causada por un solo patgeno sino por
diversas bacterias que comprenden tanto las especies aerobias y aerobias, incluyendo las bacterias
incultivables con mtodos de cultivo convencionales. Slo 3 de nuestras 29 muestras de hueso secuenciadas
tenan un solo gnero de bacterias presentes, y las tres de estas muestras tenan conteos de secuencia bajos,
por lo que pudieron haber sido contaminantes. Nuestros resultados muestran que, mediante el uso de una
tcnica de secuenciacin 16S rRNA, se detectaron anaerobios en el 86,9% de las muestras seas positivas (vs.
23,1% con tcnicas convencionales). El nmero de anaerobios parece ser en gran medida dependiente del
mtodo de cultivo. En estudios realizados por Senneville et al. [6] y Ertugrul et al., los anaerobios obligados
fueron identificados en slo el 3% y el 5% de los pacientes, respectivamente, despus de optimizar los
mtodos de cultivo.

Todos los pacientes incluidos en el estudio fueron ingresados en nuestro hospital con infecciones moderadas /
graves, los cuales requeran antibiticos y ciruga urgentemente teniendo en cuenta las pautas de tratamiento
de la IDSA. Por lo tanto, una limitacin del diseo de nuestro estudio es la alta probabilidad de pre-prueba de
osteomielitis y el nmero relativamente pequeo de sujetos negativos. Adems, no tuvimos un perodo de
"lavado" sin tratamiento con antibiticos antes de obtener los cultivos seos. Aunque esta convencin se
discute en la literatura mdica, no hay evidencia directa de que afecte los resultados de cualquiera de las
tcnicas de cultivo. Sin embargo, la terapia antibitica previa pudo haber favorecido los resultados de la
secuenciacin de ARNr 16S, ya que los patgenos no tenan que ser viables para ser detectados.
El uso de tecnologa molecular biolgica avanzada es de particular inters en el DFO, donde la cronicidad de
la infeccin y la adhesin de bacterias en un fenotipo ssil pueden dificultar el cultivo de estos patgenos. La
diversidad de la poblacin bacteriana puede contribuir a las pobres tasas de xito del tratamiento mdico de
DFO [22 - 24]. Los estudios informan de cursos prolongados de tratamiento con antibiticos en casos no
quirrgicos que van desde 42 a 90 das, hasta 40 semanas, as como una variacin considerable en el xito
(57-70%). Se ha informado que el tratamiento antibitico especfico basado en un cultivo, proporciona una
mayor tasa de xito del tratamiento en comparacin con la terapia emprica. Una mejor comprensin de la
diversidad bacteriana en el DFO proporcionar nuevas ideas para redirigir la terapia y podra mejorar los
resultados clnicos en el futuro.
















picion of within each sequence. We quality checked and demultiplexed
n criteria the denoised and chimera-checked reads generated during se-
ly diag- quencing. We then clustered these sequences into operational
therapy, taxonomic units (OTUs) using the UPARSE algorithm [16].
stage re- We ran the centroid sequence from each cluster against a
utaneous Tabla 1 Gneros bacterianos identificados con secuenciacin de cido ribonucleico ribosomal
d at least 16S (ARNr) en 23 muestras seas positivas
Table 1 Bacterial genera identified with 16S ribosomal ribonucleic
raopera- acid (rRNA) sequencing in 23 positive bone samples
gical de- Genera* Samples Avg % SD Minmax %
ned bone
and his- No hit 22 15.6 26.1 0.0387.1
biology Staphylococcus spp. 20 28.6 34.6 0.1798.8
ling and Corynebacterium spp. 18 7.0 10.7 0.0133.8
ile cups Peptoniphilus spp. 17 2.3 3.1 0.0111.7
n 1 h of Unknown Firmicutes 16 13.1 19.5 0.0255.6
re of the Finegoldia spp. 15 8.1 11.8 0.1744.6
prompt- Unknown Clostridiales 14 3.3 8.4 0.0232.1
sent was Streptococcus spp. 13 20.1 19.5 0.0357.9
he study. Anaerococcus spp. 12 8.2 8.7 0.0627.6
Propionibacterium spp. 11 0.9 1.7 0.0025.0
Clostridium spp. 9 0.9 1.1 0.0083.3
Unknown Dermabacteriae 8 0.1 0.1 0.030.3
samples Unclassified Clostridiales 8 1.1 1.6 0.0083.9
sing the Unknown Clostridia 8 2.0 2.1 0.036.8
che Life Porphyromonas spp. 7 1.8 1.7 0.034.8
ysis step. Unclassified Clostridia 7 1.3 1.5 0.0043.6
, 200 L Unknown bacteria 7 2.2 5.1 0.0113.8
1 and 2), Actinomyces spp. 6 1.0 1.8 0.0034.7
mm steel Enterobacter spp. 6 6.0 11.3 0.1028.8
es using Prevotella spp. 5 3.2 5.5 0.0413.0
or 5 min Helcococcus spp. 5 1.2 1.5 0.053.8
manufac- Pseudomonas spp. 5 20.8 42.8 3.9052.6
onal Se-
ollabora- *Genera sequenced that occurred in at least 21.7 % (5 of 23) of the
Lubbock, * positive
Gneros bone samples. que
secuenciados Theocurrieron
genera areen
sorted by the
al menos en number ofa bone
el 21%(5 23) de las muestras positivas de hueso. Los gneros se
clasifican por el nmero de muestras de hueso en el que se detectaron
samples in which they were detected
gene se- Promedio porcentual medio de cada gnero contribuy a sus muestras positivas; Desviacin estndar SD de los porcentajes;
Avg % average percentage each genus contributed to its positive samples;
using a Mn-mx rango de los porcentajes; Ninguna secuencia de acierto no coincide con las secuencias de la base de datos NCBI
SD standard deviation of the percentages; Minmax % range of the per-
d primer centages; No hit sequence has no match with the sequences in the NCBI
r, an 8 database













 maltophilia (n=1), S. aureus (n=1) and Enterobacter cloacae
(n=1) with conventional culturing. All three samples were
Statistical analysis monomicrobial infections. Table 1 presents an overview of
all the genera that were sequenced and occurred in at least
Analysis was performed using the SAS 9.4 statistical package. 21.7 % (5 of 23) of the positive bone samples. The table
The data were presented as number of patients (%). Differ- includes the average contribution of each genus to the total
ences between both culture techniques were measured using bacterial population in those samples as represented as a per-
Tabla 2 Gneros bacterianos en la osteomielitis del pie diabtico (DFO) con las dos tcnicas de
the McNemars test. p-Values <0.05 were considered statisti- centage. Staphylococcus spp. were the predominant genus
cultivo
cally significant. identified in the positive bone samples. Sequences of

Table 2 Bacterial genera in diabetic foot osteomyelitis (DFO) with the two culturing techniques

Conventional culture techniques 16S rRNA sequencing*

Pathogens Overall (%), total number Pathogens Overall (%) total number
of patients=26 of patients,=23
Gram-positive cocci 20 (76.9) Gram-positive cocci 23 (100.0)
S. aureus, total 13 (50.0) Staphylococcus spp. 20 (86.9)
S. aureus resistant to methicillin 3 (11.5) S. aureus resistant to methicillin Not tested
Coagulase-negative staphylococci 11 (42.3) Coagulase-negative staphylococci Not tested
Streptococcus spp. 6 (23.1) Streptococcus spp. 13 (56.5)
Enterococcus spp. 2 (7.7) Enterococcus spp. 0
Unknown Dermabacteriae 8 (34.8)
Gram-positive bacilli 1 (3.8) Gram-positive bacilli 18 (78.3)
Corynebacterium spp. 1 (3.8) Corynebacterium spp. 18 (78.3)
Gram-negative bacilli 13 (50.0) Gram-negative bacilli 10 (43.5)
P. aeruginosa 4 (15.4) Pseudomonas spp. 5 (21.7)
S. maltophilia 1 (3.8) S. maltophilia 0
Proteus spp. 1 (3.8) Proteus spp. 0
Enterobacter spp. 6 (26.1)
Anaerobes 6 (23.1) Anaerobes 20 (86.9)
Facultative anaerobes 3 (11.5) Facultative anaerobes 17 (73.9)
Propionibacterium spp. 11 (47.8)
Actinomyces spp. 6 (26.1)
Helcococcus spp. 5 (21.7)
Obligate anaerobes 3 (11.5) Obligate anaerobes 20 (86.9)
Peptoniphilus spp. 17 (73.9)
Finegoldia spp. 15 (65.2)
Anaerococcus spp. 12 (52.2)
Porphyromonas spp. 7 (30.4)
Prevotella spp. 5 (21.7)
Unknown Firmicutes 16 (69.6)
Unknown/unclassified Clostridia 15 (65.2)
Unknown/unclassified Clostridiales 22 (95.7)
Clostridium spp. 9 (39.1)
Polymicrobial infections 16 (64.0) Polymicrobial infections 21 (91.3)
Unknown bacteria NA Unknown bacteria 7 (30.4)

*Genera sequenced that occurred in at least 21.7 % (5 of 23) of the positive bone samples. Data are number of patients (%)
Gneros secuenciados que ocurrieron en al menos 21,7% (5 de 23) de las muestras seas positivas. Los datos son
el nmero de pacientes (%)











diversity was seen both in the Gram-positive cocci and the tifies Staphylococcus aureus as
anaerobes. cultured in diabetic foot osteom
No pathogens were identified in 8 out of the 34 bone S. epidermidis [1].
samples (23.5 %) with conventional culture techniques. The Corynebacterium spp. w
ulation after Staphylococcus s
Tabla 3 Gneros bacterianos identificados con muestras de hueso negativo 16S rRNA
Table 3 Bacterial genera identified with 16S rRNA sequencing in six
secuenciacin en seis contribution of this genus to th
negative bone samples appears to be much lower. Th
been associated with DFO in
Genera* Samples Avg % SD Minmax %
traditional culturing methods [
Staphylococcus spp. 6 21.8 39.3 0.05100.0 by Dowd et al. [11], the Coryn
No hit 4 49.9 40.8 5.0797.9 identified as the predominant g
Corynebacterium spp. 3 3.8 1.6 1.995.0 ogies of 40 diabetic foot ulcers
Propionibacterium spp. 3 5.9 9.5 0.3516.8 approach. The Staphylococcus
Streptococcus spp. 3 12.2 15.3 1.3729.7 13 of the 40 debridement sam
Anaerococcus spp 3 4.4 5.6 1.1210.9 genic role of Corynebacterium
Finegoldia spp. 3 6.8 3.2 3.148.9 well understood and the genu
Peptoniphilus spp. 3 1.9 1.4 1.023.5 contaminant.
Unknown Firmicutes 3 7.2 9.1 0.0317.4 Because DFO is not typicall
Enterobacter spp. 3 0.2 0.2 0.020.5 if peripheral arterial disease
Unknown Microbacteriaceae 2 7.6 10.4 0.2715.0 play a bigger role than expecte
Unknown Enterobacter 2 0.4 0.5 0.020.7 reported in studies using pyro
Pseudomonas spp. 2 18.4 26.0 0.0436.8 bacterial diversity in chronic
Unknown bacteria 2 0.4 0.3 0.200.7
[19], osteomyelitis was not ca
but by diverse bacteria compr
*Genera sequenced that occurred in at least 33.3 % (2 of 6) of the negative aerobic species, including uncu
* bone
Gneros secuenciados que ocurrieron en al menos 33.3 %(2 de 7) de las muestras de hueso. Los gneros se clasifican por el
samples. The genera are sorted by the number of bone samples in
nmero de muestras de hueso en el que se detectaron ventional culturing methods.
which they were detected
Promedio porcentual medio de cada gnero contribuy a sus muestras positivas; Desviacin estndar SD de los porcentajes;
quenced bone samples had a si
Mn-mx% rango de los porcentajes; Ninguna secuencia de xito no tiene coincidencia con las secuencias en la base de datos de
Avg % average percentage each genus contributed to its positive samples;
la NCBI (2 de 6)
SD standard deviation of the percentages; Minmax % range of the per-
ent, and all three of these sa
centages; No hit sequence has no match with the sequences in the NCBI counts, so they may have been
database show that, by using a 16S rR